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    百合無性繁殖器官病毒檢測及LlMADS2調(diào)控珠芽發(fā)生的初步解析

    2022-02-07 02:25:08張雪敏李佳敏康圣楠李玉舒梁佳惠張銘芳張秀海于曉南杜運鵬
    關(guān)鍵詞:卷丹珠芽鱗莖

    張雪敏, 李佳敏, 康圣楠, 李玉舒, 梁佳惠, 張銘芳, 張秀海, 于曉南, 杜運鵬

    (1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院,北京 100083;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所, 北京100097;3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

    百合為百合科(Lilaceae)百合屬(Lilium)植物,是重要的藥食同源植物之一[1],在北溫帶和亞熱帶地區(qū)分布廣泛。中國是百合屬的起源和分布中心之一,具有豐富的百合資源[2]。百合經(jīng)常發(fā)生病毒性感染,病毒性感染往往會導(dǎo)致百合種球的數(shù)量和品質(zhì)下降,最終造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3-4]。據(jù)報道,有10種以上的不同病毒可以造成各地百合的感染[5-7]。其中百合無癥狀病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒病毒(LMoV)被認(rèn)為是最具危害性的種類[8]。因此百合繁殖器官抗性的提高或者自身毒性的降低,對于百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究表明,在卷丹中珠芽攜帶的病毒種類低于其他繁殖器官[8]。在眾多百合資源中,卷丹是具有珠芽發(fā)生能力的種類之一。卷丹是在中國分布范圍最廣的百合科百合屬植物,其花大色艷,抗性強,兼具觀賞、食用、藥用價值,為中國食用百合的主要種,種植面積廣,產(chǎn)業(yè)價值高[9-10]。但卷丹一般為三倍體,難以通過有性繁殖方式擴大種群。因此,珠芽被視為卷丹極具開發(fā)潛力的繁殖方式。目前對珠芽的研究集中在解剖學(xué)和生理學(xué)層面,包括珠芽發(fā)生發(fā)育的組織學(xué)觀察,以及珠芽形成過程內(nèi)源激素的變化,但對其發(fā)生發(fā)育的分子機理的研究很少[11]。珠芽著生于百合的葉腋處,多被認(rèn)為是腋生器官,在其他植物當(dāng)中,對于葉腋分生組織的形成、腋生器官的啟動與生長,已經(jīng)有一定的研究基礎(chǔ)[12-15]。其中,MADS-box(MCM1/AGAMOUS/DEFICIENS/SRF)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是植物中研究最多的家族之一,這個家族的成員參與多種植物的生長發(fā)育過程[16]。最初,MADS-box基因只是被作為花器官中重要的參與者,但近年越來越多的研究揭示,MADS-box基因在幾乎所有器官的形態(tài)發(fā)生上具有重要的功能,其貫穿植物的整個生命周期[17]。研究表明,當(dāng)龍舌蘭(Agavetequilana)受精失敗或去除頂端花芽時,會誘導(dǎo)珠芽的形成,且AtMADS1/2/4/6/7參與調(diào)控珠芽的形成[18-19];狗尾草(Setariaviridis)的simads34突變體能夠顯著改變狗尾草的花序結(jié)構(gòu),且狗尾草的次生分枝數(shù)量顯著增加[20];沉默POTM1(potatoMADS1)基因會導(dǎo)致馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖產(chǎn)量降低、側(cè)芽生長增強[21];在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中AtAGL21可以通過增強局部生長素的生物合成,來調(diào)節(jié)側(cè)根原基和側(cè)根中生長素的積累,進而刺激側(cè)根的起始和生長,而agl21突變體則表現(xiàn)側(cè)根發(fā)育受損[22]。這些結(jié)果初步證明MADS-box轉(zhuǎn)錄因子對于珠芽形成具有重要意義。然而,目前缺少MADS-box基因在百合珠芽發(fā)生過程的功能研究。本研究通過對卷丹、重瓣卷丹、淡黃花和瀘定百合的兩種無性繁殖器官珠芽和鱗莖的病毒檢測,進一步證實了珠芽的低毒優(yōu)勢,隨后通過對卷丹珠芽發(fā)生發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中與珠芽發(fā)生相關(guān)的MADS-box差異表達(dá)基因進行分析,結(jié)合qRT-PCR結(jié)果,最終篩選出一個可能參與珠芽發(fā)生的注釋為MADS2的關(guān)鍵基因,進一步對LlMADS2進行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)其在珠芽發(fā)生過程中的S0和S1時期的表達(dá)中具有顯著差異,可能參與調(diào)控百合珠芽的發(fā)生,為探明MADS-box轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控卷丹珠芽發(fā)生機制研究提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 卷丹、重瓣卷丹、淡黃花、瀘定百合獨頭種球種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院國家百合種質(zhì)資源庫中。從卷丹種植到珠芽成熟的過程不斷進行觀察,在卷丹珠芽尚未發(fā)生時期(S0)、小白點期(S1)、綠球期(S2)、褐球期(S3)取植株葉腋處(圖1),每個階段取9株卷丹,每株卷丹取同一部位的2個相鄰葉腋,每3株卷丹的葉腋作為一個混合樣本混樣,錫箔紙包裹后用液氮速凍,在-80 ℃冰箱凍存,用于轉(zhuǎn)錄組測序。取卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的褐球期珠芽及同株地下鱗莖于液氮速凍,-80 ℃冰箱凍存,用于病毒檢測。取卷丹S0,S1,S2,S3時期珠芽所對應(yīng)的葉腋處,以及卷丹莖稈上部可發(fā)生珠芽部位和下部無法發(fā)生珠芽的部位的葉腋,以及卷丹植株各部位器官組織在液氮中速凍,在-80 ℃凍存,用于后期時空表達(dá)模式檢測。

    A,E,F. S0:珠芽尚未發(fā)生期;B,F,J. S1:珠芽小白點期;C,G,K. S2:綠球期;D,H,L. S3:褐球期;紅圈部分代表珠芽內(nèi)部分化的鱗片層。

    1.1.2 菌株、載體和試劑 EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛博森生物科技有限公司,北京),大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)BC102細(xì)胞(博邁德生物技術(shù)有限公司,北京),pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體5 min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit,2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) ,2 × Rapid Taq Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊,南京),DNA通用純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司,北京),熒光定量PCR試劑TB Green? Premix ExTaqTM(寶生物工程(大連)有限公司,大連)。

    1.1.3 儀器與設(shè)備 電子天平,瑞安市英衡電器有限公司;電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;高壓蒸汽滅菌器,SANYO Techno Solutions Tottori Co.,Ltd;微波爐,合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司;振蕩培養(yǎng)箱,上海旻泉儀器有限公司;梯度PCR儀,Life technologies;CFX96TMReal-Time System,Singapore。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計 從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找到目的基因的轉(zhuǎn)錄本序列,在ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得其開放閱讀框(open reading frames, ORF)序列,將獲得的長度大于200 bp的ORF序列在NCBI protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/-Blast.cgi)依次進行比對,與轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果相吻合即視為比對成功,保存比對成功的ORF序列用于定量引物設(shè)計。將保存的ORF序列提交至GenScript(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool?page_no= 1& position_no=2&sensors=googlesearch),調(diào)整參數(shù)organism:other,size range:180~220 bp,Tm≥60 ℃進行定量引物設(shè)計。根據(jù)引物設(shè)計的原則選擇最好的1~2個設(shè)計結(jié)果作為定量引物,后續(xù)再進行定量引物的篩選。

    利用Primer Premier 5 軟件進行克隆引物、病毒檢測引物及qRT-PCR引物的設(shè)計,本試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

    采用t檢驗進行差異顯著性分析。

    表1 病毒檢測及定量試驗所用引物Table 1 Primers used in virus detection and qRT-PCR

    1.2.2 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 利用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取卷丹葉腋總RNA;根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)說明書,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,反應(yīng)結(jié)束后,樣品于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 百合無性繁殖器官珠芽和鱗莖病毒檢測 利用卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的珠芽及鱗莖的cDNA為模板進行PCR擴增,對黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)進行檢測。擴增體系包含2 × Rapid Taq Master Mix 5 μL,上下游引物各1 μL,所用引物見表1,cDNA 2 μL,ddH2O 2 μL,總體系10 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,72 ℃ 5 min,共35個循環(huán)。擴增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.2.4MADS-box基因分析與關(guān)鍵基因篩選 用DESeq2對卷丹珠芽形成過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行組間差異表達(dá)分析,篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR(False Discovery Rate)<0.05且FC(Fold Change)≥2。將S1、S2、S3作為珠芽已發(fā)生時期,S0作為未發(fā)生時期,設(shè)置3個比較組,分析差異表達(dá)基因,選擇差異表達(dá)基因中所有的轉(zhuǎn)錄因子,繪制維恩圖與熱圖。利用tbtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)進行venn圖與熱圖的繪制。

    1.2.5LlMADS2基因克隆 利用卷丹葉腋的cDNA為模板進行PCR擴增,擴增體系包含2 × Phanta Master Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 19 μL,總體系50 μL。反應(yīng)程序為 98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,56 ℃ 5 s,72 ℃ 15 s,72 ℃ 5 min,共35個循環(huán)。擴增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用DNA回收試劑盒(TIANGEN, 北京)回收目的片段;將目的片段連接至pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體,轉(zhuǎn)化到DH5α(博邁德,北京) 感受態(tài)中,PCR篩選陽性菌株,送往北京諾賽基因組研究中心有限公司(北京)測序。

    1.2.6 序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 通過ProtParam對蛋白理化性質(zhì)進行分析;利用ProtScale對蛋白親疏水性進行分析;采用TMHMM Serverv2.0分析編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域;利用NetPhos 2.0 Server 進行磷酸化位點預(yù)測;利用NCBI ORF finder在線程序及Conserved domains數(shù)據(jù)庫對測序獲得的cDNA序列進行開放閱讀框及保守功能結(jié)構(gòu)域分析;通過SOPMA及SWISS.MODEL預(yù)測蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu);利用Cell-PLoc 2.0分析亞細(xì)胞定位情況[23-24];采用geneious進行多重序列比對。利用生物軟件MEGA7.0進行Neighborjoining系統(tǒng)進化樹構(gòu)建,采用遺傳距離建樹法的相鄰連接法,并進行1 000次的Bootstrap校正。

    1.2.7LlMADS2的表達(dá)分析 以上述用于qRT-PCR的植物材料的cDNA為模板進行qRT-PCR分析,每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:5 μL TB green、1 μL cDNA模板、0.4 μL上下游引物、3.2 μL ddH2O。擴增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,循環(huán)39次。以卷丹18 S為內(nèi)參基因,引物序列見表1,采用2-ΔΔCt法計算LlMADS2的相對表達(dá)量。利用Excel、SPSS19、GraphPad Prism8等軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 4種百合鱗莖及珠芽的病毒檢測

    本試驗以卷丹、重瓣卷丹、淡黃花百合、瀘定百合的珠芽和鱗莖的cDNA為模板對百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無癥病毒(LSV)進行檢測,結(jié)果表明,在淡黃花百合中,同一植株地下鱗莖和珠芽中均存在百合斑駁病毒,但在珠芽中表達(dá)較弱;卷丹鱗莖中存在黃瓜花葉病毒,但珠芽中并未檢測到3種病毒的存在;重瓣卷丹鱗莖和珠芽中均含有百合斑駁病毒,但珠芽中斑駁病毒的含量明顯低于鱗莖中;瀘定百合鱗莖中存在百合無癥病毒和黃瓜花葉病毒,而珠芽中僅含有黃瓜花葉病毒(圖2),由此說明珠芽是未攜帶病毒或帶毒率較少的無性繁殖器官。這種表現(xiàn)在卷丹和重瓣卷丹珠芽尤為明顯。因此以卷丹為材料探究珠芽的發(fā)生機制對于百合種球的脫毒及百合新型繁殖方式的開發(fā)具有重要的參考價值。

    2.2 卷丹珠芽發(fā)生關(guān)鍵基因篩選

    結(jié)合珠芽形成過程和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,本研究將159,59,47這3處交集作為參與珠芽發(fā)生的重點基因集,從中選擇出了所有的MADS-box基因,并將篩選出的所有MADS-box基因繪制熱圖。依據(jù)熱圖可以發(fā)現(xiàn),將S1,S2,S3時期的表達(dá)量與S0相比較,Cluster-16492.37633,Cluster-16492.39107,Cluster-16492.42069,Cluster-16492.60924這4個轉(zhuǎn)錄本在珠芽發(fā)生后的表達(dá)量均明顯高于珠芽未發(fā)生時期,本試驗檢測了Cluster-16492.37633,Cluster-16492.42069,Cluster-16492.60924這3個轉(zhuǎn)錄本在珠芽發(fā)生(S0)與初期未發(fā)生(S1)階段的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)MADS2定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組趨勢一致且存在顯著差異(圖3),于是,最終選擇LlMADS2作為后續(xù)研究對象。

    圖3 卷丹珠芽發(fā)生相關(guān)MADS-box關(guān)鍵基因篩選Fig.3 Screening of MADS-box key genes related to bulbil formation in Lilium lancifolium

    2.3 卷丹LlMADS2基因CDS全長克隆及其編碼氨基酸序列分析

    通過前期的轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)合定量驗證,本研究從差異表達(dá)基因中篩選出了一個可能參與調(diào)控珠芽發(fā)生的基因LlMADS2。將其轉(zhuǎn)錄本序列提交至ORF Finder找到1條全長741 bp的CDS序列,使用引物L(fēng)lMADS2-F和LlMADS2-R對卷丹LlMADS2基因進行PCR擴增,獲得1條長度約為700 bp的條帶(圖4),純化回收后連接TA/Blunt-Zero Vector載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,通過菌液PCR挑選條帶正確的陽性克隆單克隆菌液送測序。測序結(jié)果表明LlMADS2基因開放閱讀框(ORF)長741 bp,共編碼246個氨基酸。如圖中紅色框ATG為起始密碼子,藍(lán)色框TAA為終止密碼子(圖4)。

    2.4 LlMADS2基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

    系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,17種MADS-box蛋白聚為5個小分支,且具有較高的支持率,LlMADS2與臺灣百合(Liliumformosanum)中的MADS7,卷丹中的AGAMOUS-like序列處于同一個進化分支上,表明他們的親緣關(guān)系最近(圖5)。

    2.5 卷丹LlMADS2蛋白的理化性質(zhì)分析

    LlMADS2基因全長741 bp,編碼一個由246個氨基酸殘基組成的蛋白序列。對卷丹LlMADS2基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行預(yù)測分析,結(jié)果顯示,該蛋白分子式為C1 220H1 961N359O381S13,相對分子質(zhì)量為28 170.95 D,理論等電點為7.05,脂肪系數(shù)為78.90。LlMADS2蛋白的氨基酸中共含有34個帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu),34個帶正電荷氨基酸殘基(Arg + Lys)。不穩(wěn)定系數(shù)為61.14,蛋白親水性平均值為-0.698,因此LlMADS2為不穩(wěn)定疏水性蛋白(圖6-A、6-B)。LlMADS2蛋白從內(nèi)到外無跨膜區(qū)域,有接近1的概率表明該蛋白位于膜外,推測是一種非跨膜蛋白(圖6-C)。LlMADS2蛋白含有可能發(fā)生磷酸化的位點有48個,均為Tyr(酪氨酸)(圖6-D)。

    圖5 LlMADS2與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 LlMADS2 Phylogenetic tree and motif analysis of proteins homologous to other species

    2.6 卷丹LlMADS2蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析

    采用NCBICD search在線網(wǎng)站分析LlMADS2基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,該蛋白有2個specific-hits,為REC_MEF2_like和K-box位點,分別屬于MADS superfamily、K-box superfamily(圖7-A)。

    利用SOPMA在線軟件對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析。結(jié)果表明,LlMADS2蛋白的二級結(jié)構(gòu)的含量中:α螺旋(藍(lán)色c)(52.03%)>無規(guī)則卷曲(黃色c)(35.37%)>延伸鏈(紅色e)(9.35%)>β轉(zhuǎn)角(綠色t)(3.25%),因此可推斷,無規(guī)則卷曲和α螺旋是LlMADS2蛋白的主要組成成分(圖7-B)。蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行盤曲或折疊形成具有規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。利用在線軟件 SWISS-MODEL對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析,獲得了LlMADS2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖7-C)。

    圖6 LlMADS2蛋白理化性質(zhì)分析Fig.6 Physicochemical properties of LlMADS2 protein

    圖7 LlMADS2蛋白二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary and tertiary structure prediction of LlMADS2 protein

    2.7 卷丹LlMADS2在不同時期與不同部位中的表達(dá)分析

    通過qRT-PCR,對LlMADS2基因在卷丹葉腋珠芽未發(fā)生(S0)和珠芽發(fā)生初期(S1)及后期的發(fā)育時期(S2、S3)的表達(dá)量進行檢測。發(fā)現(xiàn)LlMADS2在卷丹珠芽未發(fā)生的S0時期與珠芽已發(fā)生的S1,S2,S3時期表達(dá)量具有顯著差異,與轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)趨勢整體一致(圖8-A、8-B)。在自然條件下,卷丹莖稈下部是不具備珠芽發(fā)生能力的,而上部則是可以發(fā)生珠芽的部位,于是筆者對LlMADS2在卷丹珠芽莖稈下部和上部的表達(dá)量進行了檢測,發(fā)現(xiàn)LlMADS2在卷丹莖稈上部的表達(dá)量要顯著高于下部(圖9-C)。這些結(jié)果表明,LlMADS2可能參與珠芽發(fā)生的調(diào)控,并在珠芽發(fā)生起始過程中發(fā)揮誘導(dǎo)作用。此外,還對LlMADS2在卷丹中的表達(dá)模式進行了檢測,發(fā)現(xiàn)其在卷丹的各個部位均有表達(dá),但在花柱中表達(dá)水平最高。

    圖8 LlMADS2在卷丹中的表達(dá)模式Fig.8 Expression pattern of LlMADS2 in Lilium lancifolium

    3 結(jié)論與討論

    百合病毒病是僅次于真菌病害的第二大類病害,百合在栽培過程中易受到病毒的危害,易造成鱗莖腐爛、病株枯死等的發(fā)生,嚴(yán)重影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),黃瓜花葉病毒、百合無癥病毒以及百合斑駁病毒是卷丹的主要病毒病害[25]。目前,種球播種仍是百合主要的繁殖方式,但鱗莖易受病毒侵害,且國產(chǎn)種球普遍存在的產(chǎn)量低,品質(zhì)差等問題尚未解決。而珠芽是部分百合所具有的一種特殊繁殖器官,一株百合可以產(chǎn)生幾十至上百個珠芽,大大提高了其繁殖效率,且珠芽著生于百合葉腋處,屬于地上器官,具有低毒優(yōu)勢[9,26]。但目前關(guān)于百合珠芽病毒檢測的研究很少,僅有張慧等[8]對卷丹珠芽、鱗莖和葉片中的黃瓜花葉病毒,百合無癥病毒及斑駁病毒進行了檢測和比較,證實卷丹珠芽相對于鱗莖來說確實具有病毒種類少含量低的優(yōu)勢。本研究增加了對瀘定百合、淡黃花百合及重瓣卷丹的病毒檢測,進一步證實了百合珠芽帶毒率低,是極具開發(fā)潛力的百合無性繁殖器官。珠芽發(fā)生機制的解析對于百合脫毒種球的生產(chǎn)及新型繁殖方式的開發(fā)具有重要意義。

    MADS-box轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是植物中研究最多的家族之一,這個家族的成員在植物的生長發(fā)育中起著顯著的作用[27]。前人研究證明,MADS-box基因在側(cè)生器官的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-21,28-29],其中發(fā)現(xiàn)在龍舌蘭珠芽發(fā)生過程中,AtMADS1/2/4/6/7可能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[18]。本研究通過對卷丹珠芽形成過程中轉(zhuǎn)錄組的分析,以定量結(jié)果為輔助,篩選出LlMADS2作為后續(xù)研究對象,對其進行生物信息學(xué)分析,LlMADS2屬于不穩(wěn)定疏水性蛋白,結(jié)構(gòu)也較為簡單,初步闡述了LlMADS2蛋白的理化性質(zhì)及其二三級結(jié)構(gòu)。氨基酸多序列同源比對發(fā)現(xiàn)LlMADS2與LlMADS7和LlAGAMOUS-like的同源性較高,功能上可能具有部分相似性。對于LlMADS2在卷丹珠芽形成不同時期和不同位置的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),LlMADS2在珠芽已發(fā)生時期的表達(dá)量要顯著高于未發(fā)生時期,且在具有珠芽發(fā)生能力的莖稈上部的表達(dá)要顯著高于不具備珠芽發(fā)生能力的莖稈下部。這說明LlMADS2可能正向調(diào)控卷丹珠芽的發(fā)生,這可能是由于物種間遺傳背景的差異所導(dǎo)致的。時空表達(dá)模式說明LlMADS2在卷丹各部位具有表達(dá),但在花柱中最高,其屬于MADS-box基因家族這也具有合理性,且有研究表明珠芽的發(fā)生與花芽的分化具有一定聯(lián)系[18],推測LlMADS2通過影響花芽分化進而對珠芽的發(fā)生造成影響。

    目前,與MADS-box家族基因調(diào)控珠芽形成的相關(guān)研究較為匱乏,LlMADS2調(diào)控珠芽發(fā)生的具體機制仍需進一步的探究。本研究通過對4種可發(fā)生珠芽的百合鱗莖和珠芽的病毒檢測,證實了珠芽的低毒優(yōu)勢,說明對于珠芽發(fā)生機制解析的重要性。且對MADS-box轉(zhuǎn)錄因子LlMADS2在卷丹珠芽形成過程中的表達(dá)模式進行了分析,對其功能進行了初步的推測,為進一步探究LlMADS2調(diào)控珠芽形成機制提供了參考。

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