熵權(quán)法結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝

雷欣荷 陳昕 孟江 孫悅 王淑美

中圖分類號(hào) R283.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）02-0165-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.07

摘 要 目的 優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。方法 以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量，色差值，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，采用熵權(quán)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以水鹽比例、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度、炒制時(shí)間為考察因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。結(jié)果 最優(yōu)橘核鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤(rùn)時(shí)間22 min、炒制時(shí)間9 min、炒制溫度158 ℃。經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化所得工藝的平均綜合評(píng)分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測(cè)值（93.25分）的相對(duì)誤差為1.10%。結(jié)論 所得最優(yōu)鹽炙工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 橘核;鹽炙工藝;熵權(quán)法;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法;含量測(cè)定

Optimization of stir-frying with saltwater technology of Citrus reticulata by entropy weight method combined with central composite design-response surface method

LEI Xinhe，CHEN Xin，MENG Jiang，SUN Yue，WANG Shumei[School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University/Key Lab of Digital Quality Evaluation Technology of Traditional Chinese Medicine， State Administration of Traditional Chinese Medicine/Quality Engineering Technology Research Center of Traditional Chinese Medicine in Colleges and Universities of Guangdong （Provincial） Department of Education，Guangzhou 510006，China]

ABSTRACT ? OBJECTIVE To optimize stir-frying with saltwater technology of Citrus reticulata. METHODS Taking the contents of limonin， nomilin and obacunone， color difference value and free radical scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine （DPPH） as the indexes， the entropy weight method was used for comprehensive evaluation. The stir-frying with saltwater technology of C. reticulata was optimized by central composite design-response surface method by using water-salt ratio， stewing time， frying temperature and frying time as factors. RESULTS The optimal stir-frying with saltwater technology of C. reticulata included water-salt ratio of 8 ∶ 1 （mL/g）， stewing time of 22 min， frying time of 9 min and frying temperature of 158 ℃. After three times of validation tests， the average comprehensive score of the optimized technology was 92.35 （RSD=2.19%）， and its relative error with the predicted value （93.25） was 1.10%. CONCLUSIONS The optimal stir-frying with saltwater technology is stable and feasible.

KEYWORDS ? Citrus reticulata; stir-frying with saltwater technology; entropy weight method; central composite design-response surface method; content determination

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子，味苦、性平，歸肝、腎經(jīng)，具有理氣、散結(jié)、止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，橘核主要含有檸檬苦素、諾米林、黃柏酮等檸檬苦素類活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine，DPPH）自由基等活性[3-4]。鹽橘核是橘核通過(guò)鹽水拌勻，悶透，再經(jīng)文火炒至微黃而得，炮制后引藥下行，可增強(qiáng)療疝止痛的功效[5]。歷版《中國(guó)藥典》、《全國(guó)中藥炮制規(guī)范（1988版）》和全國(guó)22個(gè)省市炮制規(guī)范均收載了橘核的鹽炙法，但均以“用鹽水拌勻，悶透，用文火加熱至微黃并有香氣逸出”的主觀經(jīng)驗(yàn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，未對(duì)炮制時(shí)間、炮制溫度、飲片顏色等進(jìn)行明確規(guī)定和客觀評(píng)價(jià)[6];此外，目前關(guān)于橘核鹽炙工藝的研究?jī)H限于以橙皮苷單個(gè)成分或檸檬苦素和諾米林兩個(gè)成分含量為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)，指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均較為局限[7-8]。

色彩色差計(jì)是通過(guò)模擬人眼視覺(jué)系統(tǒng)，結(jié)合儀器模擬積分光學(xué)系統(tǒng)，根據(jù)國(guó)際照明委員會(huì)Lab顏色空間原理計(jì)算得出樣品的色差值明度（L*）、紅綠色軸分量（a*）、黃藍(lán)色軸分量（b*），再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、統(tǒng)計(jì)，得到樣品顏色的色彩范圍，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)顏色的準(zhǔn)確量化[9-10]。在中藥提取工藝研究中，對(duì)多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)可直接影響提取工藝參數(shù)的確定，如何在綜合評(píng)價(jià)中作出合理、科學(xué)的評(píng)估，確定各因素的權(quán)重是影響最優(yōu)工藝篩選的關(guān)鍵[11-12]。熵權(quán)法是一種從實(shí)際數(shù)據(jù)出發(fā)，利用指標(biāo)值來(lái)反映客觀信息，從而確定權(quán)重的客觀賦權(quán)法[13-14]。基于此，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定了鹽橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量;采用色彩色差計(jì)對(duì)樣品的顏色進(jìn)行客觀、數(shù)字化處理;采用DPPH自由基清除法測(cè)定樣品的抗氧化活性;以水鹽比例、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度、炒制時(shí)間為考察因素，上述各成分含量、色差值、抗氧化活性為指標(biāo)，采用熵權(quán)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝，旨在為橘核炮制工藝探索及鹽橘核的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀及配備的SPD-20A型檢測(cè)器、CTO-10ASVP型柱溫箱、LC Solution 1.26色譜工作站（日本Shimadzu公司），R-410型色彩色差計(jì)及配套的白色校正板、粉末測(cè)試盒（日本Konica Minolta公司），F(xiàn)LUKE-63型非接觸紅外測(cè)溫儀（美國(guó)Fluke公司），1530型Multiskan SkyHigh全波段微孔板酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，JP-105A型高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司），JN18C1型電陶爐（浙江歐奔智能科技有限公司），KQ-300DE型超聲波清洗儀（上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

橘核飲片（批號(hào)20191103）于2019年11月購(gòu)自安國(guó)市藥源商貿(mào)有限公司，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為蕓香科植物橘C. reticulata Blanco的干燥成熟種子。

檸檬苦素對(duì)照品（批號(hào)CHB190219）、諾米林對(duì)照品（批號(hào)CHB180315）、黃柏酮對(duì)照品（批號(hào)CHB190126）均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%;DPPH試劑（批號(hào)D807297）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;食鹽購(gòu)自廣東省鹽業(yè)集團(tuán)廣州有限公司;磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 鹽橘核的炮制

按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0213鹽炙法”炮制：取橘核50 g，加食鹽1 g，拌勻，悶透，置于鍋內(nèi)，用文火加熱至微黃并有香氣逸出時(shí)，取出，放涼[15]。共炮制得10批鹽橘核樣品（編號(hào)S1～S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量測(cè)定

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為1.500、2.000、1.000 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液;分別精密量取上述各單一對(duì)照品貯備液560、75、50 μL，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻，制得上述成分質(zhì)量濃度分別為840、150、50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 線性工作溶液的制備 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下檸檬苦素單一對(duì)照品貯備液360、460、560、660、760 μL，諾米林單一對(duì)照品貯備液25、50、75、100、125 μL，黃柏酮單一對(duì)照品貯備液10、30、50、70、90 μL，置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，制得檸檬苦素質(zhì)量濃度分別為540、690、840、990、1 140 μg/mL，諾米林質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 μg/mL，黃柏酮質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70、90 μg/mL的線性工作溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取鹽橘核樣品適量，粉碎，過(guò)三號(hào)篩（下同），取粉末1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）提取40 min，取出，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 色譜條件 以中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3.5 min，5%A→6%A;3.5～5 min，6%A;5～8 min，6%A→12%A;8～15 min，12%A→45%A;15～30 min，45%A→65%A;30～40 min，65%A→70%A;40～45 min，70%A→95%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為0.8 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液（甲醇），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)按檸檬苦素峰計(jì)均不低于3 000，空白對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下線性工作溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD分別為2.64%、3.47%、2.83%（n=6），表示儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S6），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h時(shí)按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積的RSD分別為2.91%、4.13%、3.42%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取鹽橘核樣品（編號(hào)S6）粉末1 g，共6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量的RSD分別為2.82%、3.87%、2.45%（n=6），表示方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的鹽橘核樣品（編號(hào)S6）粉末1 g，共6份，分別精密加入檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對(duì)照品溶液（配制方法同“2.1.1”項(xiàng)）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.11 樣品含量測(cè)定 取鹽橘核樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。

2.2 鹽橘核顏色參數(shù)的測(cè)定

2.2.1 測(cè)定條件 光源為D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度為2°，照明口徑為50 mm，儀器誤差在色差值（ΔE*ab）0.6以內(nèi)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差在ΔE*ab 0.07以內(nèi)。

2.2.2 精密度考察 取鹽橘核樣品（編號(hào)S7）粉末，置于色彩色差計(jì)中，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件于同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.09%、0.49%、0.29%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性考察 取鹽橘核樣品（編號(hào)S7）粉末，共6份，置于色彩色差計(jì)中，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件測(cè)定。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.36%、1.98%、1.86%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 樣品穩(wěn)定性考察 取鹽橘核樣品（編號(hào)S7）粉末，置于色彩色差計(jì)中，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件于同日早上9：00開(kāi)始，每隔2 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.45%、1.99%、2.18%（n=6），表明樣品日內(nèi)穩(wěn)定性良好。取鹽橘核樣品（編號(hào)S7）粉末，置于色彩色差計(jì)中，分別于放置0、1、2、3、4、5 d時(shí)同一時(shí)間點(diǎn)，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件測(cè)定。結(jié)果顯示，L*、a*、b*的RSD分別為0.43%、2.06%、1.80%（n=6），表明樣品日間穩(wěn)定性良好。

2.2.5 樣品色澤測(cè)定 取鹽橘核樣品粉末，置于色彩色差計(jì)中，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件測(cè)定樣品粉末的顏色，每樣品平行測(cè)定3次，取平均數(shù)。ΔE*ab=[（Li*-L0*）2+（ai*-a0*）2+（bi*-b0*）2]1/2（式中，L0*、a0*、b0*表示10批鹽橘核飲片的平均值，即標(biāo)準(zhǔn)飲片的色值，Li*、ai*、bi*表示工藝優(yōu)化條件下樣品的色值;ΔE*ab值越小，表示炮制工藝越優(yōu)）[16]。

2.3 鹽橘核抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 DPPH工作溶液的配制 稱取DPPH粉末0.019 7 g，置于250 mL量瓶中，加75%乙醇溶解并定容，即得DPPH工作溶液。

2.3.2 提取液的制備 精密稱取鹽橘核樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W、頻率70 kHz）提取50 min，取出，冷卻，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取“2.3.1”項(xiàng)下DPPH工作溶液140 μL、“2.3.2”項(xiàng)下鹽橘核提取液30 μL，混合于96孔板中，振蕩1 min后再于30 ℃下避光反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1）。以水加等體積的DPPH工作溶液作為空白溶液，同法反應(yīng)后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A0）。取75%乙醇140 μL，加入“2.3.2”項(xiàng)下鹽橘核提取液30 μL，同法反應(yīng)后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2）。每批鹽橘核樣品均平行測(cè)定3次，取平均值。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%[17]。

2.4 熵權(quán)法分析

熵是系統(tǒng)不確定性和無(wú)序程度的度量，可用于確定多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)作為1個(gè)隨機(jī)變量，計(jì)算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其值變化程度越大，表示越無(wú)序且能提供的信息量越大，該指標(biāo)也就越重要[13]。對(duì)于某評(píng)價(jià)指標(biāo)，若綜合評(píng)分越大，即概率（Pi）的信息熵（Hi）越小，權(quán)重系數(shù)（Wi）越大，表明該指標(biāo)處于無(wú)序狀態(tài)，在評(píng)價(jià)中所起的作用越大;反之，則表示該指標(biāo)處于有序狀態(tài)，在綜合評(píng)價(jià)中不起作用[13]。具體步驟如下：

（1）建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（Xij）：Xij=（Xij）mn。式中，i表示樣品值（i=1，2，……，n），j表示指標(biāo)值（j=1，2，……，m）。

（2）將原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣轉(zhuǎn)為概率矩陣（Pij）：Pij=Xij/[∑][j=1][n]Xij，（0≤Pi≤1）。

（3）計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的Hi：Hi=-k[∑][j=1][n]PijlnPij，k=1/ln（m）。

（4）計(jì)算各指標(biāo)的Wi，Wi=1-Hi/[∑][i=1][m]（1-Hi）。

將每個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理為0～1的歸一值（DI）值，其中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量和DPPH自由基清除率的DI值越大，表示鹽炙工藝越優(yōu);ΔE*ab的DI值越小，表示鹽炙工藝越穩(wěn)定[13]。

2.5 鹽橘核的工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知鹽炙法的主要影響因素有水鹽比例、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度、炒制時(shí)間[7-8]，故本研究選擇上述因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。將各單因素考察所得各個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)按“2.4”項(xiàng)下方法對(duì)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率進(jìn)行熵權(quán)法分析，計(jì)算得各指標(biāo)的Wi（表3），同時(shí)將上述各指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到DI值，按下式計(jì)算綜合評(píng)分（y）：y=（DI檸檬苦素×0.014 4+DI諾米林×0.019 8+DI黃柏酮×0.417 3+DIΔE*ab×0.518 0+DIDPPH自由基清除率×0.030 6）×100。該評(píng)分越高，表示鹽炙工藝越優(yōu)[14]。

（1）水鹽比例：取橘核樣品50 g，共5份，分別加入不同比例的水鹽（5 ∶ 1、15 ∶ 2、10 ∶ 1、25 ∶ 2、15 ∶ 1，mL/g）悶潤(rùn)30 min，于120 ℃炒制7 min，考察不同水鹽比例對(duì)綜合評(píng)分的影響。結(jié)果顯示，隨著水鹽比例的增加，綜合評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)水鹽比例為10 ∶ 1時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最高，故選擇水鹽比例為5 ∶ 1～15 ∶ 1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2A。

（2）悶潤(rùn)時(shí)間：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤(rùn)不同時(shí)間（15、22.5、30、37.5、45 min）后，于120 ℃炒制7 min，考察不同悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響。結(jié)果顯示，隨著悶潤(rùn)時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)悶潤(rùn)時(shí)間為30 min時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最高，故選擇悶潤(rùn)時(shí)間為15～45 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2B。

（3）炒制溫度：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤(rùn)30 min，分別于80、100、120、140、160 ℃下炒制7 min，考察不同炒制溫度對(duì)綜合評(píng)分的影響。結(jié)果顯示，隨著炒制溫度的增加，綜合評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)炒制溫度為120 ℃時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最高，故選擇炒制溫度為80～160 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2C。

（4）炒制時(shí)間：取橘核樣品50 g，共5份，按水鹽比例10 ∶ 1（mL/g）加入鹽水10 mL，悶潤(rùn)30 min，于120 ℃分別炒制3、5、7、9、11 min，考察不同炒制時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響。結(jié)果顯示，隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)炒制時(shí)間為7 min時(shí)，綜合評(píng)分達(dá)到最高，故選擇炒制時(shí)間為3～11 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2D。

2.5.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化 以水鹽比例（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（B）、炒制溫度（C）、炒制時(shí)間（D）為考察因素，以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化橘核的鹽炙工藝。

（1）Wi的計(jì)算：將工藝優(yōu)化結(jié)果，按“2.4”項(xiàng)下方法對(duì)檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，ΔE*ab，DPPH自由基清除率進(jìn)行熵權(quán)分析，計(jì)算得到各指標(biāo)的Wi，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，ΔE*ab的Wi最大、Hi最小，表明ΔE*ab的變化最大;其次為黃柏酮含量。結(jié)合熵權(quán)法得到的Wj對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得到綜合評(píng)分（y）：y=（DI檸檬苦素×0.099 0+DI諾米林×0.141 8+DI黃柏酮×0.381 6+DIΔE*ab×0.466 7+DIDPPH自由基清除率×0.033 4）×100。

（2）星點(diǎn)設(shè)計(jì)：橘核鹽炙工藝的因素與水平見(jiàn)表5，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表6。

（3）模型擬合與方差分析：運(yùn)用Design Expert 10軟件對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并建立二次多元回歸模型，得到綜合評(píng)分（y）的二次多元回歸方程為y=130.028 58-3.358 40A+1.647 14B-2.050 73C-6.632 60D+0.008 361AB+0.050 90AC-0.633 56AD-0.007 60BC-0.231 60BD+0.151 16CD-0.039 17A2+0.015 66B2+0.006 30C2+0.186 49D2（P<0.001，R 2=0.923 6）。二次多元回歸模型的F=13.83，P<0.000 1，表示該模型具有顯著性;失擬項(xiàng)中，F(xiàn)=1.89，P=0.224 2，表明失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明此模型可以用于分析工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝。因素C對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響（P<0.01），因素A、B、D對(duì)綜合評(píng)分無(wú)顯著影響（P>0.05），各因素對(duì)橘核鹽炙工藝的影響順序?yàn)镃>A>D>B。二次項(xiàng)中，C 2為顯著項(xiàng)（P<0.05），A 2、B 2和D 2為不顯著項(xiàng)（P>0.05），表明因素C與綜合評(píng)分并非線性關(guān)系。在交互項(xiàng)中，因素CD為顯著項(xiàng)（P<0.01），表明炒制溫度和炒制時(shí)間的交互作用明顯;因素AB、AC、AD、BC、BE的交互作用不顯著（P>0.05），表明除了炒制溫度和炒制時(shí)間外，其他因素的交互作用對(duì)橘核鹽炙工藝影響不大。結(jié)果見(jiàn)表7。

（4）響應(yīng)面分析及最優(yōu)鹽炙工藝的確定：使用Design Expert 10軟件繪制各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖3）。結(jié)果顯示，因素C與因素D的交互影響作用最強(qiáng)，曲面陡峭，等高線呈橢圓形且密集;因素C與因素A、因素D的交互影響較強(qiáng)，曲面較為陡峭，等高線較密集;因素A與因素B、因素D的交互影響較弱，曲面較平。根據(jù)模型預(yù)測(cè)得到橘核的鹽炙工藝為水鹽比例7.8 ∶ 1（mL/g）、悶潤(rùn)時(shí)間21.77 min、炒制時(shí)間8.8 min、炒制溫度158 ℃。結(jié)合實(shí)際操作，確定橘核的最優(yōu)鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤(rùn)時(shí)間22 min、炒制時(shí)間9 min、炒制溫度158 ℃。

（5）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取橘核50 g，按上述最優(yōu)鹽炙工藝進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，平均綜合評(píng)分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測(cè)值（93.25分）的相對(duì)誤差為1.10%，表明優(yōu)化所得鹽炙工藝穩(wěn)定，可行。結(jié)果見(jiàn)表8。

3 討論

本研究采用HPLC法建立了測(cè)定鹽橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量的方法，采用色差計(jì)將顏色進(jìn)行客觀、數(shù)據(jù)化處理，并通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除率得出其抗氧化活性水平，旨在從樣品的外觀顏色、內(nèi)在成分含量、藥效活性等方面出發(fā)，全面客觀地優(yōu)化橘核鹽炙工藝。

2020年版《中國(guó)藥典》（一部）未記載橘核中檸檬苦素類成分的含量測(cè)定方法[1]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的用于測(cè)定檸檬苦素、諾米林含量的流動(dòng)相體系有甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水、乙腈-水-磷酸緩沖液等[8，18-20]。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-磷酸溶液時(shí)，各成分分離度較好，基線穩(wěn)定，峰形較好，同時(shí)考慮到峰形的對(duì)稱性、穩(wěn)定性以及保留時(shí)間，最終選擇流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液。

有研究表明，檸檬苦素和諾米林的抗氧化活性約為維生素C的2.9～8.3倍[4]，表明兩者的抗氧化活性較強(qiáng)。與等量維生素C相比，檸檬苦素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且其抗氧化活性明顯強(qiáng)于諾米林[21]。在本研究中，鹽橘核對(duì)DPPH自由基的平均清除率為0.73，表明鹽橘核對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除活性，這種清除效果可能與其含有檸檬苦素和諾米林有關(guān)[4]。也有研究認(rèn)為，橘核經(jīng)鹽炙和清炒后，其含有的檸檬苦素和諾米林含量較生品顯著下降[2]。因此，鹽橘核與生品橘核的抗氧化能力是否有差別，尚有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，ΔE*ab為0.47～6.14，表明采用不同鹽炙工藝的鹽橘核ΔE*ab變化較大，因此筆者認(rèn)為ΔE*ab可作為橘核鹽炙工藝重點(diǎn)考察的指標(biāo)。

熵權(quán)法可對(duì)實(shí)際發(fā)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算和分析，得出客觀權(quán)重系數(shù)，精度較高，客觀性強(qiáng)，能夠很好地解釋所得結(jié)果[13]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法可通過(guò)二次多元方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，以回歸方程優(yōu)化工藝參數(shù)，具有精密度高、預(yù)測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[16]。本課題組采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了水鹽比例、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制時(shí)間和炒制溫度對(duì)橘核鹽炙工藝的影響，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行了熵權(quán)分析，根據(jù)不同炮制方法下各指標(biāo)的變化程度來(lái)確定該指標(biāo)的客觀權(quán)重，使得星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案更具科學(xué)性、客觀性。結(jié)果得到橘核的最優(yōu)鹽炙工藝為水鹽比例8 ∶ 1（mL/g）、悶潤(rùn)時(shí)間22 min、炒制時(shí)間9 min、炒制溫度158 ℃。優(yōu)化所得工藝的平均綜合評(píng)分為92.35分（RSD=2.19%），與預(yù)測(cè)值（93.25分）的相對(duì)誤差為1.10%，表明該鹽炙工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2021-08-13 修回日期：2021-12-12）

（編輯：陳 宏）