廣西紅花檵木炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性

葉云峰，杜嬋娟，楊 迪，趙廷昌，劉思情，付 崗

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南寧 530007；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100093；4.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061)

【研究意義】檵木是金縷梅科檵木屬常綠灌木植物，主要分布于我國(guó)、印度和日本等亞洲地區(qū)。我國(guó)的檵木主要有白花檵木(LoropetalumchinensisOliv.)和紅花檵木(L.chinensevar.rubrum)兩大類。白花檵木常生長(zhǎng)于山野灌木叢中，主要作為中藥材使用[1-2]。而紅花檵木是特產(chǎn)于我國(guó)的觀賞性植物，葉紅花艷、花期長(zhǎng)，深受園林綠化市場(chǎng)歡迎。自20世紀(jì)80年代開(kāi)始產(chǎn)業(yè)化栽培以來(lái)，已在我國(guó)華南、西南、華東和華中等地20多個(gè)省(區(qū))市大量應(yīng)用，并出口至美國(guó)、日本、韓國(guó)和德國(guó)等多個(gè)國(guó)家，成為我國(guó)園林花卉產(chǎn)業(yè)的特色產(chǎn)品之一[3-4]。在廣西地區(qū)，紅花檵木已在南寧市、桂林市、柳州市、梧州市和北海市5大城市綠化中廣泛應(yīng)用[5]，但隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，其病蟲害發(fā)生情況也日趨嚴(yán)重。2021年6—8月，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院香蕉病害研究團(tuán)隊(duì)課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西南寧市城市綠化帶及多個(gè)苗木生產(chǎn)基地的紅花檵木發(fā)生一種嚴(yán)重的葉部病害，發(fā)病率在30%以上，引起大量葉片萎蔫干枯甚至脫落，影響樹(shù)勢(shì)生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響苗木生產(chǎn)及園林美觀。因此，開(kāi)展該病害的病原菌分離鑒定和生物特性研究，明確病原菌的分類地位和生物學(xué)特性，對(duì)紅花檵木病害的科學(xué)防治及其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,對(duì)紅花檵木的研究主要集中在組培快繁、栽培管理、生理特性和滯塵能力等方面[6-9]，關(guān)于紅花檵木病害及病原鑒定的研究報(bào)道較少。張國(guó)輝等[10]采用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)保守序列測(cè)序和形態(tài)學(xué)鑒定方法將貴州省凱里市的紅花檵木炭疽病病原鑒定為膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)。Qiu等[11]結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因[ITS、鈣調(diào)蛋白(CAL)、幾丁質(zhì)合酶(CHS-1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和肌動(dòng)蛋白(ACT)]系統(tǒng)發(fā)育分析法將江西南昌梅嶺風(fēng)景區(qū)的紅花檵木原種(白花檵木)炭疽病病原鑒定為果生刺盤孢(C.fructicola)。盧東升等[12]采用顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)的方法將河南省信陽(yáng)市的紅花檵木灰斑病和褐斑病病原分別鑒定為擬盤多毛孢菌屬(Pestalotiopsis)和尾孢菌屬(Cercospora)真菌，但未在種水平進(jìn)行鑒定。此外，余國(guó)清等[4]介紹紅花檵木的主要病害有4種，包括炭疽病、立枯病、花葉病毒病和煤污病等，描述了這些病害的危害癥狀并提出具有針對(duì)性且切實(shí)可行的綜合防治技術(shù)措施。王燕和朱發(fā)仁[13]、王燕[14]分別對(duì)湖南省長(zhǎng)沙市和常德市的紅花檵木花葉病毒病危害癥狀和發(fā)生規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究，但未對(duì)病原進(jìn)行分類鑒定。許璐等[15]于2021年對(duì)紅花檵木病害的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，概述其病害共8種，包括7種真菌病害和1種病毒病害，其中，立枯病、炭疽病、煤污病、黑斑病、灰斑病和褐斑病等6種真菌和花葉病毒病均分布在我國(guó)，另外1種真菌病害枯梢病(Phytophthoraramorum)分布在美國(guó)[16]。目前，將紅花檵木病害病原菌鑒定到種水平的只有炭疽病和枯梢病，對(duì)其余病害的病原均未進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和研究?？梢?jiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅花檵木的研究多停留在表現(xiàn)癥狀的初步調(diào)查鑒定階段，未進(jìn)行深入探究病原菌的分類地位和生物學(xué)特性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】紅花檵木為廣西重要的園林觀賞植物，近年來(lái)發(fā)生一種嚴(yán)重的葉部病害，嚴(yán)重影響苗木生產(chǎn)及園林美觀，但目前尚無(wú)關(guān)于該病害病原鑒定及生物學(xué)特性研究的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分離紅花檵木葉部病害的病原菌，測(cè)定其致病性，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果對(duì)病原菌進(jìn)行分類鑒定。同時(shí)，對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，為該病害的正確診斷和科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 紅花檵木病葉 供試紅花檵木病葉采集于廣西南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)路西村苗木生產(chǎn)基地不同發(fā)病時(shí)期的紅花檵木植株。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)[17]：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，H2O 1.0 L，pH 7.0。基礎(chǔ)培養(yǎng)基[18]：蔗糖30.0 g，KNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂17.0 g，H2O 1.0 L。

1.1.3 殺菌劑 供試殺菌劑共12種，分別為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)、250 g/L丙環(huán)唑乳油(山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司)、430 g/L戊唑醇懸浮劑(江蘇七洲綠色化工股份有限公司)、30%吡唑醚菌酯懸浮劑(河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司)、22.5%啶氧菌酯懸浮劑(安陽(yáng)市銳普農(nóng)化有限公司)、41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑 [拜耳(中國(guó))有限公司]、50%啶酰菌胺水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司)、400 g/L嘧霉胺懸浮劑[拜耳(中國(guó))有限公司]、80%乙蒜素乳油(河南科邦化工有限公司)、80%代森錳鋅可濕性粉劑[陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)(中國(guó))科技有限公司]、50%多菌靈可濕性粉劑(上海悅聯(lián)化工有限公司)和450 g/L咪鮮胺水乳劑(青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病樣采集及癥狀觀察 2021年8月采集紅花檵木病葉帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原菌分離。同時(shí)，對(duì)病害早期至晚期的癥狀進(jìn)行觀察、拍照和記錄。

1.2.2 病原菌分離純化 采用組織分離法分離病原菌。在病葉的病健交界處切取大小為3 mm×3 mm的組織塊，用75%乙醇消毒10 s，0.1%氯化汞消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上28.0 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，選取出現(xiàn)率高且形態(tài)一致的菌落進(jìn)行單孢分離培養(yǎng)。

1.2.3 致病性測(cè)定 將單孢分離的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28.0 ℃培養(yǎng)10 d，用滅菌打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，備用。選擇紅花檵木盆栽苗上的10張葉片，用滅菌針頭輕微刺傷，將制備好的菌餅接種于傷口處，套袋保濕，以接種空白PDA菌餅的葉片為對(duì)照，所有接種植株置于氣候箱內(nèi)，30.0 ℃培養(yǎng)。定期觀察和記錄發(fā)病癥狀，并從發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再分離。

1.2.4 病原菌鑒定 形態(tài)學(xué)特征觀察：將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，28.0 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，觀察記錄菌落顏色和形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并隨機(jī)測(cè)量100個(gè)分生孢子的大小。

多基因系統(tǒng)發(fā)育分析：采用真菌DNA提取試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)提取病原菌總DNA?；蜻x擇及PCR擴(kuò)增參照Weir等[19]、徐丹丹等[20]的方法(略有改動(dòng))，使用6對(duì)引物分別對(duì)病原菌代表性菌株H6的ITS、ACT、β-微管蛋白(TUB2)、GAPDH、CHS-1和CAL等基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，無(wú)菌ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序：94.0 ℃預(yù)變性5 min；94.0 ℃ 30 s，各引物(ITS：52.0 ℃；ACT和CHS-1：58.0 ℃；TUB2：55.0 ℃；GAPDH和CAL：59.0 ℃)30 s，72.0 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72.0 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)有目標(biāo)條帶后，委托北京擎科生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并采用MEGA-X的Neighbor Joining法構(gòu)建基于ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1和CAL的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定病原菌的分類地位。

1.2.5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響：將病原菌菌株H6移至PDA培養(yǎng)基中，28.0 ℃培養(yǎng)5 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌絲塊，接種至PDA培養(yǎng)基上，分別置于4.0、7.0、10.0、13.0、16.0、19.0、22.0、25.0、28.0、31.0、34.0和37.0 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算菌落擴(kuò)展直徑，篩選最適宜菌株H6菌絲生長(zhǎng)的溫度。菌落擴(kuò)展直徑=菌落直徑-接種的菌絲塊直徑(5 mm)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

表1 菌株H6基因序列的PCR擴(kuò)增所用引物

pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響：將直徑為5 mm的菌絲塊分別接種至pH為3.5、4.0、 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的PDA培養(yǎng)基中，28.0 ℃培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算菌落擴(kuò)展直徑，篩選最適宜菌株H6菌絲生長(zhǎng)的pH。每處理重復(fù)3次。

碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響：用蔗糖、葡萄糖、山梨醇、D-半乳糖、可溶性淀粉、木糖醇、木糖、甘油、果糖、乳糖和甘露醇等作為碳源，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源(蔗糖)，制成含不同碳源的培養(yǎng)基，pH自然。用直徑5 mm的打孔器取菌絲塊接種于上述培養(yǎng)基中，28.0 ℃培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落擴(kuò)展直徑，篩選最適宜菌株H6菌絲生長(zhǎng)的碳源。每個(gè)處理重復(fù)3次。

氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響：用硝酸鈉、亞硝酸鈉、甘氨酸、L-脯氨酸、尿素、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨和DL-丙氨酸等作為氮源，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源(硝酸鉀)，制成含不同氮源的培養(yǎng)基，pH自然。用直徑5 mm的打孔器取菌絲塊接種于上述培養(yǎng)基中，28.0 ℃培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落擴(kuò)展直徑，篩選最適宜菌株H6菌絲生長(zhǎng)的氮源。每個(gè)處理重復(fù)3次。

殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果試驗(yàn)：在PDA培養(yǎng)基中，分別加入1.1.3中的12種殺菌劑，制成含藥培養(yǎng)基，不同殺菌劑最終稀釋倍數(shù)和有效濃度見(jiàn)表2。將直徑為5 mm的菌絲塊接種至各含藥培養(yǎng)基中，28.0 ℃培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落擴(kuò)展直徑，分析不同殺菌劑對(duì)菌株H6菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。以不含藥劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS_V9.01的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花檵木炭疽病自然癥狀及病原菌接種癥狀

紅花檵木炭疽病主要危害紅花檵木的葉片，植株中下部葉片受害較重，最初在葉片上形成近圓形或不規(guī)則形褐色小斑，隨后擴(kuò)展成大斑，或多個(gè)病斑融合成更大的病斑，病斑內(nèi)部為褐色或灰褐色，邊緣為深褐色(圖1-A)。病害嚴(yán)重時(shí)，病斑擴(kuò)展至整張葉片，造成葉片萎蔫干枯甚至脫落。從不同發(fā)病時(shí)期的病葉中共分離獲得6株形態(tài)一致的真菌菌株。將這些菌株的菌餅接種至紅花檵木活體葉片上，接種第7天葉片上出現(xiàn)近圓形褐色病斑(圖1-B)，接種第10天病斑變灰褐色并干枯(圖1-C)，與自然發(fā)病癥狀相似。接種空白PDA菌餅的CK葉片均未發(fā)病(圖1-D)。從接種發(fā)病的病斑上均能再次分離純化出相同的病原菌。

表2 不同殺菌劑最終稀釋倍數(shù)和有效濃度

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 在PDA培養(yǎng)基中，6株菌株的菌落均近圓形，初為白色，培養(yǎng)8 d后，菌落中部灰色至深灰色，邊緣灰白色，氣生菌絲體疏松、絮狀(圖2-A)；分生孢子為單細(xì)胞、透明、直、長(zhǎng)橢圓形，一端鈍圓，另一端鈍圓或略尖(圖2-B)；大小為(8.52～18.83)μm×(4.25～6.03)μm。形態(tài)特征與前人[14-15]報(bào)道的果生刺盤孢形態(tài)一致。

2.2.2 多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果 對(duì)代表性菌株H6的ITS、 ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1和 CAL基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，所得序列信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)分別為OK327013、OK649310、OK649314、OK649313、OK649312和OK649311。通過(guò)BLAST同源性比對(duì)，這些基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)果生刺盤孢菌株的序列同源性均最高，達(dá)99%～100%。以Monilochaetesinfuscans作為外群，采用MEGA-X軟件的Neighbor Joining法構(gòu)建基于ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1和 CAL的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3)，利用最大似然法(ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株H6與果生刺盤孢(C.fructicola)聚于同一最小分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將紅花檵木炭疽病病原菌鑒定為果生刺盤孢。

A：自然癥狀；B：接種病原菌第7天發(fā)病癥狀；C：接種病原菌第10天發(fā)病癥狀；D：空白對(duì)照A：Natural symptoms；B：Symptoms of leaves inoculated with the pathogen on the 7th day；C：Symptoms of leaves inoculated with the pathogen on the 10th day；D：Blank control圖1 紅花檵木炭疽病癥狀Fig.1 Anthracnose symptoms of L. chinense var. rubrum

A：PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B：分生孢子形態(tài)A：Colony on PDA；B：Conidial morphology圖2 病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the pathogen

圖3 基于ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1和CAL基因序列的炭疽菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of anthrax strains based on the gene sequences of ITS，ACT，TUB，GAPDH，CHS-1 and CAL

2.3 果生刺盤孢的生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響 從圖4可以看出，果生刺盤孢可在10.0～34.0 ℃下生長(zhǎng)，隨著溫度的升高，菌落的擴(kuò)展直徑呈先上升后下降趨勢(shì)；25.0～31.0 ℃較適宜菌絲生長(zhǎng)，而最適宜溫度為28.0 ℃，菌落擴(kuò)展直徑達(dá)63.13 mm，且顯著高于其他處理(P<0.05，下同)；除溫度為4.0、7.0和37.0 ℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)外，在其他溫度下病原菌菌落的擴(kuò)展直徑間均具有顯著差異?？梢?jiàn)，最適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的溫度為28.0 ℃。

圖4 溫度對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of temperature on mycelial growth of C. fructicola

2.3.2 pH對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖5可看出，果生刺盤孢菌絲在pH 3.5～10.5均可生長(zhǎng)。其中，pH在4.0～9.5時(shí)，菌落均能良好生長(zhǎng)，較適宜的pH為6.0～8.5；當(dāng)pH為8.0時(shí)，菌落擴(kuò)展直徑最大，達(dá)53.88 mm，與pH 7.5時(shí)的菌落擴(kuò)展直徑差異不顯著(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他pH處理；pH為6.0、6.5和7.0時(shí)，菌落擴(kuò)展直徑間也無(wú)顯著差異；pH在3.5、10.0和10.5時(shí)，菌落擴(kuò)展直徑顯著小于其他pH處理?？梢?jiàn)，最適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的pH為8.0。

2.3.3 碳源對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響 從圖6可看出，果生刺盤孢菌絲在11種供試碳源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但在不同碳源之間生長(zhǎng)差異明顯。其中，在以木糖醇為碳源的培養(yǎng)基中菌落擴(kuò)展直徑顯著大于其他處理，其次是山梨醇碳源培養(yǎng)基，再次是甘露醇碳源培養(yǎng)基，而在以D-半乳糖和果糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，二者的菌落擴(kuò)展直徑差異不顯著，但均顯著小于其他碳源培養(yǎng)基?？梢?jiàn)，最適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的碳源為木糖醇，山梨醇和甘露醇也可作為較適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的碳源。

圖5 pH對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of pH on mycelial growth of C. fructicola

2.3.4 氮源對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響 從圖7可看出，果生刺盤孢菌絲在10種供試氮源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源均可利用。其中，在以L-脯氨酸為氮源的培養(yǎng)基中菌落直徑擴(kuò)展最快，且顯著大于其他處理，其次是在尿素和硝酸鉀培養(yǎng)基中，二者菌落的擴(kuò)展直徑差異不顯著，而在以氯化銨、硫酸銨和磷酸二氫銨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，三者間的菌落擴(kuò)展直徑差異不顯著，但均顯著小于其他處理?？梢?jiàn)，最適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的氮源為L(zhǎng)-脯氨酸，尿素和硝酸鉀也可作為較適宜果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的氮源。

2.3.5 不同殺菌劑對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響 從圖8可看出，不同殺菌劑對(duì)果生刺盤孢菌絲的生長(zhǎng)均具有明顯影響。其中，果生刺盤孢菌絲在含有吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、乙蒜素、多菌靈和咪鮮胺的培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng)，說(shuō)明這幾種藥劑對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑制效果；果生刺盤孢菌絲在含有其他藥劑的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但在含有丙環(huán)唑和代森錳鋅的培養(yǎng)基中菌落擴(kuò)展直徑較小，僅分別為3.69和4.95 mm，說(shuō)明這2種藥劑對(duì)果生刺盤孢也有較好的抑制效果；啶酰菌胺對(duì)果生刺盤孢的抑制效果最差，菌落擴(kuò)展直徑與CK無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、乙蒜素、多菌靈和咪鮮胺對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較佳。

圖6 碳源對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of carbon source on mycelial growth of C. fructicola

圖7 氮源對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of nitrogen source on mycelial growth of C. fructicola

3 討 論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果將廣西紅花檵木炭疽病病原鑒定為果生刺盤孢，與張國(guó)輝等[10]對(duì)貴州省凱里市紅花檵木炭疽病病原鑒定結(jié)果為膠孢炭疽菌不一致，表明引起紅花檵木炭疽病的病原菌不止1種，在不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)病原菌種類不同，可能與病原菌的地域適應(yīng)性有關(guān)。此外，在分子生物學(xué)鑒定方面，張國(guó)輝等[10]僅對(duì)ITS序列進(jìn)行測(cè)序，而本研究對(duì)ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1和 CAL等多基因序列進(jìn)行測(cè)序并構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，因此，本研究的鑒定結(jié)果相對(duì)更精確。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)多數(shù)學(xué)者均采用形態(tài)學(xué)與多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析相結(jié)合的方法對(duì)植物炭疽病病原菌進(jìn)行種的鑒定[20-23]，因?yàn)樘烤揖鷮俚姆诸愝^復(fù)雜，其中，膠孢炭疽菌為復(fù)合種。Weir等[19]于2012年通過(guò)多基因聯(lián)合建樹(shù)的方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種劃分為22個(gè)種和1個(gè)亞種，由于各復(fù)合種的形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件影響而發(fā)生變異，且種間基因序列的相似度較高，僅依靠形態(tài)學(xué)特征和單一的基因分析鑒定方法不易進(jìn)行種間區(qū)分。本研究鑒定的果生刺盤孢與張國(guó)輝等[10]鑒定的膠孢炭疽菌均為膠孢炭疽菌的復(fù)合種之一，因此，在分子生物學(xué)鑒定方面，采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析方法有利于提高鑒定結(jié)果的可靠性。此外，膠孢炭疽菌的不同復(fù)合種常存在共同侵染現(xiàn)象，如廣東的咖啡炭疽病由果生刺盤孢和C.siamense共同侵染，以果生刺盤孢為優(yōu)勢(shì)菌[20]；成都的灑金珊瑚炭疽病由C.siamense、C.aenigma、C.karstii和果生刺盤孢共同侵染，以C.siamense為優(yōu)勢(shì)菌[22]。Qiu等[11]同樣結(jié)合形態(tài)學(xué)和多基因序列發(fā)育分析方法將紅花檵木原種(白花檵木)炭疽病病原鑒定為果生刺盤孢，本研究結(jié)果與其一致，表明該菌既能侵染紅花檵木也可侵染白花檵木。此外，果生刺盤孢還可侵染咖啡、草莓、灑金珊瑚、甜柿、櫻桃和甜茶等多種植物引起炭疽病[20-24]，表明該病原菌寄主范圍廣泛。廣西紅花檵木炭疽病的病原除果生刺盤孢外，是否還存在膠孢炭疽菌的其他復(fù)合種，有待進(jìn)一步探究。

圖8 不同殺菌劑對(duì)果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Fig.8 Inhibitory effects of different fungicides on mycelial growth of C. fructicola

本研究結(jié)果表明，廣西紅花檵木果生刺盤孢對(duì)溫度適應(yīng)范圍廣，菌絲在10.0～34.0 ℃時(shí)均能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)溫度為25.0～31.0 ℃，最適溫度為28.0 ℃，溫度低于7.0 ℃和高于37.0 ℃均不能生長(zhǎng)，與宋麗麗等[21]對(duì)草莓果生刺盤孢和劉倩麗等[24]對(duì)檀香果生刺盤孢的研究結(jié)果基本一致。稍有不同的是，本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度梯度間隔為3.0 ℃，而宋麗麗等[21]、劉倩麗等[24]設(shè)置的溫度梯度間隔為5.0 ℃，其測(cè)定的果生刺盤孢生長(zhǎng)最適溫度均為30.0 ℃。

本研究發(fā)現(xiàn)，紅花檵木果生刺盤孢對(duì)pH適應(yīng)范圍也較廣，菌絲在pH 3.5～10.5均能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)pH為6.0～8.5，最適生長(zhǎng)pH為8.0；紅花檵木果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)可利用多種碳源和氮源，其中，較適宜的碳源為木糖醇、山梨醇和甘露醇，較適宜的氮源為L(zhǎng)-脯氨酸、尿素和硝酸鉀，與宋麗麗等[21]、劉倩麗等[24]的研究結(jié)果存在差異。原因可能是不同來(lái)源菌株對(duì)生長(zhǎng)條件的需求不同，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和供試的碳氮源不同也可能造成研究結(jié)果存在差異。

徐丹丹等[20]報(bào)道咪鮮胺和吡唑醚菌酯對(duì)咖啡果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)具有顯著抑制效果，張童等[23]報(bào)道百菌清對(duì)甜柿果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，唑醚·代森聯(lián)和嘧菌酯次之。本研究發(fā)現(xiàn)，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、乙蒜素、多菌靈和咪鮮胺對(duì)紅花檵木果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，以上藥劑種類均可作為果生刺盤孢的防治藥劑在生產(chǎn)中試驗(yàn)使用。

4 結(jié) 論

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合方法，首次明確引起廣西園林觀賞植物紅花檵木炭疽病的病原菌為果生刺盤孢(C.fructicola)。紅花檵木炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)受溫度、pH、碳源、氮源和殺菌劑等的影響，其中，溫度和殺菌劑的影響較突出，殺菌劑吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、乙蒜素、多菌靈和咪鮮胺等對(duì)紅花檵木果生刺盤孢菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，制定紅花檵木炭疽病防治措施時(shí)需充分了解該菌的生物學(xué)特性。