腸道細(xì)菌通過競爭生態(tài)位和保護(hù)腸道內(nèi)壁降低小菜蛾對Bt的敏感性

陶新娉,賈元虹,孫 燕,韓順財,夏曉峰,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所,閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部閩臺作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué),教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella是對十字花科作物具有極強(qiáng)破壞性的世界性害蟲之一。全世界平均每年因其損失的經(jīng)濟(jì)收益及防治成本高達(dá)40億～50億美元(Furlongetal.,2013)。近年來，化學(xué)殺蟲劑無節(jié)制、不合理的使用，使小菜蛾對幾乎所有用于防治的化學(xué)殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性(Lietal.,2016)，導(dǎo)致小菜蛾的防治愈加困難，尋找好的生物防治方法成為當(dāng)前小菜蛾防控研究的重點(diǎn)。蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)作為當(dāng)前國際上使用最廣泛、研究最深入的昆蟲病原微生物殺蟲劑之一，具備無農(nóng)藥殘留、無環(huán)境污染、對人畜無害等優(yōu)點(diǎn)，是替代化學(xué)殺蟲劑用于防治小菜蛾的最佳選擇之一(Rohetal.,2007)。然而Bt及Bt轉(zhuǎn)基因作物的大量使用導(dǎo)致小菜蛾產(chǎn)生選擇性壓力，并不斷增強(qiáng)對Bt的抗性(Crickmore,2016;Xiongetal.,2021;Sunetal.,2022)，嚴(yán)重威脅Bt制劑的殺蟲效力，影響和制約田間農(nóng)作物的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)收益。小菜蛾作為Bt防治的主要對象之一，同時又是一類對Bt具有強(qiáng)抗性的昆蟲，對其Bt抗性機(jī)理的研究不僅有助于開發(fā)新型可持續(xù)的小菜蛾防控策略，還能為其他害蟲的防治提供借鑒，是當(dāng)前生產(chǎn)實(shí)踐中亟需解決的問題。

腸道作為一個開放的內(nèi)環(huán)境，含有非常豐富的共生微生物資源，是與攝入外源物質(zhì)接觸的第一場所。腸道微生物充當(dāng)攝入外源物的代謝媒介，近年來被認(rèn)為是昆蟲的一個重要組織器官。腸道微生物通過與宿主昆蟲互作，在宿主的營養(yǎng)供給(Xiaetal.,2017)、生長發(fā)育(Habinezaetal.,2019)、代謝物解毒(Berasateguietal.,2017)、病原體防御(Tetreauetal.,2018)和農(nóng)藥抗性(Xiaetal.,2013,2018)等方面發(fā)揮重要作用。隨著“宿主-腸道微生物互作”研究領(lǐng)域的迅速擴(kuò)大，越來越多的研究表明腸道微生物與Bt抗性密切相關(guān)，且不同腸道微生物介導(dǎo)Bt殺蟲活性的效應(yīng)不同。一方面，一些腸道微生物與Bt存在協(xié)同效應(yīng)，提高宿主對Bt的敏感性，加速寄主的死亡。如在舞毒蛾Lymantriadispar、小紅蛺蝶Vanessavardui、煙草天蛾Manducasexta和菜青蟲Pierisrapae的研究均表明Bt殺蟲活性依賴于腸道細(xì)菌的存在(Brodricketal.,2006,2009)；糞腸球菌Enterococcusfaecalis通過Bt毒素造成的腸道上皮傷口進(jìn)入煙草天蛾血淋巴加速幼蟲的死亡，從而提高Bt的殺蟲活性(Masonetal.,2011)。另一方面，一些腸道微生物與Bt存在拮抗效應(yīng)，降低宿主對Bt的敏感性，從而減緩宿主的死亡。目前已有多項(xiàng)關(guān)于腸道微生物與Bt拮抗效應(yīng)機(jī)制的報道：如Bt菌株可以在無腸道菌的茶長卷葉蛾Homonamagnanima尸體中生長，但不能在正常飼養(yǎng)(含腸道菌)的幼蟲中增殖，表明腸道細(xì)菌可以通過直接抑制Bt的增殖提高宿主對Bt的抗性(Takatsuka and Kunimi,2000)；棉鈴蟲Helicoverpaarmigera腸道細(xì)菌分泌的蛋白酶會影響B(tài)t原毒素Cry1Ac的活化從而導(dǎo)致Bt毒性的改變(Visweshwaretal.,2015)；印度谷螟Plodiainterpunctella腸道細(xì)菌的丟失會影響宿主的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致宿主酚氧化酶活性降低和血凝素基因的低表達(dá)；同時腸道細(xì)菌痤瘡假單胞菌Propionibacteriumacnes代謝分泌的乳酸、乙酸和丙酸等化合物可能通過降低腸道環(huán)境pH值，影響Cry毒素的活化，進(jìn)而降低宿主對Bt的易感性(Orozco-Floresetal.,2017)。

腸道微生物的重要功能及其介導(dǎo)宿主對Bt的抗性使其成為農(nóng)業(yè)害蟲生物防控的新靶標(biāo)。小菜蛾作為田間最早產(chǎn)生Bt抗性的害蟲(Xiaetal.,2014)，已成為研究Bt抗性最主要的模式生物，其腸道微生物與Bt抗性之間的關(guān)系值得探討。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物介導(dǎo)小菜蛾對化學(xué)殺蟲劑毒死蜱的抗性，并且腸道微生物與免疫系統(tǒng)之間的互作可能導(dǎo)致小菜蛾對化學(xué)殺蟲劑抗性的進(jìn)一步增強(qiáng)(Xiaetal.,2013,2018)。關(guān)于小菜蛾對生物農(nóng)藥Bt抗性的研究，目前主要集中在Bt與中腸受體的互作(Gongetal.,2010;Guoetal.,2015;Sunetal.,2022)及Bt抗性突變基因功能驗(yàn)證的研究上(Ayra-Pardoetal.,2015;Guoetal.,2015;Crickmore,2016;Liuetal.,2020)，腸道微生物與宿主Bt抗性之間的互作效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)理的研究方面鮮有報道。本研究通過分析小菜蛾腸道細(xì)菌對Bt殺蟲活性的影響，明確腸道細(xì)菌對宿主腸道的保護(hù)作用，初步闡釋腸道細(xì)菌影響B(tài)t殺蟲活性的作用機(jī)制，從不同角度解析小菜蛾腸道細(xì)菌介導(dǎo)宿主對Bt抗性的效應(yīng)，促進(jìn)小菜蛾抗性機(jī)理的研究和綜合防治。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與菌株

小菜蛾福州敏感品系(FZss)于2004年采集于福建省福州市郊區(qū)(26.08°N,119.28°E)，蘿卜苗飼養(yǎng)幼蟲，10%蜂蜜水飼喂成蟲，飼養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，相對濕度70%～80%，光周期16L∶8D。小菜蛾飼料敏感品系(SLss)購自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，按照沈金紅等(2018)描述的方法利用人工飼料飼養(yǎng)幼蟲，10%蜂蜜水飼喂成蟲，飼養(yǎng)條件同F(xiàn)Zss品系。供試腸道細(xì)菌腸桿菌Enterobactersp.IAE5 (EbPXG5)菌株(GenBank登錄號:JQ396388) 分離自FZss品系小菜蛾腸道，蘇云金芽孢桿菌Bt8010菌株由福建農(nóng)林大學(xué)教育部生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室關(guān)雄教授贈送，各菌株均保存于福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所。

1.2 腸道無菌小菜蛾品系的構(gòu)建

1.2.1無菌飼料的配制：稱取麥胚粉30 g、酵母粉16 g、蔗糖8 g、蘿卜籽2.4 g、瓊脂4.8 g，倒入500 mL錐形瓶混勻，加入800 μL菜籽油、4滴亞油酸、200 mL ddH2O，玻璃棒攪拌均勻，115℃滅菌30 min。待冷卻至60℃，置于超凈工作臺內(nèi)加入8 mL無菌維生素混合液，搖晃均勻后，倒入90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，過夜晾干。

1.2.2腸道無菌小菜蛾品系的飼養(yǎng)與鑒定：用卵卡收集正常飼養(yǎng)條件下的SLss小菜蛾卵，在超凈工作臺對卵卡進(jìn)行消毒處理：10% NaClO溶液清洗卵卡，正反面各浸泡30 s，無菌水漂洗3次，每次30 s，超凈工作臺內(nèi)吹風(fēng)晾干。分別將最后漂洗的無菌水以及卵的研磨液(將卵置于RNase-free ddH2O中研磨)涂布LB平板觀察有無細(xì)菌生長，并且卵研磨液進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。將第3次漂洗卵的無菌水以及卵研磨液涂板，無細(xì)菌生長，且16S rDNA擴(kuò)增無條帶視為無菌卵。將無菌卵置于90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入無菌人工飼料，在培養(yǎng)皿中間放置一層衛(wèi)生紙(滅菌)，以防飼養(yǎng)環(huán)境過于潮濕，置于恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。幼蟲飼養(yǎng)至3齡，隨機(jī)取3組，每組5頭幼蟲，幼蟲表面經(jīng)75%無水乙醇浸泡90 s后，用無菌水漂洗3次，解剖收集腸道內(nèi)容物于含1 mL RNase-free ddH2O的離心管中，充分震蕩混勻后作為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果無條帶，視為腸道無菌小菜蛾品系構(gòu)建成功，以自然飼養(yǎng)的FZss腸道內(nèi)容物16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果作為對照。16S rDNA擴(kuò)增：利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)擴(kuò)增16S rDNA(Galkiewicz and Kellogg,2008)。PCR反應(yīng)體系(25 μL):模板1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,Phanta Max Super Fidelity DNA Polymernse 0.5 μL,ddH2O 8.5 μL,dNTP Mix 0.5 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸1 min,29輪循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3 腸道細(xì)菌對小菜蛾Bt敏感性的影響測定

取FZss小菜蛾4齡幼蟲10頭，解剖收集腸道內(nèi)容物于含1 mL無菌水的離心管中，充分震蕩混勻后備用。取100 μL勻漿接種到100 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)，6 000 r/min 10 min離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體3次后，適量無菌水溶解菌體，測定菌液OD600值，制備腸道總菌群(total gut bacteria)菌液。將前期分離的腸道菌EbPXG5于37℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，小菜蛾生防菌株Bt8010于30℃ 180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 h。培養(yǎng)結(jié)束后，按上述步驟收集兩種菌的菌體，測量菌液OD600值。配制瓶裝無菌飼料，待溫度冷卻至瓶身觸手不燙時，加入菌液，對照加相同體積無菌水；單一菌飼料加1 mL無菌水和1 mL EbPXG5菌液或腸道總菌群菌液或Bt8010菌液，混合菌飼料加1 mL腸道總菌群菌液或EbPXG5菌液和1 mL Bt8010菌液。分別配制終濃度OD600=0.05的腸道總菌群菌液、OD600=0.05的EbPXG5菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的腸道總菌群菌液、OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的EbPXG5菌液的人工飼料。飼養(yǎng)無菌小菜蛾幼蟲至3齡初期，饑餓4 h，飼喂上述配制好的帶菌飼料，以無菌人工飼料為對照，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20頭幼蟲，每隔12 h記錄一次存活率。

1.4 腸道細(xì)菌EbPXG5培養(yǎng)液上清與菌體破碎液對小菜蛾Bt敏感性的影響測定

EbPXG5菌株過夜培養(yǎng)，測定菌液OD600值，6 000 r/min離心10 min，分離菌體與上清，上清10 000 r/min離心10 min，0.22 μm濾膜過濾，收集無菌上清液；菌體用PBS緩沖液清洗3次后，加入適量PBS緩沖液溶解菌體，并加入苯甲基磺酰氟(PSFM)使其終濃度為0.1 mmol/L，超聲破碎，收集菌體破碎液。分別配制1盒無菌飼料、1盒含Bt8010終濃度為OD600=0.05的人工飼料，切塊稱重，每克加入100 μL稀釋好的OD600=0.05的EbPXG5菌株的上清液和菌體破碎液。飼養(yǎng)小菜蛾幼蟲至3齡初期，饑餓4 h，飼喂配制好的飼料，以飼喂無菌人工飼料為對照，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20頭幼蟲，每隔12 h記錄一次存活率。

1.5 體外分析腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010的生長抑制作用測定

利用牛津杯抑菌圈法體外測試小菜蛾腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010的生長抑制作用。取EbPXG5菌株于37℃搖床過夜培養(yǎng)，液體LB稀釋菌液至OD600=2.0備用；Bt8010菌株30℃培養(yǎng)8～9 h，液體LB稀釋Bt8010菌液至OD600=0.05后，取1 mL菌液加入100 mL固體LB中，混勻后倒入90 mm培養(yǎng)皿備用。用鑷子夾取無菌牛津杯，將EbPXG5放置在距中心30 mm的含Bt8010菌株的LB平板上，卡那霉素對照放置在平板中間，靜置30 min后，分別取200 μL OD600=2.0的EbPXG5菌液和200 μL含50 mg/mL的卡那霉素(kanamycin,Kan)加入牛津杯中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測定抑菌圈大小。

1.6 腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010在小菜蛾腸道中生長繁殖的影響測定

為了能夠使用抗生素抗性或者熒光來區(qū)分EbPXG5和Bt8010，使用電擊轉(zhuǎn)化法，將pET28a(EGFP)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EbPXG5感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組工程菌pET28a(EGFP)-EbPXG5，取50 μL菌液涂布含50 mg/mL Kan的LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，篩選陽性克隆子。以甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)平板作為選擇性培養(yǎng)基來區(qū)分Bt8010和EbPXG5菌株(Tallentetal.,2012)。配制方法如下：稱取46 g MYP溶于1 L蒸餾水中，分裝于500 mL錐形瓶中，121℃ 15 min滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，每100 mL加入5 mL 50%卵黃乳和2 mL多粘菌素B(10 000 IU)，混勻，倒入90 mm無菌培養(yǎng)皿備用。含Kan的MYP平板制備：待已加入卵黃乳液和多粘菌素B(10 000 IU)的MYP冷卻至觸手不燙時，每100 mL加入100 μL 50 mg/mL Kan，混勻倒平板。分別配制終濃度為OD600=0.05的pET28a(EGFP)-EbPXG5菌株、OD600=0.05的Bt8010菌液和OD600=0.05的Bt8010菌液+OD600=0.05的pET28a(EGFP)-EbPXG5菌株菌液的人工飼料。飼養(yǎng)無菌小菜蛾幼蟲至3齡初期，饑餓4 h，飼喂上述配制好的帶菌飼料，每隔12 h取樣，每個處理隨機(jī)取3組，每組5頭幼蟲。幼蟲表面經(jīng)75%無水乙醇浸泡90 s 后，用無菌水漂洗3次，解剖收集腸道內(nèi)容物于含1 mL無菌水的離心管中，充分震蕩混勻，稀釋至10-1,10-2,10-3,10-4和10-5，各取50 μL涂板，平板培養(yǎng)12 h后拍照，根據(jù)平板菌落數(shù)量，選擇合適的稀釋濃度進(jìn)行菌株單克隆計數(shù)。回復(fù)Bt8010處理組的小菜蛾幼蟲的腸道勻漿液涂布MYP平板，回復(fù)pET28a(EGFP)-EbPXG5處理組涂布含Kan的MYP平板，回復(fù)Bt8010+ pET28a(EGFP)-EbPXG5處理組同時涂布MYP平板和含Kan的MYP平板。

1.7 腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010在小菜蛾血漿中增殖的影響測定

帶菌飼料配制及飼喂處理同1.6節(jié)操作，每隔12 h取樣，每個處理隨機(jī)取3組，每組5頭幼蟲。幼蟲表面經(jīng)75%無水乙醇浸泡90 s后，用無菌水漂洗3次，用解剖鑷輕輕撕開表皮，在不損壞腸道的情況下使血淋巴自然流出，用移液槍吸取至含800 μL無菌水的離心管中，混勻，稀釋至10-1,10-2,10-3,10-4和10-5，各取50 μL涂板，平板培養(yǎng)12 h后拍照。回復(fù)Bt8010處理組的小菜蛾幼蟲的血淋巴涂布MYP平板，回復(fù)pET28a(EGFP)-EbPXG5處理組涂布含Kan的MYP平板，回復(fù)Bt8010+pET28a(EGFP)-EbPXG5處理組同時涂布MYP平板和含Kan的MYP平板，選擇合適的稀釋濃度進(jìn)行菌株單克隆計數(shù)。

1.8 腸道細(xì)菌EbPXG5對小菜蛾腸道的保護(hù)作用測定

分別配制含終濃度為OD600=0.05的EbPXG5菌株、OD600=0.05的Bt8010和(OD600=0.05的Bt8010+OD600=0.05的EbPXG5菌株)的人工飼料。飼養(yǎng)無菌小菜蛾幼蟲至3齡初期，饑餓4 h后飼喂配制好的帶菌飼料24 h，每個處理組中隨機(jī)選取5頭幼蟲，經(jīng)75%無水乙醇浸泡90 s 后，用無菌水漂洗3次，在固定液(2.5%戊二醛)中解剖小菜蛾幼蟲中腸，4℃固定過夜，1×PBS緩沖液漂洗3次，每次8 min；于通風(fēng)櫥中用1%鋨酸固定2 h，1×PBS緩沖液漂洗3次，每次8 min。依次用50%,70%,80%,90%和95%乙醇梯度脫水，每次10 min，100%乙醇脫水20 min，100%丙酮脫水20 min；通風(fēng)櫥內(nèi)醋酸異戊酯浸漬30 min后，用CO2臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥，離子濺射鍍膜，使用Hitachi公司生產(chǎn)的SU3500掃描電子顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對小菜蛾幼蟲存活率進(jìn)行Duncan氏多重比較(Duncan’s multiple range test)分析，若數(shù)據(jù)因方差齊性檢驗(yàn)無齊性時，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。小菜蛾腸道和血淋巴中Bt8010和EbPXG5菌株的單克隆數(shù)量進(jìn)行常用對數(shù)(lgN)轉(zhuǎn)換后使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent samplest-test)進(jìn)行分析，其中由于N值不能為0，因此數(shù)據(jù)分析中將均值≤1的數(shù)值統(tǒng)一賦值1后進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 腸道無菌小菜蛾的構(gòu)建

取卵進(jìn)行表面消毒后第3次漂洗卵的無菌水以及消毒后的卵的研磨液涂布LB平板檢測發(fā)現(xiàn)平板中無細(xì)菌生長(圖1:A)，且卵的研磨液16S rDNA擴(kuò)增無條帶(圖1：B)，表明收集的卵為無菌卵。與對照(FZss)相比，由無菌卵飼養(yǎng)至小菜蛾3齡幼蟲的腸道內(nèi)容物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳檢測無條帶(圖1：C)，表明腸道無菌小菜蛾品系構(gòu)建成功。

2.2 腸道細(xì)菌對小菜蛾Bt敏感性的影響

與取食無菌飼料的對照相比，取食含腸道總菌群(total gut bacteria)和含單一EbPXG5菌株的飼料對小菜蛾3齡幼蟲存活率沒有影響(表1)，但取食含Bt8010+EbPXG5和含Bt8010+腸道總菌群飼料的3齡幼蟲在24,36,48和60 h 4個檢測點(diǎn)的存活率均顯著高于取食含單一Bt8010菌株飼料(P<0.05)(表1)，表明腸道細(xì)菌延長了感染Bt的小菜蛾3齡幼蟲的生存時間。取食含Bt8010+EbPXG5飼料的小菜蛾3齡幼蟲在36,60和72 h 3個檢測點(diǎn)的存活率分別為90%,25%和18%，分別顯著高于取食含Bt8010+腸道總菌群飼料的小菜蛾幼蟲同時刻檢測點(diǎn)的存活率82%,13%和3%(P<0.05) (表1)，表明回復(fù)單一腸道細(xì)菌EbPXG5的小菜蛾比回復(fù)腸道總菌群的小菜蛾幼蟲對Bt的抗性更強(qiáng)。

表1 腸道細(xì)菌對小菜蛾3齡幼蟲Bt敏感性的影響Table 1 Effects of gut bacteria on the Bt susceptibility of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.3 腸道細(xì)菌EbPXG5培養(yǎng)液上清與菌體破碎液對小菜蛾Bt敏感性的影響

取食含EbPXG5菌株上清液和含EbPXG5菌體破碎液飼料的小菜蛾3齡幼蟲存活率與取食無菌飼料的對照組相比無顯著差異(P>0.05)(表2)，表明EbPXG5菌株上清液和菌體破碎液均不影響小菜蛾幼蟲的生存。此外，取食含Bt8010 +EbPXG5菌株上清液和含Bt8010+EbPXG5菌體破碎液飼料的小菜蛾幼蟲存活率與取食含Bt8010飼料的小菜蛾幼蟲相比無顯著差異(P>0.05)(表2)，表明腸道細(xì)菌EbPXG5菌株胞外分泌物和胞內(nèi)物質(zhì)對小菜蛾Bt抗性沒有影響。

表2 腸道細(xì)菌EbPXG5培養(yǎng)液上清與菌體破碎液對小菜蛾3齡幼蟲Bt敏感性的影響Table 2 Effects of culture supernatant and bacterial lysate solution of the gut bacterium EbPXG5 on the Bt susceptibility of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella

2.4 EbPXG5影響B(tài)t8010在小菜蛾腸道中的增殖

不管是取食含單一EbPXG5飼料的小菜蛾3齡幼蟲還是取食含Bt8010+EbPXG5飼料的小菜蛾3齡幼蟲，EbPXG5菌株均能在其腸道中定殖，但在48 h內(nèi)取食兩種飼料的小菜蛾3齡幼蟲腸道EbPXG5菌株的豐度均沒有顯著差異(P>0.05)(圖2:A)。取食含單一Bt8010飼料的小菜蛾，12 h后Bt8010在小菜蛾腸道內(nèi)快速增殖，36 h達(dá)到高峰(圖2:B)，這與Bt8010對小菜蛾的殺蟲效果是一致的(表1)。取食含Bt8010+EbPXG5飼料24,36和48 h的小菜蛾3齡幼蟲腸道內(nèi)Bt8010菌落的豐度顯著低于取食含單一Bt8010飼料(P<0.01)(圖2:B)，表明EbPXG5能夠抑制Bt8010在腸道內(nèi)的生長繁殖。有意思地是，牛津杯抑菌圈試驗(yàn)表明小菜蛾腸道細(xì)菌EbPXG5在體外對Bt8010菌株并無抑制作用(圖2:C)。

圖2 腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010菌株在小菜蛾3齡幼蟲腸道內(nèi)和體外的抑制效應(yīng)Fig.2 Inhibitory effects of the gut bacterium EbPXG5 on Bt8010 strain in the gut of the 3rd instar larvae of Plutella sylostella and in vitroA:小菜蛾幼蟲腸道中EbPXG5的豐度Abundance of EbPXG5 in the gut of P. xylostella larvae;B:小菜蛾幼蟲腸道中Bt8010的豐度Abundance of Bt8010 in the gut of P. xylostella larvae;C:EbPXG5對Bt8010的體外抑制效應(yīng)Inhibitory effect of EbPXG5 on Bt8010 in vitro.Kan:卡那霉素Kanamycin;EbPXG5:腸桿菌EbPXG5 Enterobacter sp.IAE5.圖中的星號代表兩組間在相應(yīng)時間點(diǎn)差異顯著(**P<0.01;***P<0.001) (t檢驗(yàn))；圖3同。Asterisks in the figure indicate significant difference between the two groups at the corresponding time point (**P<0.01;***P<0.001)(t-test).The same for Fig.3.

2.5 EbPXG5影響B(tài)t8010在小菜蛾血淋巴中的豐度

取食含單一EbPXG5飼料的小菜蛾3齡幼蟲，24-48 h內(nèi)幼蟲血淋巴中EbPXG5菌株數(shù)量很少，且數(shù)量保持穩(wěn)定(圖3:A)，表明在正常情況下腸道細(xì)菌EbPXG5菌株很少突破腸道屏障進(jìn)入血淋巴。取食含Bt8010+EbPXG5飼料的小菜蛾，其腸道中EbPXG5菌株的豐度雖然與單一取食EbPXG5沒有顯著差異(P>0.05)(圖2:A)，但在血淋巴中，其36和48 h時的均值均高于單一取食EbPXG5飼料的小菜蛾(圖3:A)，表明EbPXG5菌株可隨Bt8010從被破壞的腸道進(jìn)入血淋巴。取食含單一Bt8010飼料的小菜蛾，12 h后幼蟲血淋巴中Bt8010菌株數(shù)量開始快速增多，36 h后增速放緩，至48 h到達(dá)高峰(圖3:B)，表明Bt8010菌株可破壞腸道屏障進(jìn)入血淋巴發(fā)揮致病作用。取食含Bt8010+EbPXG5飼料的小菜蛾3齡幼蟲血淋巴中Bt8010的豐度顯著低于取食含單一Bt8010飼料的(圖3:B)，表明腸道細(xì)菌EbPXG5菌株的存在抑制了Bt8010的增殖及其進(jìn)入幼蟲血淋巴，進(jìn)而提高了小菜蛾幼蟲的存活率(表1)。

圖3 腸道細(xì)菌EbPXG5影響B(tài)t8010在小菜蛾3齡幼蟲血淋巴中的豐度Fig.3 Gut bacterium EbPXG5 affects the abundance of Bt8010 in the hemolymph of the 3rd instar larvae of Plutella xylostellaA:小菜蛾幼蟲血淋巴中EbPXG5的豐度Abundance of EbPXG5 in the hemolymph of P. xylostella larvae;B:小菜蛾幼蟲血淋巴中Bt8010的豐度Abundance of Bt8010 in the hemolymph of P. xylostella larvae.

2.6 EbPXG5對小菜蛾腸道的保護(hù)作用

掃描電鏡觀察結(jié)果表明，不同細(xì)菌處理的小菜蛾3齡幼蟲，其腸腔內(nèi)壁的形態(tài)不同。取食無菌飼料的小菜蛾幼蟲腸腔內(nèi)壁形態(tài)較為正常(圖4:A)；取食含單一EbPXG5飼料的小菜蛾，其幼蟲腸腔內(nèi)壁定殖了大量的EbPXG5菌株，且腸腔內(nèi)壁較為健康(圖4:B)。取食含單一Bt8010飼料24 h時的小菜蛾幼蟲，其腸腔內(nèi)壁具有明顯的膨脹、破裂現(xiàn)象，且在破裂處觀察到Bt8010菌株的聚集和穿入，表明Bt8010會破壞腸道形成孔洞，同時介導(dǎo)Bt8010及其他細(xì)菌穿越腸道屏障進(jìn)入血淋巴(圖4:C)。取食含EbPXG5+Bt8010飼料的小菜蛾幼蟲腸腔內(nèi)壁形態(tài)與取食無菌飼料小菜蛾相似，均未出現(xiàn)膨脹、破裂的現(xiàn)象，但取食EbPXG5+Bt8010飼料的小菜蛾腸腔內(nèi)壁定殖了大量細(xì)菌(圖4:D)。上述結(jié)果表明，腸道細(xì)菌EbPXG5能夠保護(hù)小菜蛾中腸腸腔內(nèi)壁，減弱Bt8010對其的破壞。

圖4 掃描電子顯微鏡觀察的不同細(xì)菌處理后小菜蛾3齡幼蟲腸道組織Fig.4 Gut tissues of the 3rd instar larvae of Plutella xylostella treated with different bacteria observed under scanning electron microscopeA:無菌小菜蛾幼蟲腸道組織Gut tissues of sterile P. xylostella larvae;B:EbPXG5處理組小菜蛾幼蟲腸道組織Gut tissues of P. xylostella larvae treated with EbPXG5;C:Bt8010處理組小菜蛾幼蟲腸道組織 Gut tissues of P. xylostella larvae treated with Bt8010;D:EbPXG5+Bt8010處理組小菜蛾腸道組織Gut tissues of P. xylostella larvae treated with EbPXG5+Bt8010.

3 討論

抗生素處理消除腸道微生物是探討宿主腸道微生物功能的重要方式，但隨著研究的深入，有關(guān)抗生素處理所導(dǎo)致的宿主生理變化是由于腸道微生物清除引起的還是抗生素本身作用所造成的爭論日益增多。研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)抗生素處理與降低Bt致病性之間存在聯(lián)系(Visweshwaretal.,2015;Orozco-Floresetal.,2017)。宿主幼蟲從人工飼料中攝取的抗生素可以持續(xù)到成蟲階段，并且能夠在至少1種鱗翅目昆蟲中加強(qiáng)對Bt的防御(Sikorowski and Thompson,1985)。另外，抗生素的直接或間接作用如誘導(dǎo)宿主的解毒反應(yīng)可能會降低或消除Bt孢子的萌發(fā)進(jìn)而降低宿主對Bt的敏感性(Johnston and Crickmore,2009)。本研究為消除抗生素處理對小菜蛾的直接效應(yīng)和對Bt8010菌株殺蟲活性的影響，進(jìn)行了腸道無菌小菜蛾體系的構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵的第3次漂洗無菌水有淡淡的條帶，猜測是ddH2O經(jīng)高溫滅菌后水中殘留的少量死亡細(xì)菌的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后放大的結(jié)果，但卵的研磨液擴(kuò)增結(jié)果無條帶，可以證明收集的卵為無菌卵。腸道無菌小菜蛾體系的成功構(gòu)建，排除了抗生素處理的不利影響，使研究結(jié)果更加客觀地體現(xiàn)小菜蛾腸道細(xì)菌在宿主Bt抗性中的功能。

宿主對Bt的敏感性受到多種因素的影響，包括Bt菌株、寄主種類和環(huán)境條件等。近年來，越來越多的研究表明腸道微生物也會影響宿主對Bt的敏感性。據(jù)報道，腸道細(xì)菌在Bt致病性中扮演著相互矛盾的角色。在舞毒蛾Lymantriadispar中腸中發(fā)現(xiàn)Bt對舞毒蛾的殺蟲活性必須依賴于腸桿菌Enterobactersp.NAB3的存在(Brodericketal.,2006)。近期的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，小菜蛾中腸細(xì)菌能夠促進(jìn)Cry1Ac毒素的殺蟲活力，但不是所有細(xì)菌都具有這種效果，比如EnterococcusmundtiiPxG1,CarnobacteriummaltaromaticumPxCG2和AcinetobacterguillouiaePxCG3顯著提高了Cry1Ac的殺蟲活力，但EnterobactercancerogenusPxG2,EnterobacterbugandensisPxG11 以及StaphylococcuswarneriPxCG4則對Cry1Ac毒素的殺蟲活力沒有影響(Lietal.,2021)。相反地，另外一些研究則發(fā)現(xiàn)Bt對宿主的殺蟲活性不依賴于腸道細(xì)菌，但腸道細(xì)菌的存在可以給宿主幼蟲提供保護(hù)，進(jìn)而使感染了Bt的幼蟲死亡率下降(Johnston and Crickmore,2009;Raymondetal.,2009)。我們的研究結(jié)果表明，Bt對小菜蛾的致病性不依賴于腸道細(xì)菌，但腸道細(xì)菌的存在能夠影響小菜蛾對Bt的敏感性，腸桿菌EbPXG5可提高小菜蛾對Bt的抗性。為什么不同研究的結(jié)果會出現(xiàn)不一致？其原因可能是由于不同的宿主特異性、腸道菌特異性，以及研究是針對Bt毒素還是Bt菌株等原因造成的。當(dāng)前隨著研究的深入，腸道微生物的功能已經(jīng)進(jìn)入株系的水平，即使是同種微生物，其不同株系也有可能表現(xiàn)出完全不同的功能和活性，如不同株系的沙雷氏菌SerratiaY1和SerratiaJ1在中華按蚊Anophelessinensis腸道的定殖對宿主免疫系統(tǒng)的激活作用不同，從而介導(dǎo)宿主對瘧原蟲Plasmodiumberghei不同的抗性(Baietal.,2019)。這些研究結(jié)果為基于腸道微生物的害蟲生防策略開發(fā)提供了新的理解和思路。

定殖抗性是防止病原體入侵宿主并占據(jù)生態(tài)位的關(guān)鍵，腸道共生菌通過競爭生態(tài)位、競爭營養(yǎng)、接觸致死、產(chǎn)生拮抗分子或激活宿主免疫反應(yīng)等直接或間接機(jī)制介導(dǎo)宿主對入侵病原體的定殖抵抗(Jacobsonetal.,2018)。本研究中，體外牛津杯抑菌圈試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小菜蛾腸道細(xì)菌EbPXG5對Bt8010菌株的生長無抑制作用，且EbPXG5菌株的胞外分泌物和胞內(nèi)菌體蛋白對小菜蛾的Bt抗性沒有影響，但取食含EbPXG5與Bt8010飼料的小菜蛾腸道和血淋巴中Bt8010菌株的數(shù)量被顯著抑制，推測EbPXG5可能不是通過抑制Bt菌株的生長或產(chǎn)生代謝分泌物抑制Bt等方式直接提高小菜蛾對Bt的抗性，而是可能與Bt8010菌株競爭生態(tài)位，其在腸道內(nèi)的大量定殖擠占了Bt8010菌株的空間，從而降低Bt8010在腸道內(nèi)的定殖。小菜蛾腸道細(xì)菌的定殖抗性，能夠限制病原體在宿主體內(nèi)的定殖與傳播，該結(jié)論與Shan等(2014)報道的結(jié)果不同，其研究表明大部分金龜子甲蟲如Holotrichiaoblita,H.parallela和Anomalacorpulenta腸道細(xì)菌對Bt具有體外直接抗菌活性，其腸道細(xì)菌可能會通過抑制Bt菌株生長的方式直接介導(dǎo)金龜子甲蟲對Bt的敏感性；Niu等(2016)的研究結(jié)果則與我們的相似，其研究發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans在感染條件致病菌后，宿主體內(nèi)的某些腸道共生菌成為腸道優(yōu)勢微生物區(qū)系，線蟲腸道共生菌利用競爭生態(tài)位的方式抵抗入侵病原細(xì)菌在腸道的定殖。值得注意的是，本研究中使用pET28a(EGFP)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EbPXG5構(gòu)建重組工程菌pET28a(EGFP)-EbPXG5用于研究EbPXG5在腸道和血淋巴中的分布，原本是希望利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的熒光以及pET28a的卡那霉素抗性的雙重標(biāo)準(zhǔn)來準(zhǔn)確定位和鑒定EbPXG5。本研究中，可能由于EbPXG5缺乏pET28a(EGFP)載體表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)錄因子，所以不能表達(dá)EGFP蛋白，但卻可以表達(dá)卡那霉素抗性基因，因此在后期的研究中，我們僅使用了卡那霉素抗性這一特征對EbPXG5進(jìn)行鑒別。另外一點(diǎn)，我們目前尚不知道pET28a(EGFP)質(zhì)粒是否會影響EbPXG5的生理生化特性，進(jìn)而影響其與宿主和Bt8010的互作，從而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偏差，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步確認(rèn)pET28a(EGFP)質(zhì)粒的引入是否會對EbPXG5的功能產(chǎn)生影響。

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)EbPXG5能定殖于小菜蛾腸腔內(nèi)壁，減弱Bt8010對腸道內(nèi)壁的破壞；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EbPXG5菌株能夠在小菜蛾腸道內(nèi)定殖，并在腸道上皮形成穩(wěn)定的生物膜(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)，推測EbPXG5菌株很有可能以其腸腔定殖形成的生物膜作為物理屏障，阻止Bt8010產(chǎn)生的Bt毒素與中腸上皮受體蛋白的結(jié)合，進(jìn)而降低Bt8010在血淋巴中的豐度。切葉蟻Acromyrmexoctospinosus中的研究發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)放線菌(共生菌)的豐度隨病原真菌感染的增加而增加，且由放線菌定殖形成的生物膜結(jié)構(gòu)可以防止病原真菌孢子與切葉蟻外骨骼的接觸，從而保護(hù)宿主免受病原真菌的入侵(Currieetal.,2003)。

昆蟲腸道作為一個開放的內(nèi)環(huán)境，含有非常豐富的微生物，經(jīng)過長期的進(jìn)化，這些微生物與宿主之間形成了穩(wěn)定的共生關(guān)系。這種穩(wěn)態(tài)的持久存在，意味著宿主體內(nèi)具有調(diào)節(jié)共生菌群穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，以避免腸道微生物不受控制地增殖及對宿主的致病作用。腸道微生物的負(fù)荷可誘導(dǎo)宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)以恢復(fù)腸道細(xì)菌的穩(wěn)態(tài)平衡，確保宿主與腸道微生物的互惠共生(Hapfelmeieretal.,2010)；玉米象SitophiluszeamaisPGRP基因家族中wPGRP基因的表達(dá)取決于腸道共生菌的生長，這可能是宿主通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)來控制腸道共生菌數(shù)量和位置的策略(Anselmeetal.,2006;Haine,2008)。此外，小鼠Musmusculus腸道共生菌能夠激活MyD88介導(dǎo)的免疫信號通路，該通路誘導(dǎo)產(chǎn)生的殺菌凝集素(RegIIIγ)可增強(qiáng)宿主對入侵病原菌的抵抗力(Brandletal.,2007)。我們的研究發(fā)現(xiàn)EbPXG5的增殖抑制了Bt8010在中腸的豐度，推測EbPXG5的大量增殖很有可能打破其在中腸的生態(tài)位平衡進(jìn)而誘導(dǎo)小菜蛾中腸免疫反應(yīng)來控制EbPXG5的數(shù)量，與此同時，中腸免疫產(chǎn)生的效應(yīng)分子可能對Bt8010具有抑制作用，從而介導(dǎo)小菜蛾對Bt的抗性。甜菜夜蛾Spodopteraexigua的研究發(fā)現(xiàn)，中腸細(xì)菌的負(fù)荷使甜菜夜蛾處于免疫激活狀態(tài)，進(jìn)而提高甜菜夜蛾對Bt的耐受性(Hernández-Martínezetal.,2010)。相反地，Bt可通過抑制免疫相關(guān)基因來逃避小菜蛾的免疫防御反應(yīng)(Lietal.,2018)。我們前期的研究也表明Bt8010會抑制小菜蛾中腸的免疫應(yīng)答，其中與模式識別受體、Toll和IMD信號通路有關(guān)的免疫相關(guān)基因如：CTL1,PGRP-SA1,Toll9-1,Toll9-2和Sp?tzle等被顯著抑制(Linetal.,2020)。本研究中EbPXG5是否能通過誘導(dǎo)小菜蛾中腸免疫反應(yīng)來打破Bt8010對小菜蛾的免疫逃避，從而抑制Bt8010的定殖是一個值得研究的問題，需要后續(xù)進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本研究揭示了腸道細(xì)菌在介導(dǎo)小菜蛾Bt敏感性方面的重要作用，并以影響宿主Bt抗性的腸道細(xì)菌EbPXG5為模型，從不同角度解析了EbPXG5影響小菜蛾Bt敏感性的效應(yīng)和潛在機(jī)制。首先，EbPXG5可能通過產(chǎn)生定殖抗性，一方面減少Bt8010菌株在腸道內(nèi)的定殖，另一方面以定殖形成的生物膜作為物理屏障，阻斷Bt毒素與中腸上皮受體的結(jié)合以保護(hù)小菜蛾腸道內(nèi)壁的完整性。其次，腸道細(xì)菌EbPXG5可能激活小菜蛾的中腸免疫，而中腸免疫產(chǎn)生的效應(yīng)分子會抑制Bt8010的增殖。這些潛在作用機(jī)制仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究，闡明這些機(jī)理，不僅能夠豐富腸道細(xì)菌介導(dǎo)的Bt抗性理論，促進(jìn)腸道微生物與宿主的互作和共進(jìn)化研究，同時對未來基于腸道細(xì)菌的害蟲綜合治理也具有重要意義。