河南省丹參根結(jié)線蟲病原種類鑒定

陳昆圓， 文藝， 許相奎， 周博， 張紅瑞， 王鐵霖， 孟顥光， 蔣士君， 崔江寬

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南 鄭州 450002； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700)

丹參(Salviamiltiorrhiza)是多年生草本藥用植物，以干燥根和根莖入藥，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩等功效，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，是我國常用大宗中藥材之一[1-2]。丹參在中國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于山東、河南、山西、陜西、四川等地[3-4]。目前，河南省丹參種植面積約1.67萬hm2。隨著丹參的大面積單一種植，丹參病蟲害問題逐年加重，丹參根結(jié)線蟲病的發(fā)生尤為明顯。根結(jié)線蟲病一般引起丹參減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%以上，對丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)影響巨大，已成為限制丹參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[5]。陳小紅等[6]通過田間調(diào)查，明確了四川省丹參根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)。高志華報(bào)道了山東地區(qū)引起丹參根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)[7]。TSAI等[8]首次報(bào)道了臺(tái)灣花蓮縣丹參根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲。目前，尚未見到河南省丹參根結(jié)線蟲病害研究的相關(guān)報(bào)道。

作者在前期河南省丹參線蟲病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，部分丹參種植基地大面積發(fā)生根結(jié)線蟲病，嚴(yán)重發(fā)病丹參地上部植株明顯矮小，葉片黃化，萎蔫焦枯，甚至全株凋亡；地下根和塊莖畸形、扭曲，有明顯可見的瘤狀根結(jié)，撕開表皮肉眼可見米粒狀白雌蟲。本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對河南地區(qū)丹參根結(jié)線蟲病病原進(jìn)行鑒定，以期明確丹參根結(jié)線蟲的發(fā)病種類，為丹參根結(jié)線蟲的快速診斷和科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及癥狀觀察

2019—2021年，在河南省許昌市、三門峽市、南陽市等重要丹參種植園區(qū)采集到根結(jié)線蟲危害的丹參樣品。選擇典型根結(jié)癥狀的丹參和病株根際土進(jìn)行取樣，取樣深度為10～20 cm，然后將樣品混勻放入自封袋中并標(biāo)記。本研究在許昌地區(qū)采集病害樣品7份，三門峽地區(qū)采集病害樣品7份，南陽地區(qū)采集病害樣品8份，共計(jì)22份樣品。

1.2 線蟲種群純化與保存

在體視顯微鏡(SZ-650，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)下直接挑選丹參病根組織中的單一卵塊，接種到預(yù)先培植在滅菌砂質(zhì)土壤中長有2～3片真葉的番茄苗根部，后置于28/20 ℃溫室中(白天：黑夜=16 h∶8 h)進(jìn)行線蟲種群的純化與擴(kuò)繁。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

卵塊孵化的二齡幼蟲(J2)和雌蟲用于形態(tài)鑒定。觀察J2及雌蟲頭部和口針等特征，測量其體長、體寬、口針長和背食道腺開口至口針基部球的距離(DGO)等形態(tài)指標(biāo)，J2和雌蟲分別測量20個(gè)樣本。使用配有NIS-Elements AR的尼康光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S)對制作的線蟲玻片進(jìn)行形態(tài)觀察、數(shù)據(jù)測量和拍照。

雌成蟲會(huì)陰花紋的制作與觀察：參照張紹升[9]的方法(略有改動(dòng))，在體視顯微鏡下從丹參病根組織挑取成熟雌蟲，移到滴有1滴45%乳酸的載玻片上，用手術(shù)刀切下蟲體尾端(蟲體后部約1/4處)，使用竹針尖端的纖絲仔細(xì)剔除附在內(nèi)側(cè)的卵及其他粘連物并稍加修飾，僅留下會(huì)陰花紋部分。將會(huì)陰花紋轉(zhuǎn)移至滴有1滴純甘油的載玻片上，加蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 線蟲DNA提取 參照彭德良等[10]線蟲DNA提取方法(略有改動(dòng))。隨機(jī)從不同丹參病根組織內(nèi)挑取白雌蟲于PCR單管中，加入20 μL ddH2O，液氮反復(fù)凍融后用玻璃棒研磨3次，加入14 μL 10×PCR-buffer緩沖液(不含Mg2+)(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)、6 μL蛋白酶K(600 mg·L-1)(德國Merck KGaA公司)。用迷你離心機(jī)(臺(tái)灣Cubee)進(jìn)行瞬時(shí)離心(4 800 r·min-1)30 s，后置于PCR儀(EppendorfMastercycler nexus PCR 儀，德國Eppendorf公司)中65 ℃溫育90 min，95 ℃滅活10 min。最后，用迷你離心機(jī)(臺(tái)灣Cubee)離心(4 800 r·min-1)1 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 rDNA-ITS序列分析 以上述提取的DNA為模板，使用根結(jié)線蟲通用引物M18S(5′-AACCTGCTGCTGGATCATTAC-3′)和M28S(5′-GTATGCTTAAGTTCAGCG-3′)進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增[11]。采用50 μL擴(kuò)增體系：2×EsTaq Master Mix(Dye)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司)，120 V，30 min，之后用凝膠成像儀(InGenius凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司)進(jìn)行觀察拍照。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pClone007 Versatile Simple Vector Kit載體(北京擎科生物科技有限公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞(北京擎科生物科技有限公司)中，挑取陽性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行單向測序。將獲得的rDNA-ITS序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對分析，用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.4.3 特異性引物檢測 根據(jù)rDNA-ITS序列分析結(jié)果，選用南方根結(jié)線蟲特異性引物Inc-K14-F(5′-GGGATGTGTAAATGCTCCTG-3′)和Inc-K14-R(5′-CCCGCTACACCCTCAACTTC-3′)[12]對供試的丹參根結(jié)線蟲22個(gè)DNA樣本進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。采用25 μL擴(kuò)增體系： 2×Es Taq Master Mix(Dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，120 V，30 min，之后用凝膠成像儀進(jìn)行觀察拍照。

1.5 致病性測定

將生長14 d的健康丹參植株幼苗移栽于滅菌砂質(zhì)土壤(m(沙)∶m(土)=1∶1)的塑料盆，待3～5 d植株成活后于根部接種1 mL純化培養(yǎng)的J2懸浮液(400條·mL-1)，以不接種線蟲為對照，置于28/20℃溫室(白天∶黑夜=16 h∶8 h)中培養(yǎng)。在接種后7、15 d使用次氯酸鈉酸性品紅染色法調(diào)查線蟲侵染發(fā)育情況，42 d后觀察植株發(fā)病癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

對采集的丹參樣品進(jìn)行癥狀觀察，丹參根系被根結(jié)線蟲侵染后，植株地上部表現(xiàn)出明顯矮化，葉片失綠黃化，發(fā)育不良，嚴(yán)重者整株枯萎(圖1a)。丹參感染根結(jié)線蟲后主根根尖處開始膨大，隨后側(cè)根也出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，形成不規(guī)則白色根結(jié)，隨著根結(jié)逐漸膨大，根結(jié)的顏色由淺變深，直至根部腐爛壞死(圖1b～c)。解剖受害根結(jié)可見白色球形或梨形的雌蟲及埋生于根結(jié)內(nèi)的褐色卵囊，表明丹參已感染根結(jié)線蟲。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

丹參根結(jié)線蟲的J2呈線形蠕蟲狀，頭部無突出與縊縮，有不完整環(huán)紋，口針纖細(xì)，基部球小，尾呈長錐形，末端有一清晰的透明區(qū)(圖2a～c)。J2體長為404.14(357.22～458.12)μm，體寬為14.12(12.41～16.07)μm，口針長為10.31(9.17～11.34)μm，DGO長為2.37(2.19～2.67)μm，尾長為49.46(44.92～54.31)μm；雌蟲蟲體乳白色，球形或梨形，有一明顯突出的短頸，口針纖細(xì)，口針錐部略向背部彎曲(圖2d)。體長為607.99(487.67～708.41)μm，體寬為377.09(324.48～435.12)μm，口針長為16.86(14.12～20.41)μm，DGO長為3.34(2.82～3.79)μm。

a：田間癥狀；b～c：根部被害癥狀 a: Field symptoms; b-c: Root symptoms圖1 丹參根結(jié)線蟲田間發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of root-knot nematode on S.miltiorrhiza in field

a：2齡幼蟲整體外觀；b：2齡幼蟲頭部；c：2齡幼蟲尾部；d：雌成蟲；e：會(huì)陰花紋(a～c：標(biāo)尺 20 μm；d：標(biāo)尺100 μm；e：標(biāo)尺20 μm)

雌蟲會(huì)陰花紋呈圓形或橢圓形，背弓高而方，由平滑到波浪形的線紋組成。有些線紋在側(cè)面分叉，無明顯側(cè)線，線紋彎向陰門，尾端區(qū)無刻點(diǎn)(圖2e)。丹參根結(jié)線蟲的形態(tài)鑒定特征與已報(bào)道的多個(gè)南方根結(jié)線蟲形態(tài)特征一致。因此，可以初步判定危害河南省丹參的根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

利用根結(jié)線蟲通用引物M18S/M28S對河南省丹參根結(jié)線蟲22個(gè)DNA樣本進(jìn)行rDNA-ITS擴(kuò)增。結(jié)果顯示，22個(gè)樣本均可以獲得500 bp左右目的條帶(圖3)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序得到544 bp的序列，與預(yù)期序列吻合。將丹參根結(jié)線蟲的rDNA-ITS序列比對整理提交至GenBank，獲得登錄號(hào)：OM690624.1。在NCBI上Blast比對分析顯示，河南丹參根結(jié)線蟲與GenBank中南方根結(jié)線蟲MT071557.1、MT071558.1和MT071559.1序列同源性達(dá)100%。以丹參根結(jié)線蟲22個(gè)DNA為模板，利用南方根結(jié)線蟲特異性引物Inc-K14-F/Inc-K14-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到明顯單一的399 bp特異性目的片段(圖4)。

M：DNA Marker DL2000；1～22：丹參根結(jié)線蟲種群 M: DNA Marker DL2000; 1-22: Populations of root-knot nematode on S.miltiorrhiza圖3 丹參根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of rDNA-ITS of root-knot nematode on S.miltiorrhiza

M：DNA Marker DL2000；1～22：丹參根結(jié)線蟲種群；23：不含DNA的陰性對照；24：陽性對照 M: DNA Marker DL2000; 1-22: Populations of root-knot nematode on S.miltiorrhiza; 23: Negative control without DNA; 24: Positive control圖4 丹參南方根結(jié)線蟲特異性引物PCR電泳檢測結(jié)果Fig.4 Results of species special primers PCR detection of M.incognita on S.miltiorrhiza

2.4 致病性測定結(jié)果

健康丹參幼苗接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲7 d后，可觀察到大量幼蟲侵染丹參根尖(圖5 a)，并開始膨大；隨后側(cè)根根部也出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，根內(nèi)J2逐步發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)?齡幼蟲(圖5 b)；15 d時(shí)染色，在根內(nèi)可以觀察到3齡和4齡幼蟲(圖5 c～d)；42 d時(shí)根結(jié)癥狀明顯，形成了不規(guī)則白色米粒狀根結(jié)，并隨著根結(jié)逐漸膨大，顏色由白色變?yōu)辄S褐色，解剖受害根組織可見白色球形或梨形的雌蟲及埋生于根結(jié)內(nèi)的褐色卵囊(圖5 e～f)。接種植株地上部分明顯矮化，側(cè)枝枯萎，葉片失綠黃化，這些癥狀與田間病株的病癥一致(圖5 g)，對照組無發(fā)病。從病根上分離出的根結(jié)線蟲經(jīng)再次鑒定，確認(rèn)為南方根結(jié)線蟲，表明南方根結(jié)線蟲為河南省丹參根結(jié)線蟲病的病原線蟲。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇南方根結(jié)線蟲及其近緣種的rDNA-ITS序列，以松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)作為種外群對照，與供試線蟲構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。結(jié)果表明，丹參根結(jié)線蟲種群與GenBank中8個(gè)分別來源于中國河南、江蘇、福建、臺(tái)灣等地，以及巴西，印度，美國等國的南方根結(jié)線蟲種群(登錄號(hào)分別為MT071559.1、MT490926.1、MT159699.1、MF168964.1、KT869139.1、MW627496.1、MT921010.1、MK292132.1)的序列以100%的支持率聚集在同一支。此外，丹參根結(jié)線蟲種群與象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)、西班牙根結(jié)線蟲(M.hispanica)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)、擬禾本科根結(jié)線蟲(M.graminicola)、較小根結(jié)線蟲(M.minor)、偽根結(jié)線蟲(M.fallax)、奇氏根結(jié)線蟲(M.chitwoodi)、蘋果根結(jié)線蟲(M.mali)等近緣種聚類在不同分支上，南方根結(jié)線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲親緣關(guān)系較近，并能與近緣種顯著區(qū)分。

a～b：接種后7 d；c～d：接種后15 d；e：接種后42 d根部癥狀；f：接種后42 d發(fā)病根部雌蟲和卵塊；g：左邊為接種后42 d，右邊為空白對照(圖a～d，f放大倍數(shù)為6倍)

3 結(jié)論與討論

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是一類重要的植物寄生線蟲，危害遍及糧食作物以及蔬菜等作物，其寄主分屬114個(gè)科3 000多種植物，特別是侵染茄科、葫蘆科、十字花科等植物最為嚴(yán)重[13]。根結(jié)線蟲一般可使作物減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)75%以上，嚴(yán)重制約了農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)[14]。目前，已報(bào)道的根結(jié)線蟲有90多種，對作物生產(chǎn)危害嚴(yán)重的根結(jié)線蟲主要有4種：南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲[13,15]，其中南方根結(jié)線蟲因發(fā)生面積大、寄主種類多，已成為多地根結(jié)線蟲的優(yōu)勢種群[16]。近年來，隨著我國作物單一高密度種植模式的大規(guī)模應(yīng)用及農(nóng)業(yè)機(jī)械跨區(qū)域作業(yè)，根結(jié)線蟲危害區(qū)域正在逐漸擴(kuò)大，發(fā)病程度也逐漸加重，根結(jié)線蟲的有效防控迫在眉睫。由于不同種類根結(jié)線蟲之間存在顯著的致病性差異，因此準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲的種類是防治根結(jié)線蟲病的前提[17]。

根結(jié)線蟲種類的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶表型分析、鑒別寄主試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定[18]。線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定是應(yīng)用范圍最廣泛的鑒定方法，但根結(jié)線蟲種類的形態(tài)特征差異不明顯且還經(jīng)常發(fā)生變異，僅利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征難以準(zhǔn)確鑒定[19]。同工酶技術(shù)在根結(jié)線蟲分類鑒定上是一種重要的技術(shù)手段，但同工酶的提取對線蟲蟲態(tài)的要求嚴(yán)格，需要大量線蟲樣品才能獲得可靠結(jié)果，且蛋白質(zhì)會(huì)受多種外界因素的干擾而影響鑒定結(jié)果[20-21]。鑒別寄主主要通過一套特定鑒別寄主來進(jìn)行種水平的鑒定，但由于鑒別寄主法只能鑒定常見的四種根結(jié)線蟲，且受寄主差異和環(huán)境的影響，鑒定結(jié)果往往差異較大[22]。線蟲的DNA一般不會(huì)隨著線蟲蟲態(tài)、寄主或環(huán)境的變化而出現(xiàn)改變。因此，基于線蟲DNA的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[18]。rDNA-ITS位于核糖體DNA的18S和28S的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，因其種內(nèi)高度保守，種間差異明顯，常用于種間分類鑒定[23]。蘇圣淞等[24]通過形態(tài)學(xué)與rDNA-ITS序列分析對土沉香(Aquilariasinensis)根結(jié)線蟲種類進(jìn)行鑒定，首次報(bào)道了海南省澄邁地區(qū)土沉香上發(fā)生象耳豆根結(jié)線蟲。SCAR(Sequence-characterized amplified region)特異性序列擴(kuò)增是一種新型分子標(biāo)記，具有結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，結(jié)合rDNA-ITS序列分析，可以快速、準(zhǔn)確、有效的區(qū)分植物寄生線蟲屬到種的水平[18]。周博等[25]利用形態(tài)學(xué)鑒定、SCAR-PCR檢測與rDNA-ITS測序相結(jié)合的方法，首次報(bào)道了河南省焦作地區(qū)懷地黃(Rehmanniaglutinosa)病原根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。因此，對常見的植物線蟲，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定基本可以進(jìn)行準(zhǔn)確的物種分類，并且分子生物學(xué)鑒定具有重復(fù)性強(qiáng)，效率高的優(yōu)勢。

圖6 基于根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences of Meloidogyne spp.

河南地處中原，山川、盆地和平原相連，屬暖溫帶和亞熱帶氣候，復(fù)雜多樣的地理環(huán)境和四季分明的氣候不僅適宜多種農(nóng)作物和道地藥材生長，而且適宜根結(jié)線蟲的發(fā)生危害。河南是我國道地丹參最適宜的種植地區(qū)之一[26]，丹參在河南道地藥材種植中面積排名第四[27]。然而，河南省丹參根結(jié)線蟲發(fā)生分布和危害損失研究一直或缺。本研究對河南省丹參根結(jié)線蟲病害進(jìn)行了系統(tǒng)普查，在河南省許昌市、三門峽市、南陽市等地發(fā)現(xiàn)丹參根結(jié)線蟲的危害。采用田間癥狀分析、形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定和柯赫氏法則致病性驗(yàn)證，明確了為害河南省丹參的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。目前，中國丹參根結(jié)線蟲病已在四川、山東、臺(tái)灣等地發(fā)生危害，并有進(jìn)一步蔓延的趨勢。因此，一方面要加強(qiáng)丹參田間根結(jié)線蟲發(fā)生動(dòng)態(tài)監(jiān)測，掌握其發(fā)生分布和危害損失；另一方面，應(yīng)盡快建立丹參無病育苗基地，針對丹參根結(jié)線蟲發(fā)病地塊制定相應(yīng)的防控措施。采取輪作倒茬或在發(fā)病初期進(jìn)行藥劑防治，對于后期發(fā)病嚴(yán)重的地塊可提前采收，降低損失；也可在丹參采后至播種期間清除田間病殘?bào)w并對土壤進(jìn)行消毒處理[28]，降低蟲口基數(shù)。