動物RNA病毒VLPs疫苗的研究進展

郭春紅，李金斗，丁佳欣，丁 壯*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林元和元生物工程有限公司，吉林 長春 130000)

RNA病毒是一類遺傳物質(zhì)由RNA組成的病毒，基因組及轉(zhuǎn)錄復(fù)制極具多樣性。根據(jù)病毒基因組的類型可以將RNA病毒分為單鏈RNA病毒(ssRNA,single-stranded RNA)和雙鏈RNA病毒(dsRNA,double-stranded RNA)。單鏈RNA病毒被分為單股正鏈RNA病毒和單股負鏈RNA病毒[1]。在自然界中RNA病毒的數(shù)量極其龐大，參照國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)頒布的最新的病毒種類名單，dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒和(-)ssRNA病毒分別涉及11,61,37個病毒科。RNA病毒感染可引起人類、動物以及植物的多種嚴重疾病。目前,在人類感染RNA病毒公共衛(wèi)生事件中，彰顯實力的冠狀病毒，多次肆虐全球，如2002年冬至2003年春流行的重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respirator syndrome coronavirus,SARS-CoV)、2012年流行的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)以及2019年冬至今流行的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)[1-2]。在動物養(yǎng)殖業(yè)中RNA病毒也產(chǎn)生巨大威脅，例如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)等。FMDV傳播速度快、防治困難，暴發(fā)后只能采取屠宰和焚滅感染牲畜，是畜牧業(yè)的“頭號殺手”。AIV在全球各地廣泛流行，其中H9N2型禽流感的暴發(fā)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，乃至當(dāng)今為家禽養(yǎng)場中常在病原。H5N1型、H7N9型AIV致病力強、傳播速度快，人和家禽均易感，發(fā)病率及病死率高，是全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點[3]。眾多RNA病毒引起的動物疫病，目前尚無特效治療性藥物。近年RNA病毒疫苗的研究不斷深入，目前已經(jīng)有多種RNA病毒疫苗進入到病毒樣顆粒時代。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒高度相似，不含病毒核酸，具有與完整病毒粒子相似的免疫原性，可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，許多抗原可通過基因工程的方法在VLPs表面展示，進而構(gòu)建多聯(lián)多價VLPs疫苗。這種非感染性顆?？梢宰孕薪M裝，可利用基因工程手段在實驗室大規(guī)模生產(chǎn)。結(jié)構(gòu)的高度穩(wěn)定性、重復(fù)性和均一性使VLPs被廣泛應(yīng)用于各種生物領(lǐng)域。

1 RNA病毒結(jié)構(gòu)與功能的特點

RNA病毒的中心是核糖核酸(RNA)，基因組RNA攜帶的遺傳信息決定著病毒的遺傳和變異特征，病毒核酸的排列形式也是病毒分類的重要依據(jù)。RNA基因組外被有規(guī)律排列的蛋白亞基包裹，被稱為衣殼(capsid)，構(gòu)成衣殼蛋白亞單位被稱為殼粒(capsomer)，其形態(tài)也是病毒分類或病毒鑒定的重要依據(jù)。衣殼具有多種功能：即保護病毒核酸，使其免受核酸酶或其他理化因素的降解；參與病毒感染細胞的過程，決定病毒對宿主細胞的嗜性；具有抗原性，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)等，通常也是新型疫苗的研發(fā)靶點。病毒的衣殼蛋白和RNA可組裝成為核衣殼(nucleocapsid)。根據(jù)殼粒的排列方式，核衣殼被分為3種模式：二十面體對稱模式，如脊髓灰質(zhì)炎病毒；螺旋對稱模式，如正黏病毒和副黏病毒等；復(fù)合對稱模式，如痘病毒。復(fù)雜的病毒外層還包含由脂質(zhì)和糖蛋白構(gòu)成的包膜(envelope)及刺突(spike)等結(jié)構(gòu)。刺突具有多種生物活性，是啟動病毒感染(吸附、穿入)所必需的，同時也含有主要的保護性抗原，是疫苗研發(fā)的主要靶點之一。病毒的包膜具有維系病毒結(jié)構(gòu)、保護病毒衣殼的作用，可根據(jù)是否含有包膜將RNA病毒分為裸露病毒或囊膜病毒。裸露病毒和由含有核酸(DNA或RNA)與核衣殼蛋白(nucleocapsid protein)的核衣殼(nucleocapsid)粒子構(gòu)成。例如：豬圓環(huán)病毒(porcine circorivirus,PCV)，無囊膜、單鏈共價閉合環(huán)狀DNA病毒，基因組編碼11個開放閱讀框(ORF1～11)，ORF2編碼的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(capsidprotein,cap)，可形成VLPs，具有抗原保護性[4]；FMDV，無囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組編碼的4種結(jié)構(gòu)蛋白VPl、VP2、VP3、VP4聚集形成包裹病毒核酸的核衣殼[5]。囊膜病毒含有脂質(zhì)和糖蛋白構(gòu)成的包膜(envelope)。例如,AIV為有囊膜的單股負鏈的RNA病毒，囊膜內(nèi)為NP蛋白和聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)包裹形成的呈現(xiàn)螺旋狀的RNP復(fù)合物，囊膜外為發(fā)揮受體識別與結(jié)合的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)[6-7]。RNA病毒基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白在RNA病毒的生命周期中發(fā)揮重要作用，具體如下：抗原作用，主要決定病毒抗原性，也是VLPs疫苗等新型疫苗研發(fā)的主要靶點，例如NDV F或HN蛋白重要的宿主保護性抗原，與病毒的致病性和毒力密切相關(guān)，也是ND VLPs重要的組成部分；識別作用，可靶向含有特異性受體的靶細胞，例如SARS-CoV-2的S蛋白通過識別受體ACE2與宿主細胞結(jié)合[8]；包裝與保護作用，包裝病毒RNA并保護RNA免受核酸酶的降解；傳遞作用，釋放病毒基因組并將其傳遞至易感細胞等功能。

2 VLPs的分類

依據(jù)RNA病毒病原的結(jié)構(gòu)，可將VLPs分為3類，即無包膜VLPs、包膜VLPs及復(fù)雜VLPs。無包膜VLPs由一種或多種蛋白亞基自我組裝形成，無囊膜包被，無需特殊的細胞環(huán)境即可在體外完成裝配，例如輪狀病毒(RV)[9]、豬細小病毒(PPV)[10]等。包膜VLPs的最外層有脂質(zhì)包膜，包膜VLPs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)蛋白通過出芽過程離開細胞，并將衣殼包裹在部分細胞膜內(nèi)。包膜VLPs的靈活性更高，可用于整合來自同源或異源病原體的多種抗原。例如HIV-1 VLPs就屬于包膜VLPs，由Gag多蛋白聚合形成衣殼，衣殼外包膜來源于宿主的細胞膜[11]。新城疫VLPs[12]和禽流感VLPs[13]也是包膜VLPs典型代表。近年比較火熱的包膜新型“嵌合VLPs”，它們的結(jié)構(gòu)由病毒蛋白組成，而膜蛋白由第2種病毒衍生而來，例如以AIV H5N1的基質(zhì)蛋白M1為骨架，在其表面嵌合MERS-CoV的S蛋白，包裝成MERS-CoV嵌合型VLPs[14]。包膜蛋白可靶向作為特定組織受體的信號，可將衣殼蛋白與組分連接以遞送至靶組織，因此VLPs具有開發(fā)成為遞送系統(tǒng)的潛能。復(fù)雜的VLPs不具有包膜結(jié)構(gòu)，通常由多層的VLPs結(jié)構(gòu)組成，例如呼腸孤病毒科的輪狀病毒(RV)VLPs[15]、藍舌病毒(BTV)VLPs[16]，是多層VLPs的典型代表。

依據(jù)VLPs疫苗蛋白結(jié)構(gòu)可分為VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、耦聯(lián)VLPs疫苗。VLPs僅由親代病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成，例如由NDV結(jié)構(gòu)蛋白M、F和HN組裝而成的ND VLPs[17]。嵌合VLPs則是指VLPs以某種親本病毒衣殼蛋白為基礎(chǔ)，嵌合其他衣殼中的外源蛋白，例如將FMDV的中和B細胞表位(VP1(140～158))和T細胞表位(3A(21～35))插入致兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白而組裝形成嵌合VLPs，在小鼠和豬中誘導(dǎo)了強大的中和免疫反應(yīng)[18]。耦聯(lián)VLPs是指利用化學(xué)或物理的方法將外源目的蛋白與某一病毒的VLPs相偶聯(lián)而形成的VLPs。

3 VLPs疫苗包裝與嵌入策略

大多數(shù)無包膜VLPs可以由病毒衣殼蛋白自組裝，不含宿主成分。例如，戊型肝炎病毒(HEV)[19]、人乳頭瘤病毒(HPV)[20]可以形成無包膜的VLPs。包膜VLPs由衣殼蛋白和宿主細胞膜組成，包括來源于甲型流感病毒(H1N1)[21]、丙型肝炎病毒(HCV)[22]、新型冠狀病毒(CoV)[23]等。

3.1 VLPs內(nèi)的新型RNAi支架RNAi支架是一種通用的嵌合體，包含1個功能性RNA雙鏈體，具有成對的沉默和由miR-30莖環(huán)穩(wěn)定的載體序列。例如，噬菌體(bacteriophage)Qβ的RNA生產(chǎn)包裝在Qβ的方法，5′末端的Qβ發(fā)夾賦予了對Qβ外殼蛋白(CP)的親和力。沉默序列可以包括成熟的miRNAs和siRNAs，并且基本上可以靶向任何期望的mRNA。VLP-RNAi裝配在CP和RNAi的支架上共表達大腸桿菌[24]。

3.2 分子開關(guān)激活VLP組裝例如HIV-1 VLPs的裝配主要由Gag分子的衣殼(CA)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，核衣殼(NC)結(jié)構(gòu)域與核酸的結(jié)合會促進VLPs的組裝。SP1在VLPs組裝中的作用是CA和NC之間的“間隔物”。SP1的微小變化會嚴重破壞裝配，并且CA-SP1連接處周圍序列的肽在高濃度下處于螺旋形式，但在低濃度下會解除這種狀態(tài)。根據(jù)這種濃度依賴性的變化關(guān)系，設(shè)置亮氨酸拉鏈(SP1-Zip)結(jié)構(gòu)域可以作為一個分子開關(guān)來激活VLPs裝配的HIV-1糖胺聚糖，將Gag中的NC取代后依舊可以有效裝配VLPs[25]。

3.3 插入標簽蛋白組裝例如嵌合型口蹄疫苗VLPs，采用FLAG標簽蛋白插入衣殼蛋白GH-loop環(huán)，通過SP1-Zip大腸桿菌原核表達技術(shù)表達口蹄疫病毒衣殼蛋白并體外組裝出嵌合FLAG外源多肽的FMDV VLPs[26]；GUO等27利用分子伴侶蛋白SUMO對大腸埃希菌中FMDV的衣殼蛋白VP0、VP1和VP3進行了高效表達，將融合蛋白中的相撲片段用SUMO切割酶去除后，將3種衣殼蛋白組裝成VLPs。

3.4 外源蛋白融合及GPI錨定策略外源蛋白融合是指將保護性抗原與病毒跨膜蛋白的胞外域進行替換，借助病毒的胞內(nèi)域及跨膜域功能將外源蛋白嵌合至VLPs的表面。XU等[28]在ND VLPs載體平臺的基礎(chǔ)上，采用胞外域替換策略研發(fā)了新城疫禽流感二聯(lián)VLPs疫苗，在囊膜表面同時展示AIV H9N2亞型HA蛋白和NDV F及HN蛋白，免疫后可有效抵御NDV NA-1株和AIV H9N2亞型的攻擊。GPI是存在于真核細胞表面的糖基磷脂酰肌醇，包括CD14、CD16B、CD24、CD48、CD52、CD55、DAF等[29]，可通過GPI結(jié)構(gòu)錨定到真核細胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)，因此可將外源蛋白與GPI序列進行嵌合表達，而使外源蛋白通過GPI結(jié)轉(zhuǎn)移至有囊膜的VLPs表面。例如將布魯菌BCSP31蛋白與GPI串聯(lián)表達，與ND VLPs組裝而形成嵌合VLPs(cVLPs-GPI-BCSP31)，可在體內(nèi)、體外有效活化小鼠樹突狀細胞(DCs)，提供與疫苗菌株M5株相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo力[30]。

4 VLPs表達系統(tǒng)及載體動能

應(yīng)用于VLPs蛋白表達的系統(tǒng)有很多，約175種以上。目前，已經(jīng)應(yīng)用成功所構(gòu)建RNA病毒VLPs的表達系統(tǒng)包括：原核(細菌)表達系統(tǒng)及真核(桿狀病毒-昆蟲細胞、哺乳動物、酵母、植物)表達系統(tǒng)，在某些情況下也可應(yīng)用無細胞表達系統(tǒng)。一些表達系統(tǒng)基于它們的可變特征更適合于產(chǎn)生不同的VLPs。選擇合適的表達系統(tǒng)制備VLPs，是確保蛋白質(zhì)正確折疊和翻譯后修飾(PTM)的關(guān)鍵因素[31]。由于蛋白質(zhì)PTM如糖基化和磷酸化，病毒衣殼蛋白的四級結(jié)構(gòu)在不同的表達系統(tǒng)中可以不同，這可能影響疫苗的免疫原性，因為PTM通常是刺激適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)所必需的。

4.1 細菌表達系統(tǒng)細菌表達系統(tǒng)可用于制備許多VLPs，是制備重組蛋白最廣泛使用的表達系統(tǒng)之一。但是，由于各種因素，如缺乏PTM系統(tǒng)、二硫鍵形成不完全和蛋白質(zhì)溶解性問題，它們不是生產(chǎn)包膜VLPs的理想平臺[32]。細菌表達系統(tǒng)是生產(chǎn)具有1種或2種病毒結(jié)構(gòu)蛋白的無包膜VLPs的合適表達系統(tǒng)。然而，細菌在疫苗開發(fā)中，考慮到產(chǎn)品的成本，基于原核的表達系統(tǒng)通常被視為開發(fā)VLPs疫苗的最佳選擇，因為其能夠生產(chǎn)安全且成本有效的疫苗供全球使用[33]。大腸桿菌是生產(chǎn)VLPs最常見的細菌宿主細胞。其具有許多優(yōu)點，包括低生產(chǎn)成本、快速細胞生長、高蛋白質(zhì)表達水平和放大簡單。全球首個上市的HEV VLPs疫苗，是第1個使用大腸桿菌表達系統(tǒng)的疫苗，于2011年獲得許可并在中國上市[34]?？谷巳轭^瘤病毒16/18L1 VLPs的二價疫苗的表達平臺也是大腸桿菌[35]。瘧疾疫苗(MalariVax)是一種嵌合VLPs疫苗，由2個融合蛋白、HBV的核心蛋白和惡性瘧原蟲的表位組成，已在大腸桿菌中成功生產(chǎn)[36]。許多其他基于VLPs的候選疫苗使用大腸桿菌抗各種傳染病如西尼羅河病毒(WNV)、FMDV和HCV表達系統(tǒng)也已進入臨床前試驗[33]。除了大腸桿菌外，在其他一些細菌種類中也觀察到了VLPs的成功形成。利用乳糖誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)檢測L1蛋白的表達，成功進行了HPV-16 L1蛋白VLPs的自組裝。

4.2 酵母表達系統(tǒng)酵母細胞表達系統(tǒng)經(jīng)常用于重組蛋白表達，也用于VLPs的制備。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)是酵母表達平臺較受青睞的酵母細胞，酵母細胞表達系統(tǒng)具有細胞生長快速、表達蛋白產(chǎn)量高、可擴展性、成本可靠，并可以進行一定程度的PTM過程等優(yōu)點[37]。Engerix-B疫苗(HBV VLPs疫苗)和Gardasil疫苗(HPV VLPs疫苗)，通過酵母表達系統(tǒng)制備，并獲得FDA批準[38-39]。最近，基孔肯雅熱病毒(CHIKV)的VLPs通過畢赤酵母細胞表達已被報道[40]。雖然都取得了一定成就，但仍缺乏復(fù)雜的PTM以至于在生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定限制。另外，還可能存在高甘露糖基化的可能性、質(zhì)粒丟失和與細菌表達系統(tǒng)相比較低的蛋白質(zhì)產(chǎn)量等問題[37]。因此，酵母系統(tǒng)通常用于制備無包膜VLPs。有報道，酵母系統(tǒng)也已成功用于HIV1 Gag蛋白VLPs和DENV-2 VLPs的制備[41]。

4.3 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)(IBEVS)IBEVS是生產(chǎn)有包膜和無包膜VLPs最常用的表達系統(tǒng)。IBEVS對于VLPs的制備具有以下幾個優(yōu)點：比細菌/酵母表達蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高，且擁有復(fù)雜PTM途徑和多蛋白質(zhì)VLPs的形成優(yōu)勢。用于制備重組蛋白的常規(guī)昆蟲細胞系來源于草地夜蛾(Sf9/Sf21)和粉紋夜蛾(Tn5)。IBEVS經(jīng)常用于制備各種傳染病的候選疫苗，例如HIV1、H1N1、CHIKV、SARS、EBOV、登革熱病毒(DFV)等。IBEVS平臺與哺乳動物細胞相比，所表達的糖蛋白的N-糖基化模式相對簡單，可通過改善某些昆蟲細胞(例如Ea4)的糖基化途徑來增強昆蟲細胞N-糖基化機制。因此IBEVS有望開發(fā)成為VLPs疫苗生產(chǎn)的最強候選表達系統(tǒng)。

4.4 植物細胞表達系統(tǒng)植物表達系統(tǒng)具有高表達水平、低成本和無哺乳動物病原體污染以及產(chǎn)生具有正確折疊和PTM的蛋白質(zhì)的能力等優(yōu)點。利用MagnICON和CPMV-HT技術(shù)，植物疫苗已成為一個多用途和有前途的平臺。煙草花葉病毒研究的悠久歷史，確定病毒顆粒的三維(3D)結(jié)構(gòu)和鑒定結(jié)構(gòu)研究暴露的表面區(qū)域，是開發(fā)重組植物疫苗的里程碑[42]。超過55種不同的植物病毒已被用于在其表面創(chuàng)建抗原表達平臺，包括煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、苜?；ㄈ~病毒(AIMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、木瓜花葉病毒(PapMV)和馬鈴薯X病毒(PVX)。TMV、PVX、CPMV和CCMV在高溫和高pH下更穩(wěn)定，并在天然植物宿主中大量表達[43]。植物系統(tǒng)也被用于產(chǎn)生基于動物和人類病毒的VLPs。最近，已經(jīng)探索了使用基于植物的系統(tǒng)來表達類似于流感病毒VLPs的異源多亞基蛋白復(fù)合物，在幾天內(nèi)就可以從植物中獲得良好的產(chǎn)量。Medicago公司開發(fā)了一個平臺，用于生產(chǎn)針對冠狀病毒、輪狀病毒和諾如病毒等幾種病毒病原體的植物疫苗。Medicago公司開發(fā)的模擬天然諾如病毒的諾如病毒樣顆粒疫苗候選物目前正在臨床前研究中進行評估。一種植物衍生的四價VLPs候選物作為流感疫苗能夠在第1個Ⅲ期療效研究中誘導(dǎo)強烈的抗體和細胞反應(yīng)，目前正由加拿大衛(wèi)生部進行最后確定。同樣的方法，制備了冠狀病毒VLPs候選疫苗，正在進行一期試驗。據(jù)報道，截至2021年底，這種方法可以生產(chǎn)大約1億劑植物基新冠肺炎疫苗[44]。

4.5 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)動物細胞表達系統(tǒng)仍然是有價值和有吸引力的平臺，可用于生產(chǎn)非包膜和包膜VLPs的多結(jié)構(gòu)蛋白。動物細胞表達平臺是最有效的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，因為它們能夠產(chǎn)生對蛋白質(zhì)正確折疊至關(guān)重要的復(fù)雜而精確的PTMs。幾種動物細胞系，包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、幼倉鼠腎-21(BHK-21)、人胚胎腎293(HEK293)、來源于人羊膜細胞的CAP-T細胞系、Vero9和東蘭辛細胞系-0(ELL-0)，被廣泛用于生產(chǎn)重組VLPs[31]。CHO是最常用的細胞系，與其他細胞系相比，它的優(yōu)點在于它不是來源于人類細胞，因此它被人類病毒污染的風(fēng)險較低[31]。使用CHO細胞系進行HBsAg VLPs的細胞內(nèi)裝配是非常成功的表達系統(tǒng)的一個例子，DFV VLPs和漢坦病毒VLPs也已經(jīng)在CHO細胞中產(chǎn)生[45]。HEK293細胞系已被用于生產(chǎn)用于抗HIV、AIV和RABV的VLPs，并且CAP-T細胞系也被證明是用于HIV VLPs生產(chǎn)的高效表達系統(tǒng)[46]。然而，低蛋白產(chǎn)量、高生產(chǎn)成本、長表達時間和細胞系攜帶哺乳動物病原體感染的可能性被認為是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)于臨床使用存在的主要潛在缺點。

4.6 無細胞系統(tǒng)無細胞蛋白質(zhì)合成(CFPS)系統(tǒng)，在某種情況下，無包膜單衣殼VLPs的衣殼蛋白可以在無細胞環(huán)境中組裝以形成均質(zhì)VLPs或在完全無細胞的體外環(huán)境中合成和組裝[47]。CFPS系統(tǒng)通常由用于合成病毒衣殼蛋白的細菌或酵母細胞組成。與基于細胞的蛋白質(zhì)表達平臺相比，CFPS系統(tǒng)具有許多優(yōu)點，包括生產(chǎn)周期短、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量和較低的細胞污染物[45]。CFPS系統(tǒng)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)，采用該系統(tǒng)生產(chǎn)的Inflexal流感VLPs疫苗和Epaxal甲型肝炎VLPs疫苗已經(jīng)商品化生產(chǎn)。其他病毒例如諾如病毒和乙型肝炎VLPs也已經(jīng)通過使用體外表達系統(tǒng)有效表達[45]。但是CFPS系統(tǒng)具有高生產(chǎn)成本和有限可擴展性的局限性，限制了CFPS系統(tǒng)的商業(yè)應(yīng)用潛能。

5 蛋白定量及純化

純度檢測主要是確定VLPs結(jié)構(gòu)蛋白的純度、VLPs宿主的組裝率、DNA和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、質(zhì)譜法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗、透射電鏡檢測法等。李軍[48]研究的H5 VLPs疫苗，用配有Ultracel-50濾膜的Amicon Ultra-15離心式過濾器對H5 VLPs進行濃縮，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。此外，雙抗夾心ELISA方法可精準定量VLPs各組分含量，尤其適用于昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)等制備的無法完全清除雜蛋白的VLPs。例如利用雙抗夾心ELISA定量兔出血癥VLPs疫苗[49]和豬圓環(huán)病毒2型VLPs[50]等。

近年來，VLPs的制備工藝已進入產(chǎn)業(yè)化階段，其純化手段已發(fā)展成熟。純化VLPs首先需利用超聲破碎或去污劑等手段裂解表達細胞；其次是粗純化，低速離心或沉淀法去除裂解液中的細胞碎片和較大聚集物；之后是目標物的濃縮處理；最后是精制，通過超速離心等方法徹底清除目標物里的殘留物質(zhì)或是小分子雜質(zhì)等。靳野[51]研究的Asia I型口蹄疫VLPs，采用親和層析(Ni2+-NTA層析柱)方法對VP0/VP1/VP2蛋白進行純化。鄧均華等[52]研究的RHDV VLPs疫苗，采用蔗糖密度梯度離心實驗(SDGC)對VP60蛋白進行純化。例如NAUPU等[53]研究的HPV VLPs疫苗，采用蔗糖密度梯度離心試驗(SDGC)對L1蛋白進行純化，并應(yīng)用OptiprepTM進行精純。ETO等[54]研究的嵌合HPV-HIV VLPs疫苗，通過細胞破碎，采用KTA pure分子篩色譜法在HiTrap Capto Core 700GE(Health care,Chicago,IL,USA)柱上陰離子交換純化VLPs蛋白，再運用25%和75%蔗糖墊VLPs進一步純化。YILMAZ等[55]研究的SARS-CoV-2VLPs疫苗采用KTA-GO快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)在Hi-Screen Capto Core 400(Cytiva)柱上純化VLPs。特殊的層析過程是否能夠替代超速離心主要依賴于VLPs性質(zhì)特點、粒子大小、排斥作用等，離子交換和親和層析常用于VLPs精純，純化前需二價金屬氧化物處理提取液，以便獲得理想型疫苗級別的VLPs。

6 免疫原性評價及優(yōu)化

VLPs具有與天然病毒粒子相似的結(jié)構(gòu)和抗原表位，可以被抗原呈遞細胞(APC)有效識別，并產(chǎn)生與滅活病毒疫苗相似的保護性免疫反應(yīng)。VLPs免疫原性及免疫效率可以通過體液免疫檢測、細胞免疫、黏膜免疫、體內(nèi)排毒、體外病毒載量檢測來有效評估。例如吉林大學(xué)丁壯教授團隊研發(fā)的ND VLPs疫苗，在小鼠模型及本屬動物(SPF雞)中評價了疫苗的保護效果及免疫機理[28]。應(yīng)用血凝抑制試驗和間接ELISA方法進行體液免疫效力檢測，結(jié)果表明ND VLPs可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的血凝抑制抗體效價和特異性IgG抗體水平，攻毒后的體內(nèi)病毒載量與體外排毒時間均優(yōu)于傳統(tǒng)弱毒疫苗[17]；應(yīng)用流式細胞術(shù)進行細胞免疫檢測，結(jié)果表明VLPs可誘導(dǎo)脾T細胞活化并向效應(yīng)T細胞分化，能激活更多的特異性Th1細胞(CD4+IFN-γ+細胞)和Tc細胞(CD8+IFN-γ+細胞)[56]。劉新生[57]研發(fā)的FMDV嵌合VLPs疫苗，通過鼠細胞因子抗體芯片CYT.1和豚鼠淋巴細胞增殖試驗評估了嵌合VLPs疫苗免疫豚鼠后誘導(dǎo)的細胞免疫，結(jié)果顯示嵌合VLPs疫苗可刺激機體產(chǎn)生較高水平的IFN-γ和IL-6，MTT染色法測定淋巴細胞增殖情況結(jié)果顯示嵌合VLPs疫苗免疫組針對FMDV抗原刺激后可激活T淋巴細胞特異性增殖。此外，VLPs疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗的另外一個優(yōu)勢是可區(qū)分疫苗免疫血清和野毒感染血清。FMDV滅活疫苗對FMDV疫病防控做出了重大貢獻，但通過傳統(tǒng)的ELISA很難區(qū)分自然感染和疫苗免疫的動物，這給口蹄疫的臨床檢測和預(yù)防帶來了困難。FMDV的VLPs無核酸、非傳染性，只含有結(jié)構(gòu)蛋白，只有動物才能在免疫后被誘導(dǎo)產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，可以很容易地區(qū)分免疫動物和自然感染的動物。因此FMDV VLPs被認為是最有可能取代滅活病毒疫苗的候選疫苗[51]。目前在獸用的VLPs疫苗中，國內(nèi)注冊的VLPs疫苗為PCV-2 VLPs疫苗，在豬的PCV免疫應(yīng)用中取得了很好的效果。

為提高VLPs疫苗的免疫原性，通常采用添加免疫相關(guān)細胞因子或與佐劑聯(lián)合使用。將疫苗抗原特異性的靶向樹突狀細胞(dendritic cell,DC)可改善疫苗的免疫原性。DC-SIGN(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin)是樹突狀細胞膜表面的一種C型凝集素受體，利用化學(xué)交聯(lián)或基因工程方法將抗原與DC-SIGN配體聯(lián)合，將抗原特異性的靶向DC，可顯著促進疫苗的遞呈及免疫效果[57]。VLPs疫苗的遞送系統(tǒng)，對提高VLPs疫苗的免疫原性也十分重要，例如采用MPL/DDA佐劑遞送FMDV VLPs疫苗，MPL/DDA VLPs疫苗可以誘導(dǎo)高水平的特異性抗體滴度和強大的細胞免疫反應(yīng)。不僅可以誘導(dǎo)特定IFN-γ+CD4+(Th1)、IL-17A+CD4+(Th17)和IFN-γ+CD8+T細胞，還可以誘導(dǎo)特異性多功能CD4+和CD8+記憶T細胞共同表達IFN-γ、TNF-α和IL-2[58]。與之相似，F(xiàn)MDV VLPs和AuNC的聯(lián)合使用增加了細胞VLPs的攝取，并促進了RAW264.7細胞和DC中細胞因子的分泌，誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體和FMDV的中和抗體[59]。此外，合理的免疫程序也是提高VLPs免疫效率的重要因素。防疫人員可以根據(jù)疫病的流行特點，可一次多病原一針免疫，優(yōu)化應(yīng)用疫苗帶來的反復(fù)加強免疫，省時省本。

7 結(jié)語

隨著科技的發(fā)展，科研人員的奉獻專研，動物疫苗在不斷地迭代，尤其近年來亞單位疫苗、DNA疫苗、VLPs疫苗等新型疫苗的接連問世，解決了防疫人員的盲區(qū)。VLPs具有穩(wěn)定、安全、綠色以及獨特的結(jié)構(gòu)等特點，利用VLPs開發(fā)新型疫苗逐漸發(fā)展為一門學(xué)科，它整合了病毒學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和疫苗學(xué)的相關(guān)知識，已經(jīng)成為生產(chǎn)疫苗的優(yōu)勢選擇。相關(guān)研究顯示，VLPs自身具有佐劑分子的功能效應(yīng)，不需要與佐劑混合乳化就可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫刺激[60-61]。VLPs安全性高、細胞攝取效率高，具有良好的溶解度與生物相容性及靶向給藥和載藥能力[62]，還可通過與天然病毒感染相似的途徑呈遞給樹突狀細胞，繼而有效地誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生體液與細胞免疫，因此，VLPs被認為是一種理想的生物載體。當(dāng)代的研究中，VLPs已經(jīng)不僅僅作為疫苗而使用，更成為疫苗研究以及更多新型納米材料的載體，VLPs穩(wěn)定性高、無毒副作用、組織穿透性強、免疫效果好，是未來很有前景的疫苗研發(fā)熱點。