魚露中揮發(fā)性成分的形成及影響因素分析

林 威，章文賢，2，黃祖新，2，蔣詠梅，2*

（1.福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建省傳統(tǒng)釀酒行業(yè)技術開發(fā)基地，福建 福州 350117）

魚露又稱魚醬油，風味獨特，營養(yǎng)豐富，含有必需氨基酸、?；撬帷⒕S生素、微量元素等[1]，是中國沿海和東南亞等地區(qū)常見的調味品。魚露的歷史悠久，曾記載于2 200多年前的《周禮》和1 400多年前賈思勰的《齊民要術》中，19世紀后期，希臘南部和意大利也開始魚露的生產[2]。傳統(tǒng)魚露的制作方法通常是以鳀魚、沙丁魚等低值海魚為原料，添加大量鹽，在常溫條件下發(fā)酵數(shù)月、甚至數(shù)年而成。發(fā)酵過程中，高濃度鹽使發(fā)酵體系的滲透壓提高，抑制了絕大多數(shù)霉腐微生物的生長，在原料魚內源酶與耐鹽微生物的雙重作用下，魚肉中的蛋白質和脂肪被水解利用，最終形成體態(tài)澄清、口味醇厚、風味突出的成品魚露[3-4]。

魚露的風味主要由滋味與氣味組成，滋味即非揮發(fā)性成分，主要包括氨基酸、短肽鏈、核苷酸和生物堿，它們可產生酸、甜、咸、鮮、苦五種基本味道，主要通過氨基酸組分分析和電子舌滋味分析。氣味即指揮發(fā)性成分，是評價魚露品質的重要指標[5]，主要包括醇、醛、酮、酸和酯類以及一定量的胺類化合物與腥味物質[6]。它們易于揮發(fā)，可刺激鼻腔神經(jīng)感受到炙烤香、魚腥味、奶酪香、肉香、黃油爆米花味等復雜風味，目前常采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進行分析。本文對魚露中主要揮發(fā)性成分的來源、種類及其形成的相關因素進行綜述，為后期魚露發(fā)酵工藝的改良和成品風味品質的提升提供參考。

1 魚露中主要揮發(fā)性成分的來源和種類

魚露中揮發(fā)性成分主要來源于原料中內源酶的作用和微生物的分解（圖1）。在內源酶和微生物的協(xié)同作用下，魚肉和內臟中的蛋白質和脂肪先被水解為游離氨基酸和游離脂肪酸等初級代謝產物，再經(jīng)次級代謝產生各種具有揮發(fā)性成分的化合物。蛋白質經(jīng)蛋白酶和氨肽酶分解而成的短肽和游離氨基酸，不僅呈現(xiàn)一定的滋味，也是揮發(fā)性物質的前體，在多種微生物酶的催化下，它們通過轉氨、脫氨、脫羧等生成酸、醇、醛、酯和含硫化合物等特征風味物質，如異亮氨酸、纈氨酸可代謝生成有果香味、麥芽風味的3-甲基丁醛和2-甲基丁醛，天冬氨酸能分解產生黃油味的雙乙酰，鳥氨酸和賴氨酸可經(jīng)脫羧生成腐胺和尸胺等。由脂肪水解得到的游離脂肪酸通過自動氧化，以及還原、氧化或酯化反應生成醇、醛、酮、酸、酯類等代謝產物，飽和脂肪酸則可經(jīng)不完全β-氧化生成甲基酮和內酯等重要風味物質[7]。研究發(fā)現(xiàn)，魚露發(fā)酵過程中脂質的氧化與揮發(fā)性化合物的增加具有顯著的相關性，亞油酸的氧化產物1-辛烯-3-醇以及醛類物質（己醛、庚醛、2-甲基丙醛等）的含量，在一定程度上可以反映魚露發(fā)酵過程中脂肪酸的氧化程度，這說明魚露中揮發(fā)性小分子風味物質的前體大多來源于脂肪的氧化代謝[8]。

圖1 魚露中揮發(fā)性成分的主要來源Fig.1 Main sources of volatile components in fish sauce

原料中的蛋白質和脂肪在內源酶和微生物分解的雙重作用下，產生了錯綜復雜的揮發(fā)性產物，經(jīng)GC-MS分析鑒定，它們大致可分為醇類、醛類、酮類、酯類、酸類、烷烴類、雜環(huán)化合物、含氮化合物和含硫化合物等類（表1）。由表1可見，不同產地的魚露所含揮發(fā)性成分的種類有明顯差異，導致魚露呈現(xiàn)的風味也各有千秋。

表1 魚露中的揮發(fā)性成分種類Table 1 Types of volatile components in fish sauce

大多數(shù)魚露中，醇、酸、醛、酮、酯類是主要的揮發(fā)性成分，但其濃度高低并不一定能夠反映魚露的風味。這是因為不同化合物的嗅覺最低感受濃度（閾值）不同，閾值越低的化合物越容易被嗅覺器官感知[16]。醇類化合物中的不飽和醇閾值較低，對魚露風味的貢獻較大。醛類化合物來源于脂質氧化的降解產物，一般有草味、甜味、麥芽味和果香味等令人愉快的氣味。酮類化合物與多不飽和脂肪酸和氨基酸的降解有關[17]，一般有醚味和奶酪味。酯類化合物主要來源于醇類和酸類物質的酯化反應，閾值較低，呈現(xiàn)果香味和花香味[18]。酸類化合物則來源于脂肪氧化和水解[19]，常帶有汗味、腐敗味等不愉快氣味，但因其閾值較高，對風味的影響不大。含氮化合物有三甲胺和組胺、以及微量的吡嗪、吡啶等，它們常帶有燒焦味和氨味。

隨著技術不斷完善，魚露中檢測到的揮發(fā)性物質也逐漸增多，但由于閾值的影響，眾多揮發(fā)性化合物中僅有小部分化合物對魚露的香氣有貢獻。王悅齊等[9]從發(fā)酵1～12個月的魚露中檢測到56種揮發(fā)性化合物，并以氣味活度值（odor activity value，OAV）為評價指標，從中篩選到12種OAV＞1的主體呈香風味化合物，包括2種醇類，7種醛類，1種酯類和2種含氮化合物（表2），其中3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丙醛和乙酸乙酯，它們對魚露的整體香氣貢獻最為顯著，使魚露呈現(xiàn)蘑菇味、土豆味、麥芽味、香草味、水果香味和魚腥味。在諸多揮發(fā)性成分，尤其主體呈香化合物的綜合作用下，不同來源的魚露風味各異，如泰國魚露有焦糊味、腥味、汗味、腐臭味和奶酪味[20]，韓國與泰國的市售魚露有花香味、草香味、干酪味、杏仁味與汗臭味[10]，王炳華等[21]則以酒香、花香、果香、汗臭味、苦味和魚腥味來描述魚露的風味。

表2 魚露發(fā)酵過程中的主體呈香化合物[9]Table 2 Main aroma compounds in fish sauce fermentation

2 魚露中揮發(fā)性成分形成的影響因素

影響魚露中揮發(fā)性成分形成的因素很多，以下主要從魚露的發(fā)酵原料、制作工藝、微生物種類和發(fā)酵時間幾方面加以介紹。

2.1 發(fā)酵原料

用于魚露發(fā)酵的原料較多，產地不同，所用魚的種類大多不同，如日本Shottsuru常采用沙丁魚、柔魚，泰國Nam-pla采用日本鳀和日本鯖，越南Chin Su采用鳳尾魚，中國香港除用沙丁魚、日本鳀之外，也用麗葉鲹和褐藍子魚發(fā)酵制作魚露[22]。廣東潮汕一帶則主要以鳀魚，鮮魚作為原料進行魚露的制作，魚種不同導致成品魚露的口感和風味差別較大。陳麗麗等[11]對6種魚露樣品（原料分別為鰻魚、鳳尾魚、草魚魚露、鳀魚魚露、鮮魚魚露和銀魚魚露）的揮發(fā)性化合物進行全二維氣相色譜-質譜（GC×GC-MS）檢測，分別得到178、80、138、77、54和118種揮發(fā)性成分，其中，作為主要揮發(fā)性成分的醇類與醛類化合物，分別占六種魚露揮發(fā)性產物的35.50%、24.71%、33.23%、24.59%、25.70%和39.76%，差異顯著。

江津津等[23]以鳀魚、藍圓鲹、綠鰭馬面鲀和丁香魚（鳀魚幼魚）為原料用傳統(tǒng)工藝制作魚露，經(jīng)GC-MS和電子鼻檢測，發(fā)現(xiàn)藍圓鯵魚露中揮發(fā)性化合物最多，有17種，包括6種醛類，3種酸類，3種含硫化合物，這可能與藍圓鲹中含有較高的蛋白質含量有關。除了魚的種類，魚的成熟度也對魚露的風味有一定影響。與丁香魚（鳀魚幼魚）相比，成熟的鳀魚中蛋白質和脂肪含量較高[24]，因而產生的揮發(fā)性化合物也較多。

2.2 發(fā)酵工藝

采用不同的發(fā)酵工藝，得到的成品魚露也有較大差別。目前魚露的生產主要采用傳統(tǒng)工藝和速釀工藝。傳統(tǒng)工藝即天然發(fā)酵，是將原料魚與鹽按一定的比例混合，在自然條件下經(jīng)前期腌制自溶、中期露天發(fā)酵和后期保溫后熟三階段，再進行勾兌、滅菌和成品包裝的制作工藝[25]。傳統(tǒng)發(fā)酵通常在高鹽濃度下進行，高鹽導致的高滲條件雖然抑制了大多數(shù)腐敗微生物的生長，但同時也降低了水解酶的活性與其他微生物的繁殖速率，因而發(fā)酵周期較長。

與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，速釀工藝可明顯縮短魚露的生產周期，常通過保溫、加酶、加曲和復合發(fā)酵等方式實現(xiàn)，但由于發(fā)酵時間短，存在成品風味變差和產生異味的風險[26]。保溫工藝即將發(fā)酵過程維持在較高溫度下，使內源酶迅速降解原料魚中的蛋白質和脂肪從而提高生產效率。研究發(fā)現(xiàn)印度鳳尾魚在60 ℃保溫時自溶活性最高，起主要作用的是胰蛋白酶[27]。高溫發(fā)酵雖節(jié)省時間，但常導致成品顏色變淺，風味欠佳，先低溫后高溫的方式可以有效避免這種現(xiàn)象[28]。

加酶工藝即在發(fā)酵時添加外源蛋白酶或富含蛋白酶的魚內臟，從而增強原料中蛋白質的水解速率，進而達到快速發(fā)酵的目的。加入少量富含蛋白酶的大西洋鱈魚腸，可有效提高蛋白質的利用率和縮短魚露的發(fā)酵時間[29]。RABIE M A等[30]以鯖魚為原料，外加菠蘿蛋白酶進行發(fā)酵，不僅縮短了魚露的生產周期，成品的風味和營養(yǎng)價值均有明顯提高。王正云等[31]以草魚下腳料為原料，添加0.3%復合蛋白酶（中性蛋白酶∶風味蛋白酶=1∶1），50 ℃發(fā)酵，得到的魚露口感咸鮮，入口滑爽，符合國家二級醬油標準。

加曲發(fā)酵首先需要培養(yǎng)曲種，通常以米曲霉為主，也可采用醬油曲[32]或酒曲[33]，這些曲塊含有大量微生物及其分泌的復雜酶系，可以加快原料魚中蛋白質和脂肪的水解速率，從而有效縮短發(fā)酵時間。在曲塊中眾多微生物和復雜酶系的作用下，原料魚中的營養(yǎng)成分被分解轉化為種類繁多的代謝產物，揮發(fā)性成分也往往較為多樣，因而加曲發(fā)酵所得魚露風味通常優(yōu)于保溫和加酶工藝。以草魚下腳料為原料，添加含有米曲霉和黑曲霉的混合曲發(fā)酵，可得到風味獨特的成品魚露。劉鵬飛[34]采用GC-MS技術比較市售傳統(tǒng)魚露與外加曲發(fā)酵魚露的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)外加曲魚露有26種，明顯高于市售魚露。然而，王炳華等[21]在比較傳統(tǒng)發(fā)酵法、加曲發(fā)酵法和復合發(fā)酵法（前期加曲，后期添加乳酸乳球菌乳亞種（L.lactissubsp.lactis）和球形球擬酵母）三種工藝時，得到了不同的結果，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵法制備的魚露揮發(fā)性成分更多，且成品風味濃郁，品質上乘?？梢婔~露的品質不僅取決于發(fā)酵工藝，還與原料種類、微生物種類和數(shù)量，以及發(fā)酵條件密切相關。

2.3 發(fā)酵微生物

魚露發(fā)酵過程中，微生物的菌群結構，尤其優(yōu)勢菌的種類和數(shù)量對關鍵特征風味物質的形成起著決定作用。

黃紫燕等[35]采用菌落培養(yǎng)法，對傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中微生物動態(tài)進行檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期、中期和后期的優(yōu)勢菌群分別為霉菌、酵母菌和乳酸菌，且菌群結構的變化與各項理化指標及游離氨基酸的變化有著密切的關系。首先，霉菌分泌大量蛋白酶和脂肪酶，將魚肉中的蛋白質和脂肪分別水解為多肽、氨基酸和脂肪酸。接著，鹽滲入魚體，魚汁滲出，環(huán)境中滲透壓顯著提高，霉菌逐漸被乳酸菌和酵母菌代替，產生大量醇、酸、醛、酯等滋味和風味物質。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中約99%的微生物無法用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方式培養(yǎng)。為更加全面深入地研究傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中微生物群落的演替規(guī)律，李春生等[36]采用高通量測序技術對魚露發(fā)酵樣品菌群的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進行，細菌的種類呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵6個月時，細菌種類可達到312種。由于是高鹽環(huán)境，主要的發(fā)酵微生物大多屬于嗜鹽菌。發(fā)酵前期鹽厭氧菌屬（Halananaerobium）相對豐度最高，它與三甲胺和乙酸乙酯的形成分別呈正相關和負相關，可能通過抑制魚露中水果香味的產生促進傳統(tǒng)魚露中魚腥味的生成。發(fā)酵中后期，鹽單胞菌屬（Halomonas）成為優(yōu)勢菌群，它與2-甲基丙醛的形成呈正相關，可能與魚露中麥芽香味的形成有關。

DU F等[37]也對中國傳統(tǒng)魚露的發(fā)酵微生物進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、四聯(lián)菌屬（Tetragenococcus）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）與游離氨基酸、可溶性總氮、三甲胺的產生有很高的相關性。其中鹽厭氧菌屬與假交替單胞菌屬在三甲胺的形成過程中起促進作用，而四聯(lián)菌屬則起抑制作用。發(fā)酵初期，希瓦氏菌屬（Shewanella）為優(yōu)勢菌群，占細菌總量的90%左右，發(fā)酵12個月后，希瓦氏菌屬被鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）取代。3月到9月乳酸桿菌（Lactobacillus）大量存在。發(fā)酵12～15個月，四聯(lián)菌屬（Tetragenococcus）成為魚露中的主導細菌，后期假單胞菌（Pseudomonas）則大量出現(xiàn)。

2.4 發(fā)酵時間

傳統(tǒng)魚露發(fā)酵的時間較長，短則12～18個月，長則2～3年。通常，魚露的發(fā)酵時間越長，原料魚的蛋白質和脂肪被降解得越充分，產生的揮發(fā)性物質越多，風味也更加醇厚香濃。肖宏艷等[12]對傳統(tǒng)發(fā)酵1年、2年、3年和3年后保溫1周的潮汕魚露中的揮發(fā)性成分進行分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間不同，魚露中揮發(fā)性酸、醇、醛、酮和含氮、含硫化合物的相對含量變化明顯。其中醛、酮和含氮化合物的含量隨時間增加而增大，醇類則呈下降趨勢。王悅齊等[9]對發(fā)酵時間為1個月、3個月、6個月、9個月和12個月的魚露中的揮發(fā)性成分進行檢測，發(fā)現(xiàn)除酮類變化不大之外，其他揮發(fā)性成分的數(shù)量及濃度均隨發(fā)酵時間的延長有所增加，醛類和醇類化合物的總含量明顯高于其他揮發(fā)性化合物，隨發(fā)酵時間的延長，主體呈香風味化合物的OAV也普遍呈上升趨勢。

2.5 其他影響因素

除原料、工藝、微生物和發(fā)酵時間之外，發(fā)酵溫度和鹽漬濃度也對成品魚露的風味有較大影響。保溫是速釀工藝之一，加曲和加酶發(fā)酵工藝也對溫度有著明確的要求。將傳統(tǒng)發(fā)酵2年的魚露置于60 ℃條件保溫8 d，揮發(fā)性成分有明顯增加，風味物質的種類及含量與發(fā)酵3年的魚露相當[38]。發(fā)酵鹽濃度對魚露中揮發(fā)性成分的形成也有顯著影響，高鹽濃度雖會延緩魚露的發(fā)酵進程，但更有利于魚露中乳酪味和肉香味氣味的揮發(fā)性成分的產生[39]。

3 總結與展望

魚露中的揮發(fā)性成分組成復雜，種類繁多，是發(fā)酵原料、制作工藝、微生物菌群結構和發(fā)酵時間等多種因素共同作用的結果。近年來，魚露中揮發(fā)性成分逐漸受到科研工作者的重視，相關研究也明顯增多，但仍存在一些不足之處。

（1）魚露中揮發(fā)性產物的種類和數(shù)量尚不明確。盡管檢測手段越來越先進，如氣味指紋技術與氣相色譜-人工嗅辨儀-質譜聯(lián)用，但由于魚露中揮發(fā)性成分種類繁多，檢測結果往往重復性不佳，這也是后期研究的方向。

（2）揮發(fā)性成分的形成機制仍需探索。雖然目前已知其通常是以初級代謝產物為前體產生的小分子物質，但對于某種具體的揮發(fā)性產物，它的微生物來源，及其具體的代謝途徑還需要進一步摸索。

（3）發(fā)酵工藝仍需改進。當前市售魚露主要通過傳統(tǒng)工藝制作，產品優(yōu)質，但發(fā)酵周期過長。速釀工藝雖然有助于縮短發(fā)酵時間，但會影響揮發(fā)性成分的形成，導致成品的風味變差。因此有研究者先采用速釀工藝制作魚露，再對其進行Maillard反應或外加L-丙氨酸[40]等產品進行后加工。考慮到魚露中揮發(fā)性成分主要來源于微生物的發(fā)酵作用，也可以通過構建微生物菌群與魚露發(fā)酵周期中的揮發(fā)性成分關系圖譜，在魚露制作過程中適時添加特定微生物，以調控發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的形成，從而提高魚露的整體風味。

作為傳統(tǒng)調味品，魚露的風味是極為關鍵的判斷依據(jù)。在眾多構成和濃度各不相同的揮發(fā)性成分的綜合作用下，成品魚露才得以呈現(xiàn)濃醇鮮香的特征性風味。因此，深入探究魚露特征揮發(fā)性風味化合物形成的機制及影響因素顯得尤為重要，相關研究不僅有助于開拓發(fā)酵魚露制作的新工藝，提升成品魚露的品質，也可以為其他微生物發(fā)酵制品的風味研究提供參考。