黑曲霉發(fā)酵脫脂麥胚過程中抗氧化活性變化研究

馮軍偉，劉世欣，段蘭蘭，侯銀臣，董必輝，董得平，王曉飛，隋志方

（1.河南飛天農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司，河南 鶴壁 456750；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.鶴壁市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南 鶴壁 458000）

小麥?zhǔn)鞘澜缛蠹Z食作物之一，中國(guó)是世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)[1-2]。麥胚占整個(gè)小麥籽粒的2%～3%，是小麥籽粒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的部分，年蘊(yùn)藏量約420～480萬t，而利用率卻不足2%，開發(fā)潛力巨大由于麥胚本身不易儲(chǔ)藏和極易氧化的特性等原因，目前對(duì)小麥胚芽的開發(fā)利用還不夠充分，利用率并不高，造成大量浪費(fèi)[3-4]。麥胚營(yíng)養(yǎng)豐富，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“人類天然的營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”[5]，富含蛋白質(zhì)[6]、脂肪[7]、糖類物質(zhì)[8]、纖維素、半纖維素、多種水溶性維生素、礦物質(zhì)及一些微量的生理活性物質(zhì)[9]。麥胚不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有多種生理活性功能，如抗過敏[10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、降血壓[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]、抗炎[15]等。黑曲霉（Aspergillus niger）能產(chǎn)生豐富的酶系，如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種[16]，微生物發(fā)酵制備生物活性肽是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。趙朋輝等[17]以抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了黑曲霉發(fā)酵麥胚工藝，并對(duì)醇沉組分的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究；牛麗亞等[18]對(duì)黑曲霉發(fā)酵麥胚提取黃酮的工藝條件進(jìn)行了研究；另外也有利用枯草芽孢桿菌、酵母等微生物對(duì)麥胚發(fā)酵的相關(guān)研究[19]。

本研究以脫脂麥胚為原料，利用黑曲霉（Aspergillus niger）對(duì)其發(fā)酵，采用動(dòng)態(tài)活性追蹤等方法研究了發(fā)酵過程中發(fā)酵產(chǎn)物體外抗氧化活性、蛋白酶活及發(fā)酵液中蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化。發(fā)酵液中蛋白酶活及蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化解釋了發(fā)酵液抗氧化變化的原因，旨在為黑曲霉可控制發(fā)酵麥胚生產(chǎn)抗氧化活性肽提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂麥胚：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；黑曲霉（Aspergillus niger）：來源于河南工業(yè)大學(xué)菌株保藏中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基：美國(guó)Sigma公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：北京索萊寶科技有限公司；氧化鐵、硫酸亞鐵、考馬斯亮藍(lán)、水楊酸、福林酚、30%雙氧水、酪氨酸（均為分析純）：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；氯乙酸、天青I、鄰苯三酚、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀（均為分析純）：合肥千盛生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切塊，煮沸后取過濾液，添加20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，添加蒸餾水至1 L，分裝后，121 ℃滅菌20 min。PDA液體培養(yǎng)基不添加瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；H1850R醫(yī)用冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-1S無菌工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA224電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BlueStar B紫外可見分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；DHP-080電熱恒溫培養(yǎng)箱：鄭州生元儀器有限公司；TS-2112B搖床：無錫瑪瑞特科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉種子液制備

將保存的黑曲霉在PDA瓊脂培養(yǎng)基上活化，然后挑取活化好的菌絲接種到裝液量為150 mL的PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培并制備發(fā)酵種子液，活化和擴(kuò)培條件均為培養(yǎng)溫度28 ℃、120 r/min，培養(yǎng)時(shí)間36 h。

1.3.2 黑曲霉發(fā)酵脫脂麥胚

脫脂麥胚按照料液比1∶9（g∶mL）的比例加入蒸餾水，121 ℃滅菌20 min。按照接種量10%接入黑曲霉種子液，28 ℃條件下，置于120 r/min的搖床上發(fā)酵。取出不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)定其體外抗氧化活性、蛋白含量、蛋白酶活等指標(biāo)。

1.3.3 脫脂麥胚黑曲霉發(fā)酵液體外抗氧化活性

（1）DPPH·清除能力

參考HOU Y C等[20]的方法，略作修改。取發(fā)酵上清液0.2 mL，然后加入2.8 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇補(bǔ)足至3 mL，混勻后再加入3 mL DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)30 min后，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值（Ai）?？瞻讓?duì)照為發(fā)酵上清液0.2 mL，加入5.8 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇補(bǔ)足6 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，測(cè)定吸光度值（Aj）?？瞻捉M為3 mL甲醇溶液和3 mL DPPH溶液搖勻混合，室溫避光反應(yīng)30 min，測(cè)定吸光度值（A0），按下式計(jì)算發(fā)酵上清液對(duì)DPPH·的清除率：

（2）O2-·清除能力

參照郝董林[21]超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定方法，略作修改。取兩支25 mL比色管，分別加入5.0 mL0.2 mmol/L天青I溶液和1.4 mL pH 9.0的Tris-HCl緩沖溶液后，向其中一支加入0.80 mL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，另一支不加。分別用水稀釋至刻度，在室溫條件下反應(yīng)15 min，以水為參比，用1 cm比色皿在波長(zhǎng)602 nm處測(cè)定體系的吸光度。設(shè)不加鄰苯三酚時(shí)體系的吸光度值為A0，加入鄰苯三酚后體系的吸光度值為A1，按上述步驟操作，在加入5.00 mL天青I溶液和pH 9.0 的緩沖溶液后，向其中一支比色管中加入樣品，再分別加入0.80 mL鄰苯三酚溶液，用水稀釋至刻度定容后，搖勻。室溫條件下反應(yīng)9 min后，分別測(cè)定吸光度值，加樣品的溶液的吸光度值記為A2。

（3）·OH的清除能力測(cè)定

參照劉皓涵等[22]的方法，略作修改。取1.0 mL待測(cè)液與1.0 mL 9 mmol/L的FeSO4、1.0 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇和1.0 mL 8.8 mmol/L的H2O2混勻后37 ℃靜置反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度值（A1），空白溶液不添加H2O2溶液（A0），參比溶液不添加H2O2（Ax0）。羥自由基清除能力計(jì)算公式如下：

（4）總還原力的測(cè)定

分別精密吸取不同發(fā)酵時(shí)間的麥胚提取液0.1 mL置于試管中，然后加入0.9 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇補(bǔ)足至1 mL，同時(shí)精密吸取1.0 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為空白對(duì)照，然后依次加入2.5 mL磷酸緩沖液，再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合搖勻，封口后，置于水浴鍋中50 ℃恒溫水浴20 min。水浴結(jié)束后迅速冷卻，再加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液，混合搖勻，4 000 r/min離心10 min后精密量取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸餾水、1.0 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混合搖勻，靜置10 min后在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值（A700nm值），以A700nm值大小直接衡量其還原力大小[23]，A700nm值越大，還原能力越大，表示其抗氧化活性越強(qiáng)。

1.3.4 蛋白含量的測(cè)定

采用Folin-酚顯色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[24]。將100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液以梯度濃度加入，依次加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液，F(xiàn)olin-酚試劑，迅速混合均勻，將其放置于40 ℃的水浴鍋中加熱20 min，取出后迅速冷卻，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色，在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)650nm。以牛血清白蛋白含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.030 9x+0.032 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.957 5。

1.3.5 蛋白酶活力的測(cè)定

參考劉珊[25]的方法，略有改進(jìn)。將100 μg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成不同濃度梯度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL），各取1.00 mL，分別加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL，福林試劑使用溶液1.00 mL，置于40 ℃水浴中反應(yīng)20 min，以不含酪氨酸的為空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)680 nm處分別測(cè)定其吸光度值，以酪氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.010 1x-0.003 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6。

蛋白酶活力的測(cè)定：先將2%酪蛋白溶液1 mL放入40 ℃水浴5 min后各加入1 mL樣液，取一支作為空白管，加2 mL三氯乙酸，其他3管作為測(cè)試管各加入1 mL酪蛋白，搖勻，40 ℃保溫10 min，取出試管，3支測(cè)試管中各加入2 mL三氯乙酸，空白管中加1 mL酪蛋白，靜置10 min，過濾各取1 mL濾液，加入0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL、福林試劑1 mL，在40 ℃顯色20 min，以空白管調(diào)零，在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定OD680nm值。在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U/mL）。蛋白酶活計(jì)算公式如下：

式中：A為樣品平行試驗(yàn)的平均OD680nm值；K為吸光常數(shù)；4為反應(yīng)試劑的總體積，mL；10為酶解反應(yīng)時(shí)間，min；n為酶液稀釋總倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液體外抗氧化活性分析

2.1.1 發(fā)酵液清除DPPH·能力

由圖1可知，脫脂麥胚本身具有一定的DPPH·清除能力，這主要是因?yàn)辂溑弑旧砗卸喾印ⅫS酮及一些肽類[26]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，0～36 h內(nèi)無顯著變化（P＞0.05），此時(shí)主要是黑曲霉生長(zhǎng)階段，發(fā)酵36 h后，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其對(duì)DPPH·的清除能力呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到84 h時(shí)，其清除DPPH·的能力最強(qiáng)，為75.68%，隨后減弱，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中黑曲霉分泌的蛋白酶降解了脫脂麥胚中的蛋白，生成了小分子肽等抗氧化活性成分，從而造成發(fā)酵液清除DPPH·能力逐漸增加，隨后可能是由于抗氧化活性成分的過度水解或者被氧化造成其對(duì)DPPH·的清除能力逐漸減弱。

圖1 發(fā)酵過程中發(fā)酵液清除DPPH·能力變化Fig.1 Changes of DPPH·scavenging ability of fermentation broth during fermentation process

2.1.2 發(fā)酵液清除·OH能力

由圖2可知，隨著脫脂麥胚發(fā)酵時(shí)間在0～120 h的延長(zhǎng)，發(fā)酵液對(duì)·OH的清除能力呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，發(fā)酵36 h后，增加幅度明顯增強(qiáng)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到84 h時(shí)，發(fā)酵液的·OH清除能力達(dá)到峰值，為80.40%，隨后呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。

圖2 發(fā)酵過程中發(fā)酵液清除·OH能力變化Fig.2 Changes of·OH scavenging ability of fermentation broth during fermentation process

2.1.3 發(fā)酵液清除O2-·能力

由圖3可知，隨著脫脂麥胚發(fā)酵時(shí)間在0～84 h的延長(zhǎng)，發(fā)酵上清液對(duì)O2-·的清除能力逐漸緩慢上升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到60 h時(shí)后上升幅度較大，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為84 h時(shí)，其對(duì)O2-·的清除能力達(dá)到最大值，為40.7%，之后又隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。

圖3 發(fā)酵過程中發(fā)酵液清除O2-·能力變化Fig.3 Changes of O2-·scavenging ability of fermentation broth during fermentation process

2.1.4 發(fā)酵液總還原力

對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的上清液總還原力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉發(fā)酵脫脂麥胚上清液的還原力與其他體外抗氧化活性呈現(xiàn)較為類似的趨勢(shì)，緩慢上升后逐漸下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為84 h時(shí)，發(fā)酵上清液總還原力達(dá)到最大值，吸光度值達(dá)到0.476 7。

圖4 發(fā)酵過程中發(fā)酵液總還原力變化Fig.4 Changes of total reducing power of fermentation broth during fermentation process

2.2 發(fā)酵上清液蛋白含量變化

檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的脫脂麥胚發(fā)酵液蛋白含量，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，脫脂麥胚發(fā)酵液中的蛋白含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到108 h時(shí)，蛋白含量達(dá)到最大值21.92 mg/mL，之后略有下降，但無顯著變化（P＞0.05）。麥胚本身有一定的水溶性蛋白和肽類，因此發(fā)酵初期其發(fā)酵液中含有一定的蛋白含量，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)黑曲霉發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生蛋白酶，這些蛋白酶造成非水溶性蛋白質(zhì)的降解生成一些肽類、氨基酸和小分子的水溶性蛋白，因此發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這也說明發(fā)酵液的體外抗氧化活性的升高與發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)，這與枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究?jī)?nèi)容相符合[27]。

圖5 發(fā)酵過程中發(fā)酵液蛋白含量變化Fig.5 Changes of protein contents of fermentation broth during fermentation process

2.3 發(fā)酵液蛋白酶活力變化

檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的脫脂麥胚發(fā)酵液蛋白酶活力變化，結(jié)果見圖6。由圖6可知，發(fā)酵時(shí)間在0～108 h范圍內(nèi)，黑曲霉發(fā)酵脫脂麥胚上清液蛋白酶活力變化呈現(xiàn)緩慢上升后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，發(fā)酵液蛋白酶活力達(dá)到最大值，為269.35 U/mL，之后保持平穩(wěn)，發(fā)酵108 h后蛋白酶活呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槊富盍p失造成。

圖6 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中蛋白酶活力變化Fig.6 Changes of protease activity of fermentation broth during fermentation process

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，隨著脫脂麥胚發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液對(duì)DPPH·、·OH和O2-·的清除能力及其總還原力均呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到84 h時(shí)，發(fā)酵液的體外抗氧化活性最佳，其清除DPPH·的能力為75.68%，清除·OH能力為80.40%，清除O2-·能力為40.7%，總還原力為0.4767（A700nm）。體外抗氧化活性的變化趨勢(shì)與發(fā)酵液中蛋白含量的增加密不可分，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，脫脂麥胚發(fā)酵液中的蛋白含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到108 h時(shí)，發(fā)酵液蛋白含量達(dá)到最大值21.92 mg/mL，而發(fā)酵液蛋白含量的提高又是因?yàn)楹谇拱l(fā)酵脫脂麥胚過程中分泌蛋白酶所致，因此黑曲霉發(fā)酵脫脂麥胚過程中可以通過分泌的蛋白酶對(duì)麥胚中的蛋白進(jìn)行降解，生成具有抗氧化活性的多肽。本研究為脫脂麥胚抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。