苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾幾丁質(zhì)酶基因(SlCht)和幾丁質(zhì)合成酶基因(SlCHS-A)表達(dá)及其生長發(fā)育的影響

張展滔,林曉菊,辜曉婷,葉凱翔,張偉釗,金豐良,許小霞

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

斜紋夜蛾Spodopteralitura是世界性害蟲，危害棉花Gossypiumspp.、煙草Nicotianatabacum、大豆Glycinemax以及十字花科(Brassicaceae)蔬菜等近百種經(jīng)濟(jì)作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失(Yanetal.,2020)。目前，化學(xué)農(nóng)藥仍是防治斜紋夜蛾的主要手段，近年來的研究表明，斜紋夜蛾對有機(jī)磷酸鹽、氨基甲酸酯等殺蟲劑產(chǎn)生了抗性(Wangetal.,2018)。因此，開發(fā)綠色無公害且不易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗性的植物源殺蟲劑以防治斜紋夜蛾的研究愈發(fā)受到關(guān)注。

在昆蟲中，幾丁質(zhì)(chitin)是構(gòu)成體壁、中腸圍食膜、唾液腺、氣管生殖管等的重要組成成分，在維持昆蟲機(jī)體和組織形態(tài)、免疫防御和變態(tài)發(fā)育等方面起著重要的作用。因此，幾丁質(zhì)的降解和合成對昆蟲生長發(fā)育十分關(guān)鍵。昆蟲幾丁質(zhì)酶(chitinase,Cht)屬于糖苷水解酶18家族(GH18)，主要作用于幾丁質(zhì)的降解過程。昆蟲幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase,CHS)則主要作用于幾丁質(zhì)的合成過程(Merzendorfer and Zimoch,2003)。

苦瓜素(momordicin)是從苦瓜Momordicacharantia莖葉提取獲得的葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，而苦瓜素Ⅰ(momordicin Ⅰ)是主要的苦瓜素類化合物，對多種害蟲表現(xiàn)殺蟲活性，具有極大的殺蟲劑開發(fā)價值(曹溪等,2015)。苦瓜素Ⅰ與葫蘆素的結(jié)構(gòu)相似，對昆蟲的作用機(jī)制可能是干預(yù)了昆蟲蛻皮激素的生物合成(凌冰等,2010)，但是目前尚未有基于幾丁質(zhì)的生物合成降解通路研究苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾作用機(jī)制的報(bào)道。為此，本研究通過RT-qPCR檢測斜紋夜蛾幾丁質(zhì)酶基因SlCht(GenBank登錄號:AY326456)和幾丁質(zhì)合成酶基因SlCHS-A(GenBank登錄號:LOC111352231)的時空表達(dá)模式，檢測了苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A表達(dá)的影響，并利用顯微注射技術(shù)研究苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾生長發(fā)育的影響，以期明確苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾的殺蟲活性是否與干擾幾丁質(zhì)的合成和降解相關(guān)，為闡明苦瓜素對斜紋夜蛾生長發(fā)育的抑制機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

斜紋夜蛾是從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場獲取卵塊，并在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)飼養(yǎng)10代以上的種群，飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃、相對濕度70%～80%、光周期14L∶10D，飼養(yǎng)方法與人工飼料參照駱穎等(2012)。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；實(shí)時熒光定量PCR試劑盒TB Green Premix Ex Taq Ⅱ購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 苦瓜素Ⅰ的制備

收集成熟苦瓜葉片，洗凈晾干，研磨成粉。用分析純甲醇浸提苦瓜莖葉干粉24 h后，滲出濾液，可反復(fù)浸提后再合并濾液。濾液用0.22 μm濾膜過濾初步提純后，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，得到苦瓜素甲醇粗提物。對粗提物進(jìn)行三級高效液相色譜分離(流動相為80%甲醇和20% ddH2O)。經(jīng)過最終的三級高效液相色譜分離，可收集到目標(biāo)時間段的流出液，流出液經(jīng)干燥濃縮后得到苦瓜素Ⅰ晶體。經(jīng)過液質(zhì)鑒定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由該方法提取到的苦瓜素Ⅰ晶體純度大于99%。此苦瓜素Ⅰ分離方法已經(jīng)獲得授權(quán)專利(許小霞等,2021)。用100%DMSO溶液配制苦瓜素Ⅰ濃度為4 mg/mL的儲藏液，將配制好的不同濃度苦瓜素Ⅰ放至4℃冰箱保存。

1.4 SlCht和SlCHS-A系統(tǒng)發(fā)育分析

通過CDD數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對斜紋夜蛾幾丁質(zhì)生物合成降解通路中的SlCht(GenBank登錄號:AY326456)和SlCHS-A(GenBank登錄號:111352231)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；通過ClustalX和MEGA 11軟件分別進(jìn)行序列比對，采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建基于氨基酸序列的斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A及其他鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和雙翅目物種的Cht和CHS-A蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A的時空表達(dá)模式檢測

選取健康發(fā)育一致的斜紋夜蛾，分別收集卵、幼蟲(幼蟲期第1-18天)、預(yù)蛹、蛹和成蟲樣品；分別收集4-6齡第1天幼蟲樣品后，于磷酸緩沖液溶液(PBS)中清洗干凈，用解剖刀剪去腹足，在裝有200 μL PBS的離心管收集血淋巴，4℃下5 000 r/min離心10 min，收集的沉淀為血細(xì)胞。進(jìn)一步在PBS中解剖獲得5種組織(體壁、中腸、脂肪體、頭部和馬氏管)，用研磨器研磨后用Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix說明書操作，取2.0 μg總RNA作為模板，合成cDNA第1鏈。

基于斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A序列，用Primer Premier 3軟件設(shè)計(jì)引物:SlCht-F:5′-TAGTTTC GCAAAGATACTCCC-3′;SlCht-R:5′-TAATACTTTC AGACGGTTTGCT-3′;SlCHS-A-F:5′-GAATATTCG CATTCGACCAC-3′;SlCHS-A-R:5′-TGTGACGAATC TTTGCCTTA-3′。以斜紋夜蛾GADPH(GenBank登錄號:HQ012003)為內(nèi)參基因(Luetal.,2013)，引物序列為GADPH-F:5′-GGGTATTCTTGACTACAC-3′；GADPH-R:5′-CTGGATGTACTTGATGAG-3′。RT-qPCR反應(yīng)體系(25 μL):5×cDNA模板2 μL,上下游引物(10 mmol/L)各1 μL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序:94℃ 30 s;94℃ 15 s,60℃ 20 s,72℃ 30 s,40次循環(huán)。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)取自30頭蟲。

1.6 苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A的表達(dá)影響測定

選取同一批次齡期一致、發(fā)育良好的6齡第1天斜紋夜蛾幼蟲，用顯微注射器(Eppendorf FemtoJet 4x)向斜紋夜蛾6齡幼蟲注射1 μL苦瓜素Ⅰ(4 mg/mL)，顯微注射方法參照趙海珍等(2006)的方法進(jìn)行，注射后的幼蟲放在果凍杯內(nèi)(直徑6.7 cm，高3.6 cm)單頭飼養(yǎng)和觀察。每組30頭試蟲，設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)。在注射后24,48和72 h內(nèi)收集樣品，先收集血細(xì)胞后解剖蟲體，獲得體壁、中腸、脂肪體、頭部和馬氏管，樣品于-80℃保存。總RNA的提取、cDNA的合成和RT-qPCR檢測參照1.5節(jié)進(jìn)行。

1.7 苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾的生長發(fā)育影響測定

在長方形飯盒(長×寬×高=17 cm×11.5 cm×5.6 cm)盒蓋中央剪出一個長約為11 cm，寬約為4 cm的長方形口，蓋盒蓋時用長度適宜的紙巾封住方形口；每天定時更換飼料和清潔飼養(yǎng)環(huán)境。參照駱穎等(2012)的方法，并稍作改進(jìn)，在飼養(yǎng)盒飼養(yǎng)斜紋夜蛾，在飼養(yǎng)盒(長×寬×高=17 cm×11.5 cm×5.6 cm)內(nèi)接入200頭左右在24 h內(nèi)孵出的健康斜紋夜蛾幼蟲，重復(fù)3盒。每天定時觀察幼蟲生存狀況，清潔環(huán)境并更換飼料。用二甲基亞砜(DMSO)將苦瓜素Ⅰ(4 mg/mL)依次稀釋為31.25,62.5,125,250和500 μg/mL，并保持DMSO在不同濃度苦瓜素Ⅰ中的終濃度為5%，選擇發(fā)育正常、個體大小一致的4齡幼蟲，先按順序?qū)ζ浞Q重并記錄，以只注射5% DMSO為對照。顯微注射方法參照趙海珍等(2006)的方法進(jìn)行，用顯微注射器在斜紋夜蛾4齡幼蟲的第2和第3對腹足之間注射，針頭朝向蟲頭部，在腹部側(cè)面注入1 μL的苦瓜素Ⅰ藥液，以5% DMSO溶液作對照，每個處理4齡幼蟲30頭，處理重復(fù)3次。在注射過程中因注射失誤造成重傷或死亡的幼蟲全部舍去。注射后的幼蟲在果凍杯內(nèi)(直徑6.7 cm，高3.6 cm)單頭飼養(yǎng)。每天定時觀察和記錄試蟲的存活、蛻皮和表型變化等情況，并且在處理后的2,4和6 d計(jì)算各處理組活蟲的體重，以及幼蟲和蛹?xì)v期、幼蟲增重、蛹重、蛹長度、化蛹率、羽化率和存活率(駱穎等,2012;曹溪等,2015)。幼蟲增重=每時段幼蟲體重-幼蟲初始體重；體重增重抑制率(%)=對照組幼蟲增重-處理組幼蟲增重)/(處理組幼蟲增重)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用軟件SPSS(IBM SPSS Statistic 25)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用Duncan氏檢驗(yàn)及單因素方差分析(one-way ANOVA)和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。使用OriginPro 2022對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 SlCht和SlCHS-A的系統(tǒng)發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)表明，斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A及鱗翅目其他物種的Cht和CHS-A蛋白高度保守，推測它們的功能在鱗翅目中也具有高度相似性。

圖1 基于氨基酸序列構(gòu)建的斜紋夜蛾及其他昆蟲物種Cht (A)和CHS-A(B)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)Fig.1 Phylogenetic tree of Cht (A) and CHS-A (B) proteins from Spodoptera litura and other insect species based on the amino acid sequence (neighbor-joining method)標(biāo)尺示遺傳距離。Scale bars indicate the genetic distance.

2.2 SlCht和SlCHS-A的發(fā)育表達(dá)模式

如圖2所示，SlCht和SlCHS-A的發(fā)育表達(dá)模式較為接近，在卵期的表達(dá)量最高，是幼蟲期、預(yù)蛹期表達(dá)量的4倍左右。SlCht和SlCHS-A在幼蟲期的表達(dá)量隨著生長時間和齡期的變化而變化，在6齡幼蟲期的表達(dá)量最高，在其他幼蟲齡期表達(dá)量低；此外，在1-5齡幼蟲期的表達(dá)呈現(xiàn)齡初低，齡末升高的模式。圖2結(jié)果也表明斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A在蛹期和成蟲期的表達(dá)還與性別相關(guān)，這兩個基因在雄蛹中的表達(dá)量高于雌蛹中的表達(dá)量，而雄成蟲中的表達(dá)量比雌成蟲中的低。

圖2 斜紋夜蛾不同發(fā)育階段SlCht(A)和SlCHS-A(B)的表達(dá)量Fig.2 Expression levels of SlCht (A) and SlCHS-A (B) at different developmental stages of Spodoptera lituraEg:卵Egg;D1-4:分別為1齡第1-4天幼蟲Day 1-4 1st instar larva,respectively;D5-7:分別為2齡第1-3天幼蟲Day 1-3 2nd instar larva,respectively;D8-9:分別為3齡第1和2天幼蟲Day 1 and 2 3rd instar larva,respectively;D10-12:分別為4齡第1-3天幼蟲Day 1-3 4th instar larva,respectively;D13-15:分別為5齡第1-3天幼蟲Day 1-3 5th instar larva,respectively;D16-18:6齡第1-3天幼蟲Day 1-3 6th instar larva,respectively;Pp:預(yù)蛹Prepupa;Fp:雌蛹Female pupa;Mp:雄蛹Male pupa;Fa:雌成蟲Female adult;Ma:雄成蟲Male adult.圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；柱上不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05,單因素方差分析，Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法)。Data in the figure are mean±SE(n=3).Different small letters above bars indicate significant difference (P≤0.05,one-way ANOVA,Duncan’s new multiple range test).圖3同。The same for Fig.3.

2.3 SlCht和SlCHS-A的組織表達(dá)模式

結(jié)果如圖3，斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A在4-6齡幼蟲期都有表達(dá)，且在同一齡期不同組織中的表達(dá)不一致。SlCht和SlCHS-A在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，在體壁中的表達(dá)量次之，在馬氏管中的表達(dá)量最低。SlCht和SlCHS-A在血細(xì)胞中表達(dá)量是在體壁中的2倍，分別是在馬氏管中的278.5和130.2倍，這2個基因在兩組織間的表達(dá)量均差異顯著(P≤0.05)。

圖3 斜紋夜蛾4-6齡幼蟲不同組織中SlCht(A)和SlCHS-A(B)的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of SlCht (A) and SlCHS-A (B) in different tissues of the 4th-6th instar larvae of Spodoptera lituraIt:體壁Integument;Mg:中腸Midgut;Fb:脂肪體Fat body;He:血細(xì)胞Hemocyte;Hd:頭部Head;Mt:馬氏管Malpighian tubules.圖4同The same for Fig.4.

2.4 苦瓜素Ⅰ對SlCht和SlCHS-A表達(dá)的影響

選擇健康的斜紋夜蛾6齡第1天幼蟲注射4 μg/頭苦瓜素Ⅰ后，與對照組(注射5% DMSO)比較，幼蟲體壁、中腸、脂肪體、血細(xì)胞、頭部和馬氏管中SlCht和SlCHS-A的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，但程度存在差異?？喙纤丌裉幚硇奔y夜蛾后24 h時，體壁(P≤0.001)、中腸(P≤0.01)、脂肪體(P≤0.001)、頭部(P≤0.001)和馬氏管(P≤0.05)內(nèi)SlCht基因表達(dá)量極顯著低于對照組(圖4:A)，體壁(P≤0.01)、中腸(P≤0.05)、脂肪體(P≤0.01)和馬氏管(P≤0.05)中SlCHS-A基因表達(dá)量顯著低于對照組(圖4:B)；處理后48 h時，SlCht在體壁(P<0.05)、血細(xì)胞(P≤0.01)、頭部(P≤0.05)和馬氏管(P≤0.001)內(nèi)表達(dá)量顯著低于對照組(圖4:C)，脂肪體(P≤0.001)、血細(xì)胞(P≤0.001)、頭部(P≤0.01)和馬氏管(P≤0.01)中SlCHS-A表達(dá)量顯著低于對照組(圖4:D)；處理后72 h時，SlCht基因在頭部(P≤0.001)、中腸(P≤0.001)和馬氏管(P≤0.01)中表達(dá)量顯著低于對照組(圖4:E)，脂肪體(P≤0.05)和血細(xì)胞(P≤0.01)中SlCHS-A表達(dá)量顯著低于對照組(圖4:F)。

圖4 注射苦瓜素Ⅰ(4 μg/頭) 24(A,B),48 (C,D)和72 h (E,F)后斜紋夜蛾6齡幼蟲SlCht(A,C,E)和SlCHS-A(B,D,F)的組織表達(dá)譜Fig.4 Tissue expression profiles of SlCht (A,C,E) and SlCHS-A (B,D,F) in the 6th instar larvae of Spodoptera litura at 24 (A,B),48 (C,D) and 72 h (E,F) after injection with momordicin I (4 μg/individual)處理組中每幼蟲中注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/頭)，對照組中每幼蟲注射同體積(1 μL) 5% DMSO溶液。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；柱上星號表示兩組間差異顯著(*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001)(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Each larva in the treatment group was injected with momordicin I solution (4 μg/individual) and that in the control group was injected with 5% DMSO solution of the same volume (1 μL).Data in the figure are mean±SE (n=3).Asterisks above bars indicate significant difference between two groups (*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001)(independent samples T-test).

2.5 苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾生長發(fā)育的抑制作用

以濃度為31.25,62.5,125,250和500 ng/頭的苦瓜素Ⅰ注射斜紋夜蛾4齡第1天幼蟲，對幼蟲增重有明顯的抑制作用，處理后2和6 d時，各濃度處理的幼蟲增重均顯著低于對照組(5% DMSO)(P<0.05)；苦瓜素Ⅰ處理后4 d時，只有125和500 ng/頭濃度處理的試蟲的體重增重均顯著低于對照組(P<0.05)。在5個濃度處理組中，苦瓜素Ⅰ處理后2 d時的體重增重抑制率依次為24.81%,20.75%,24.61%,18.30%和28.08%,6 d時分別為9.99%,22.12%,19.31%,22.92%和16.94%，可以看出，500 ng/頭處理組處理后2 d時的抑制效果最佳(圖5)。通過計(jì)算，在所用的苦瓜素Ⅰ濃度內(nèi)，斜紋夜蛾幼蟲的體重增重抑制率均沒有濃度依賴性。

圖5 注射不同濃度苦瓜素Ⅰ不同天數(shù)后斜紋夜蛾4齡幼蟲的體重增重Fig.5 Body weight gain of the 4th instar larvae of Spodoptera litura at different days after injection with different concentrations of momordicin ⅠCK:5% DMSO.圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=30)；相同顏色柱上不同字母表示同一天不同濃度處理間幼蟲增重的差異顯著(P≤0.05，單因素方差分析,Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法)。Data in the figure are mean±SE (n=30).Different letters on the same color bar indicate significant differences in the larval weight gain between treatments of different concentrations on the same day (P≤0.05,one-way ANOVA,Duncan’s new multiple range test).

濃度為250和500 ng/頭苦瓜素Ⅰ處理2,4和6 d,4,5和6齡幼蟲歷期均比對照組(5% DMSO)顯著延長(P≤0.05)。這兩組處理組4-6齡幼蟲歷期分別比對照組幼蟲歷期延長了0.90和1.09 d。只有500 ng/頭苦瓜素Ⅰ注射斜紋夜蛾蛹后，對蛹?xì)v期有顯著的影響，其蛹?xì)v期比對照組延長了0.85 d(F=5.217,P<0.001)(表1)。結(jié)果表明500 ng/頭苦瓜素Ⅰ注射處理斜紋夜蛾對斜紋夜蛾4齡到成蟲前的整個歷期的影響最顯著。

表1 注射不同濃度苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾4-6齡幼蟲及蛹發(fā)育歷期的影響Table 1 Effects of injection of different concentrations of momordicin Ⅰ on the developmental duration of the 4th-6th instar larvae and pupae of Spodoptera litura

濃度為 500 ng/頭苦瓜素Ⅰ處理斜紋夜蛾4齡幼蟲后，蛹重、蛹長度和化蛹率顯著低于對照組(表2)，這表明苦瓜素Ⅰ不僅抑制斜紋夜蛾幼蟲的體重增重和發(fā)育進(jìn)度，而且對斜紋夜蛾蛹重、蛹長度和化蛹率具有一定的抑制作用。不過各濃度處理對斜紋夜蛾存活率和羽化率的影響并不顯著。

表2 斜紋夜蛾4齡幼蟲中注射不同濃度苦瓜素Ⅰ對蛹重、蛹長度、化蛹率、羽化率和存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of momordicin Ⅰ injected into the 4th instar larvae of Spodoptera litura on the pupal weight,pupal length,pupation rate,emergence rate and survival rate

將各個濃度苦瓜素Ⅰ處理斜紋夜蛾過程中均發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲和蛹出現(xiàn)畸形。其中濃度為500 ng/頭苦瓜素Ⅰ處理斜紋夜蛾4齡幼蟲后，斜紋夜蛾幼蟲及蛹出現(xiàn)畸形率最高，達(dá)到30%的概率(圖6)。斜紋夜蛾幼蟲出現(xiàn)了雙體壁的畸形表現(xiàn)，蛻下的舊體壁沒有脫離蟲體，束縛了幼蟲的生長發(fā)育(圖6:E)；部分斜紋夜蛾幼蟲出現(xiàn)了嚴(yán)重的拒食現(xiàn)象，引發(fā)蟲體皺縮(圖6:F)。

斜紋夜蛾的畸形表現(xiàn)主要集中在蛹期。斜紋夜蛾蛹出現(xiàn)觸角部分偏離其原附著部位(圖6:G)或是存在沿著觸角甚至胸足附著部位的裂縫(圖6:H)，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)這些蛹大部分能羽化。部分斜紋夜蛾蛹的翅部畸形表現(xiàn)如圖6(I,J)。圖6(I)中的蛹的翅部體壁發(fā)育較短，露出較軟的乳白色里層；而圖6(J)中的蛹畸形最嚴(yán)重，具有致死性，蛹的頭胸部整個內(nèi)縮嚴(yán)重，翅部體壁向頭部皺縮，大面積露出內(nèi)里，頭胸部的組織、器官發(fā)育嚴(yán)重受阻，最終蛹死亡。圖6(K-P)是幼蟲化蛹失敗的現(xiàn)象。幼蟲化蛹時蛻皮失敗，大部分舊體壁包圍著蛹形成半蛹半幼蟲的畸形狀態(tài)。以上圖片結(jié)果表明了苦瓜素Ⅰ能干擾斜紋夜蛾幼蟲的蛻皮過程并且影響化蛹過程及蛹的發(fā)育。

圖6 在斜紋夜蛾4齡幼蟲中注射500 ng/頭苦瓜素Ⅰ引起幼蟲和蛹畸形Fig.6 Injection of 500 ng/individual momordicin Ⅰ into the 4th instar larvae of Spodoptera litura results in larval and pupal malformation照片在LEICA體視顯微鏡下拍攝Photos were taken under LEICA stereoscopic microscope.A:健康4齡末期幼蟲Healthy late 4th instar larva;B,C:健康蛹的頭胸部Head and thorax of healthy pupa;D:健康蛹的腹部Abdomen of healthy pupa;E,F:異常幼蟲Abnormal larvae;G,H:觸角異常的蛹Pupae with abnormal antenna;I,J:頭胸部異常的蛹Pupae with abnormal head and thorax;K-M:蛻皮失敗的蛹頭胸部Head and thorax of pupae that failed to molt;N-P:蛻皮失敗的蛹的腹部Abdomen of pupae that failed to molt.

3 討論

本研究利用RT-qPCR檢測了斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A在各個發(fā)育階段(卵、幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲)和4-6齡幼蟲6種組織(體壁、中腸、脂肪體、血細(xì)胞、頭部和馬氏管)中的表達(dá)情況(圖2和3)。RT-qPCR結(jié)果表明斜紋夜蛾SlCht和SlCHS-A基因的表達(dá)具有發(fā)育特異性和組織特異性。SlCht和SlCHS-A在卵期特異性高表達(dá)，在幼蟲期和預(yù)蛹期表達(dá)量較低；在不同的幼蟲期，SlCht和SlCHS-A在6齡幼蟲特異性高表達(dá)，在1-5齡幼蟲期的表達(dá)量低且呈現(xiàn)齡初低、齡末高的表達(dá)模式(圖2)。昆蟲幾丁質(zhì)酶的表達(dá)在蛻皮前達(dá)到高峰(李瑤和范曉軍,2011)。張群玲等(1999)研究表明斜紋夜蛾產(chǎn)卵以后87 h內(nèi)進(jìn)行胚胎發(fā)育過程，形成體壁、各種微管及中腸等結(jié)構(gòu)。因此，這些現(xiàn)象說明SlCht和SlCHS-A與斜紋夜蛾的胚胎發(fā)育、幼蟲到幼蟲的蛻皮過程以及幼蟲到蛹變態(tài)過程有關(guān)。SlCht和SlCHS-A在多個組織中都有檢測到表達(dá)，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，在體壁中的表達(dá)量次之，在馬氏管中的表達(dá)量最低(圖3)。SlCht和SlCHS-A基因在血細(xì)胞中特異性高表達(dá)說明這兩種基因除了參與體壁和中腸圍食膜中的幾丁質(zhì)降解與合成外，還存在著其他生理功能。

本研究中，斜紋夜蛾在注射 4 μg/頭苦瓜素Ⅰ劑量下，其體壁、中腸、脂肪體、頭部、血細(xì)胞和馬氏管中的SlCht和SlCHS-A的表達(dá)被誘導(dǎo)下調(diào)(圖4)。研究還發(fā)現(xiàn)，在500 ng/頭低注射劑量下，苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾幼蟲的生長發(fā)育具有抑制作用，幼蟲體重增重受到抑制(圖5)，4-6齡幼蟲和蛹的歷期延長，蛹體重下降，化蛹率降低以及幼蟲后出現(xiàn)了幼蟲蛻皮異常、化蛹失敗、蛹翅部畸形嚴(yán)重等現(xiàn)象(表1和2;圖6)。這表明了苦瓜素Ⅰ干擾斜紋夜蛾的蛻皮過程以及幼蟲-蛹-成蟲的變態(tài)發(fā)育過程，而苦瓜素Ⅰ對斜紋夜蛾的抑制作用可能是引起斜紋夜蛾蛻皮失敗、由中腸結(jié)構(gòu)損壞而導(dǎo)致的拒食、蛹發(fā)育不良等現(xiàn)象的原因之一。由于幾丁質(zhì)的生物合成和降解途徑復(fù)雜嚴(yán)密，苦瓜素對斜紋夜蛾幾丁質(zhì)的影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究，并且SlCht和SlCHS-A基因的功能還待進(jìn)一步確定。