冷季不同飼養(yǎng)方式對(duì)阿什旦牦?？漳c差異蛋白的影響

張瑩瑩，張懷霞，謝 雯，任 昊，張春梅，陳 倩，賈建磊

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

【研究意義】青藏高原地區(qū)海拔高，氣候寒冷，牧草生長(zhǎng)期短，造成冷季(10月至次年6月)牧草匱乏，牦牛得不到足夠的供給會(huì)造成牦牛的生產(chǎn)效能低下甚至死亡，給牧民造成損失。為防止冬季虧損嚴(yán)重，有效的提高牦牛的生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益，牦牛的舍飼和半舍飼就成了當(dāng)下的一種趨勢(shì)[1-3]。反芻動(dòng)物日糧需要攝入40%～70%的粗飼料，以維持正常的胃腸功能和消化道菌群環(huán)境，現(xiàn)代集約化飼養(yǎng)模式下，牦牛日糧精料超過(guò)75%[4]。長(zhǎng)期的高精料喂養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致亞急性瘤胃酸中毒等代謝疾病的發(fā)生，從而導(dǎo)致動(dòng)物的機(jī)體和消化道受損，從而使牦牛的生產(chǎn)性能下降[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動(dòng)物的腸道是動(dòng)物消化系統(tǒng)的重要組成，對(duì)動(dòng)物攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有吸收、代謝和維持機(jī)體免疫的功能。空腸是動(dòng)物消化、吸收、代謝的重要場(chǎng)所，也是抵御有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體對(duì)機(jī)體的損傷的重要屏障?？漳c由單層上皮上細(xì)胞構(gòu)成，易受到腸道內(nèi)環(huán)境中pH和微生物等有毒有害物質(zhì)的損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的損傷[6]。Jahan等[7]研究表明，高精料飼養(yǎng)公牛會(huì)導(dǎo)致瘤胃中NH3-N濃度上升，而NH3-N的含量可以直接反應(yīng)瘤胃內(nèi)環(huán)境的狀態(tài)；Li等[8]研究表明，精粗比能夠影響反芻動(dòng)物瘤胃的pH，從而影響揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和菌體蛋白的含量，菌體蛋白的濃度可以反映出瘤胃微生物利用氨態(tài)氮的能力。高精料的碳水化合物飼糧減少了其在瘤胃中的停留時(shí)間，使得大量的過(guò)瘤胃淀粉會(huì)進(jìn)入到空腸，改變空腸內(nèi)的發(fā)酵參數(shù)，使腸道的pH降低，揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和脂多糖(LPS)濃度上升，引起腸道的酸中毒，從而破壞腸道上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，使腸道屏障受損[9-10]。周力等[11]發(fā)現(xiàn)飼糧的精粗比可以顯著影響青海黑藏羊小腸的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響黑藏羊小腸的代謝功能，精粗比為70∶30時(shí)效果較好；李巖等[12]發(fā)現(xiàn)飼糧的精粗比增加會(huì)抑制育肥后期牦牛對(duì)蛋白質(zhì)的合成和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，使牦牛的平均日增重和總增重降低。同時(shí)，Hristov等[13]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的高精料舍飼喂養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體代謝的紊亂，降低反芻動(dòng)物的免疫能力，從而影響反芻動(dòng)物的健康。此外，謝昕廷等[14]研究表明日糧精粗比會(huì)對(duì)牦牛肉的氨基酸和脂肪酸含量造成顯著的影響。【本研究切入點(diǎn)】通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究不同飼養(yǎng)模式下(自然放牧和高精料舍飼)牦?？漳c的蛋白質(zhì)表達(dá)差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從分子生物學(xué)的角度去探索冷季長(zhǎng)期高精料飼養(yǎng)對(duì)牦?？漳c的損傷，為合理科學(xué)的進(jìn)行牦牛飼養(yǎng)，提高生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取海北藏族自治州天然放牧的條件下12只(4±0.5)歲左右的阿什旦公牦牛，隨機(jī)分為兩組，每組6只，試驗(yàn)期為2018年11月16日至2019年5月4日，歷時(shí)180 d，前10 d為試驗(yàn)組牦牛預(yù)試期，后170 d為正試期。

表1 試驗(yàn)精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

試驗(yàn)組通過(guò)高精料舍飼的方式飼養(yǎng)，對(duì)照組為放牧飼養(yǎng)。對(duì)照組牦牛每天6:30放牧，20:00歸牧(歸牧后不補(bǔ)飼)。試驗(yàn)組牦牛根據(jù)中國(guó)肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 815—2004)配制飼料，精飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。粗飼料為玉米青貯和燕麥干草按1∶1比例混合，試驗(yàn)期間每只牦牛每日飼喂4 kg精飼料和2 kg粗飼料(干物質(zhì))，每天按時(shí)飼喂2次(9:00和17:00)，兩組均自由飲水。

1.2 試驗(yàn)樣品采集

飼養(yǎng)期結(jié)束后每組隨機(jī)選取3只牦牛，在夏華畜牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)空腹電擊擊暈后頸動(dòng)脈放血屠宰，試驗(yàn)牦牛均已經(jīng)經(jīng)過(guò)國(guó)家動(dòng)物屠宰檢疫總局(中國(guó)，青海)批準(zhǔn)屠宰。在屠宰后迅速采集牦?？漳c組織樣本(前段、中段和后段各1 cm混合)，PBS沖洗干凈后裝入無(wú)菌凍存管中，將樣本存入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取 蛋白質(zhì)提取方法根據(jù)賈建磊等[15]組織蛋白提取方法進(jìn)行空腸組織樣品總蛋白提取,每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 蛋白質(zhì)酶解和質(zhì)譜分析 蛋白質(zhì)酶解和質(zhì)譜分析在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行。根據(jù)超濾輔助樣品制備法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解(每個(gè)樣品250 μg)，肽段采用流動(dòng)相A相溶解后，使用EASY-nLCTM 1200 納升級(jí)UHPLC系統(tǒng)進(jìn)行肽段分離，肽段分離后用Q Exactive TM HF質(zhì)譜儀和Nanospray FlexTM(ESI)離子源對(duì)樣本進(jìn)行分析，生成質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)。利用MaxQuant軟件分析質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)，并與UniProt Bostaurus數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Blast2GO程序根據(jù)uniport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有已鑒定蛋白進(jìn)行細(xì)胞組分(CC)、生物學(xué)過(guò)程(BP)和分子功能(MF)分析。信號(hào)通路分析利用KEGG mapper平臺(tái)(http://www.genome.jp/kegg/mapper.html)Search pathway在線(xiàn)工具進(jìn)行信號(hào)通路分析。利用String程序(http://string-db.org/)檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)，利用Cytoscape軟件對(duì)交互網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行圖形可視化和分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)測(cè)試完成后先采用Excel 2010表格進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)處理，然后用SAS 9.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白聚類(lèi)分析

在不同飼養(yǎng)方式下(放牧飼養(yǎng)和全舍飼飼養(yǎng))，檢測(cè)出不同飼養(yǎng)模式下牦?？漳c的差異表達(dá)蛋白共96種，采用FC(fold change)≥1.2且P≤0.05篩選上調(diào)表達(dá)蛋白，當(dāng)FC≤1/1.2且P≤0.05篩選下調(diào)表達(dá)蛋白。樣本各差異蛋白相對(duì)含量聚類(lèi)熱圖結(jié)果(圖1)表明，放牧飼養(yǎng)組(A)和全舍飼飼養(yǎng)組(B)呈現(xiàn)出2個(gè)明顯區(qū)別的亞類(lèi)，較全舍飼組相比，放牧組有17種上調(diào)差異蛋白和79種下調(diào)差異蛋白。

不同顏色代表蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度，深紅色的代表較高的強(qiáng)度，藍(lán)色代表較低的強(qiáng)度，聚類(lèi)枝越短相似度越高Different colors indicate the relative abundance of proteins, dark red represents higher intensity and blue represents lower intensity, and the shorter the clustering branch the higher the similarity圖1 放牧組(A)和舍飼組(B)差異蛋白聚類(lèi)熱圖Fig.1 The heat map of differential protein clustering for grazing group (A) and confinedness group (B)

圖2 差異蛋白亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Differential protein subcellular localization prediction

2.2 亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位分析(圖2)表明，差異表達(dá)蛋白中細(xì)胞質(zhì)蛋白占23.54%，核蛋白占20.40%，線(xiàn)粒體蛋白占19.56%，細(xì)胞外蛋白占11.30%，質(zhì)膜蛋白占7.53%，其他的所占比例較少。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 差異蛋白GO富集分析 GO分析(圖3)顯示，基于細(xì)胞組分分析，差異蛋白主要在細(xì)胞膜(Membrane)、細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)和線(xiàn)粒體(Mitochondrion)中富集。 基于分子功能分析，差異蛋白主要在氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、細(xì)胞間粘著連接(Cell-cell adherens junction)、腺苷酸激酶活性(Adenylate kinase activity)、結(jié)合蛋白質(zhì)(Protein binding)和結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecute activity)中富集?；谏镞^(guò)程分析，差異蛋白主要在細(xì)胞凋亡(Apoptosis)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory response)、細(xì)胞對(duì)脂肪酸的反應(yīng)(Cellular response to fatty acids)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組(Actin cytoskeleton reorganization)和腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)受體(Adenylate cyclase- inhibiting G protein-coupled receptor)中富集。

2.3.2 差異蛋白KEGG富集分析 96種差異蛋白主要在以下20種信號(hào)通路中的富集。其中去除疾病通路顯著富集的通路為：緊密連接信號(hào)通路(Tight junction signaling pathway)、NF-kB信號(hào)通路(F-kappa B signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、調(diào)控干細(xì)胞的多能性的信號(hào)通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)?？芍?，KEGG通路分析與GO富集分析結(jié)果相匹配。

2.3.3 蛋白質(zhì)互作分析 利用String程序和Cytoscape軟件對(duì)放牧飼養(yǎng)和全舍飼飼養(yǎng)的牦?？漳c的96種差異表達(dá)蛋白的互作作用進(jìn)行分析，得出相應(yīng)的互作信息(圖5)，確定了兩個(gè)主要主題：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Occlusion，Claudin，Zo-1，ATP1B3和HKDC1)和炎癥反應(yīng)(GPR41，IL-6，TNF-α和CCL5)，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜而強(qiáng)大的PPI網(wǎng)絡(luò)。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG pathways enrichment analysis

圖5 基于Cytoscape軟件的不同飼養(yǎng)模式下牦牛空腸提取物差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)互作作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction networks of the differential abundance proteins of different feeding groups in Yak jejunum based on Cytoscape software

3 討 論

空腸是動(dòng)物消化吸收的主要場(chǎng)所，在消化系統(tǒng)中扮演者極其重要的角色，對(duì)牦牛來(lái)說(shuō)極其的重要。近年來(lái)由于青藏高原冬季牧草不足的原因，更多的人選擇用舍飼和半舍飼的飼養(yǎng)方式來(lái)飼喂牦牛，以提高牦牛的經(jīng)濟(jì)效益為自己減少損失[16]。同時(shí)舍飼飼養(yǎng)也可以提高牦牛的生產(chǎn)性能，使牦牛的日增重增加，但長(zhǎng)期的高精料飼養(yǎng)模式很容易對(duì)動(dòng)物的健康造成影響，也容易對(duì)動(dòng)物腸道造成傷害[17]?？漳c的機(jī)械屏障通過(guò)維持空腸粘膜的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)空腸進(jìn)行機(jī)械保護(hù)，一旦被破壞就會(huì)引起空腸功能障礙，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞被感染，致使緊密連接結(jié)構(gòu)損傷，通透性增加和炎癥反應(yīng)[18]，會(huì)促使腸道損傷，增加腸原性感染的發(fā)生[19]。

根據(jù)以上研究可以得出，靶蛋白可以分為兩個(gè)主題，分別為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通路(緊密連接信號(hào)通路，鈣信號(hào)通路和調(diào)控干細(xì)胞的多能性的信號(hào)通路)和炎癥反應(yīng)通路(MAPK信號(hào)通路，趨化因子信號(hào)通路和細(xì)胞因子受體相互作用)。GPR41會(huì)在被瘤胃所消化的短鏈脂肪酸所激活，可以調(diào)控脂類(lèi)的代謝，在腸道對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中起了重要的作用，作為營(yíng)養(yǎng)能量調(diào)節(jié)受體影響了緊密連接的信號(hào)傳導(dǎo)通路[20-21]。GPR41也參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，大劑量攝入可啟動(dòng)腸上皮細(xì)胞的糖異生過(guò)程，激活緊密連接信號(hào)通路，然后調(diào)節(jié)下游相關(guān)細(xì)胞增殖和凋亡通路，降低緊密連接蛋白的表達(dá)，同時(shí)，GPR41介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖并分泌大量的抗炎因子(IL-6，TNF-α，CCL5)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)通路(MAPK)相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)[22-23]。在本研究中檢測(cè)到相對(duì)于放牧飼養(yǎng)組，在高精料的全舍飼飼養(yǎng)中GPR41明顯上調(diào)，可得出在高精料全舍飼飼養(yǎng)的牦牛空腸中會(huì)促進(jìn)炎癥等一系列反應(yīng)[24]。

本研究還測(cè)定出幾種差異蛋白：Occludin，Claudin，Zo-1，ATP1B3，HKDC1，IL-6，TNF-α和CCL5。在與放牧組相比，在高精料的全舍飼飼養(yǎng)條件下Occlusion，Claudin，Zo-1，ATP1B3和HKDC1的表達(dá)明顯下調(diào)，而IL6，TNF-α和CCL5則呈相反的趨勢(shì)。緊密連接蛋白是空腸機(jī)械屏障的重要組成部分，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族組成，包括Occludin，Claudin和Zo-1，主要參與腸細(xì)胞的增殖分化，凋亡和細(xì)胞旁路通透性調(diào)節(jié)，抵御大分子的入侵[25-28]。所以當(dāng)Zo-1，Occludin和Claudin下調(diào)時(shí)會(huì)影響腸道機(jī)械屏障的完整性和通透性，增大了粘膜的通透性，會(huì)使得進(jìn)入血液的病菌增多，促進(jìn)炎癥反應(yīng)從而對(duì)牦牛個(gè)體產(chǎn)生影響[29-30]。NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控炎癥的主要通路之一[31]，發(fā)生炎癥反應(yīng)之后NF-κB信號(hào)通路會(huì)被顯著激活誘導(dǎo)IL-6，TNF-α炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)L6和TNF-α?xí)偈筎細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)行[32]。CCL5對(duì)于白細(xì)胞的趨化作用，多聚的CCL5還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，能夠激活炎性因子是炎癥反應(yīng)過(guò)程中很重要的一個(gè)步驟[33]。所以IL6，TNF-α和CCL5的上調(diào)同樣也是在促進(jìn)炎癥反應(yīng)，容易對(duì)牦牛個(gè)體造成損害。

4 結(jié) 論

不同的飼養(yǎng)模式下篩選了牦?？漳c差異蛋白質(zhì)96種，其中9種蛋白質(zhì)(Occludin，Claudin，Zo-1，ATP1B3，HKDC1，GPR41，IL-6，TNF-α和CCL5)相對(duì)較活躍，并且與牦?？漳c屏障和功能損害有關(guān)。由此可得，長(zhǎng)期高精料的全舍飼飼養(yǎng)模式會(huì)對(duì)牦牛的空腸造成一定的損害，高精料的全舍飼飼養(yǎng)只適合短期內(nèi)的牦牛育肥，而不適合長(zhǎng)期的牦牛養(yǎng)殖。