幾種蘭屬地生種花瓣花色素組成分析

劉 紅， 魏曉羽， 馬 輝， 瞿 輝， 孫 葉

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州225007；2.江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,江蘇南京210019)

蘭屬(CymbidiumSw.)是蘭科(Orchidaceae)下的一個(gè)屬，蘭屬植物多為附生或地生草本，罕見(jiàn)腐生，多分布于中國(guó)、日本、馬來(lái)西亞、印度北部、菲律賓與婆羅洲，以及澳洲北部等亞熱帶、熱帶地區(qū)。全屬約有48個(gè)種，中國(guó)分布有29種，其中地生蘭種類如春蘭(Cymbidiumgeoringii)、蕙蘭(Cymbidiumfaberi)、建蘭(Cymbidiumensifolium)、墨蘭(Cymbidiumsinense)、寒蘭(Cymbidiumkanran)、春劍(Cymbidiumlongibracteatum)和蓮瓣蘭(Cymbidiumlianpan)等被稱為中國(guó)蘭花，簡(jiǎn)稱國(guó)蘭，在中國(guó)有數(shù)千年栽培鑒賞的歷史。傳統(tǒng)國(guó)蘭優(yōu)良品種是從野生資源中篩選出的極少數(shù)符合中國(guó)蘭花“瓣型理論”標(biāo)準(zhǔn)的自然變異種[1]，是中國(guó)特有的珍稀蘭花種質(zhì)資源[2]，但是傳統(tǒng)國(guó)蘭優(yōu)良品種的花色以綠色為主色，色花瓣型品種十分稀有。隨著人們蘭花鑒賞觀的演變，色花類型越來(lái)越受到推崇。大花蕙蘭(Cymbidiumhybridum)是以蘭屬中一些大花型附生型品種為親本，經(jīng)過(guò)多代雜交選擇培育出來(lái)的花型大、色彩鮮艷、生長(zhǎng)強(qiáng)健的優(yōu)良品種，目前已經(jīng)發(fā)展成為全球五大重要的蘭花商品盆花和切花之一，但是大花蕙蘭具有無(wú)香味、葉型散亂等缺點(diǎn)，并且在中國(guó)南方地區(qū)不易開(kāi)花[3]。近年來(lái)，通過(guò)國(guó)蘭與大花蕙蘭種間雜交，選育兼具二者優(yōu)點(diǎn)的新品種，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)蘭花人工育種的熱點(diǎn)之一。

花色作為觀賞植物最重要的性狀，主要受到花色素組成及含量的影響[4]。植物花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素、葉綠素和生物堿四大類。其中類胡蘿卜素可使花呈現(xiàn)黃色或橙色，葉綠素可使花呈現(xiàn)綠色，甜菜色素可使花呈現(xiàn)紅色或黃色。類黃酮是形成花色的重要色素，可分為花青素、花黃素2類?；ㄇ嗨赜址Q花色素，可使花呈現(xiàn)紅色或紫紅色，主要的花青素包括矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥色素、錦葵色素和矮牽牛素6大類，其中矢車菊素主要呈品紅色至紅色，芍藥色素主要呈紫紅色至紅色[5]?；ㄇ嗨氐募谆Ⅴ；疤腔寄芤鸹ㄉ淖兓?，花青素的甲基化、糖基化可使紅色加深[6]?；S素主要由黃酮醇、黃酮、黃烷酮、查爾酮等組成，除查爾酮為深黃色外，其他為淡黃色或無(wú)色[7]，花黃素可能通過(guò)與花青素共色素化而參與花的呈色過(guò)程[8]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)蘭科植物花色素的研究逐漸加深，尤其是對(duì)類黃酮代謝物組成與結(jié)構(gòu)的鑒定取得了一定進(jìn)展，在蝴蝶石斛蘭、卡特蘭、文心蘭、大花蕙蘭、金釵石斛蘭、獨(dú)蒜蘭等蘭科植物上已經(jīng)開(kāi)展了相關(guān)研究[9-14]，而關(guān)于春蘭、墨蘭和蓮瓣蘭等蘭屬植物花色素組成的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)液-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)24種不同色系的中國(guó)蘭、大花蕙蘭及相關(guān)雜交種等蘭屬植物花色素成分進(jìn)行分析，以期為蘭屬植物花色形成機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，為蘭花新品種選育提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及采集

參試的24份材料(表1、圖1)取自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所花卉課題組蘭花種質(zhì)資源圃，包括8份春蘭材料(A～H)、4個(gè)墨蘭品種(I～L)、4個(gè)蓮瓣蘭品種(M～P)、4個(gè)大花蕙蘭品種(Q～T)及4個(gè)春蘭與大花蕙蘭雜交種(U～X)。

表1 24份蘭屬參試材料

除春蘭大富貴分別選取花蕾期苞片和盛開(kāi)期舌瓣、外瓣，玉兔選取盛花期捧瓣外，其他材料均選取盛開(kāi)期花朵外瓣進(jìn)行色素成分測(cè)定，根據(jù)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 春蘭》(NY/T 2437-2013)描述花朵待測(cè)部位顏色。取樣時(shí)選取生長(zhǎng)勢(shì)一致、花色一致的3個(gè)單株為3次生物學(xué)重復(fù)。將每個(gè)單株的花朵全部取下，按照不同部位取樣，加液氮研磨成粉末后存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

色譜級(jí)甲酸，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；色譜級(jí)甲醇，購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；色譜級(jí)乙腈，購(gòu)自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；葉綠素檢測(cè)試劑盒(比色法)，購(gòu)自上海禾午生物科技有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海西格瑪奧德里奇有限公司，純度達(dá)95%以上；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自北京盛世康普化工技術(shù)研究院，純度達(dá)96%以上；類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海西格瑪奧德里奇有限公司，純度達(dá)95%以上。

CS-580A分光測(cè)色儀，購(gòu)自杭州彩譜科技有限公司；Sartorius分析天平(型號(hào)：BSA124S)，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TGL-16M冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-6000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海元析儀器有限公司；Agilent 1200-6460 QQQ，購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；LCQ Deca XP MAX液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，購(gòu)自美國(guó)賽默飛科技有限公司。

材料A～X見(jiàn)表1。圖1 24份參試蘭屬材料Fig.1 24 cultivars of Cymbidium Sw.

1.3 蘭花花瓣花色表型的鑒定

對(duì)供試材料(除大富貴)盛花期花瓣、大富貴花蕾期苞片的顏色進(jìn)行描述，以進(jìn)行花瓣花色表型的鑒定。參照朱佳意等[15]的方法，利用RHCSS(英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡)和CIEL*a*b*顏色系統(tǒng)對(duì)花色進(jìn)行定性、數(shù)字化描述。L*表示明暗變化程度從0(黑色)到100(白色)；a*、b*為正值時(shí)，代表紅色、黃色，a*、b*為負(fù)值時(shí)，代表綠色、藍(lán)色；C表示色彩的飽和度，色相角(h)表示色調(diào)。

1.4 類黃酮的檢測(cè)

花瓣中類黃酮的提取參照李崇暉等[16]的方法進(jìn)行，具體步驟：稱取0.1 g冷凍花瓣粉末置于 2 ml 離心管內(nèi)，加1.5 ml含有0.1%甲酸的甲醇溶液振蕩，在4 ℃冰箱內(nèi)浸提 24 h，每隔6 h振蕩1次，提取結(jié)束后于1 000 r/min離心10 min，取上清并過(guò)0.22 μm 濾膜，得到待測(cè)液，每個(gè)提取試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

類黃酮的定性分析利用LCQ Deca XP MAX液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(HPLC-ESI-MSn)進(jìn)行，色譜柱為TSK gel ODS-80Ts QA(250.0 mm×4.6 mm，Tosoh，日本)。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)方法，三重四極桿離子阱分析器，全離子掃描范圍為50～2 000m/z；花青素苷、黃酮醇苷分析采用正、負(fù)離子(NI)檢測(cè)模式。毛細(xì)管電壓為4 000 V，噴霧器壓力為 35 Pa，干燥氣體(N2)溫度為 300 ℃，流速為 10 L/min。

類黃酮的定量分析利用Agilent 1200-6460 QQQ的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-DAD)進(jìn)行，包括柱溫箱(TCC-1260)及光電二極管陣列檢測(cè)器(DDA-1260)。液相色譜條件：流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。洗脫程序見(jiàn)表2。色譜柱為Agilent Edipse plus C18(150.0 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó))，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μl，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為515 nm(花青素苷)、350 nm(黃酮醇苷)，在波長(zhǎng)為200～800 nm時(shí)對(duì)每個(gè)吸收峰進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

花瓣中各類黃酮組分的定量分析采用外標(biāo)法，將矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于含有0.1%甲酸的甲醇中，最終生成質(zhì)量濃度0.05～100.00 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別以在515 nm和350 nm處測(cè)定的吸光度為橫坐標(biāo)(x)、以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(Y)，得到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.103 3x+3.061 0，R2=0.999 3，蕓香苷相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.402 8x+0.099 4，R2=0.999 5。計(jì)算樣品中各花青素苷含量(相對(duì)于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量)、花黃素含量(相對(duì)于蕓香苷的含量)，鮮樣的含量單位為μg/g，重復(fù)3 次。

表2 流動(dòng)相的洗脫程序

1.5 類胡蘿卜素及葉綠素含量的測(cè)定

參照黃昕蕾[17]的方法進(jìn)行類胡蘿卜素的提取，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定類胡蘿卜素含量，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，重復(fù)3次。參照葉綠素試劑盒方法進(jìn)行總?cè)~綠素含量的測(cè)定，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用MassHunter Workstation Software (Version B. 06.00)和Chemdraw Ultra軟件對(duì)花色成分進(jìn)行分析，用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS Statistics 22軟件、Duncan’s法進(jìn)行花色素含量的差異顯著性分析，用Origin 2021軟件繪制花色的二維、三維散點(diǎn)圖，進(jìn)行主成分分析，用GraphPad Prism 6繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色表型分析

蘭屬植物花色豐富，為了解蘭屬植物不同色系的著色差異，分別用RHCSS、CIEL*a*b*顏色系統(tǒng)對(duì)蘭屬植物的花色進(jìn)行定性與數(shù)字化描述，詳見(jiàn)表3。根據(jù)RHCSS評(píng)價(jià)指標(biāo)，參試蘭花可劃分為6種色系，分別為棕色系、紫色系、紅紫色系、灰橙色系、黃色系和黃綠色系。

用CIEL*a*b*評(píng)價(jià)體系量化蘭花花色的各項(xiàng)指標(biāo)，分別以b*、L*為縱坐標(biāo)，繪制不同色系蘭花品種花瓣、花色的二維、三維分布結(jié)果，可以看出，灰橙色、黃色和黃綠色主要集中在二維、三維圖的上部，棕色、紫色和紅紫色主要集中在二維、三維圖的下部(圖2)。

表3 24份蘭屬樣品的花色表型參數(shù)

A：a*、b*的二維分布圖；B：a*、b*和L*的三維分布圖。圖2 24份蘭屬材料花色指標(biāo)的二維、三維分布結(jié)果(色系由RHSCC值確定)Fig.2 Flower color distribution of 24 Cymbidium Sw. cultivars in coordinate systems of bivariate and trivariate, respectively (The flower colors were identified by the RHSCC value)

如圖3所示，黃色系蘭屬植物的平均L*最高，達(dá)59.35，顯著高于其他色系蘭花(P<0.05)；其次為黃綠色系蘭花，平均L*為55.30；L*最低的為棕色系蘭花，僅為25.60，與其他色系蘭花間差異顯著(P<0.05)；紫色系和紅紫色系蘭花的L*差別不大，且存在重復(fù)區(qū)域。紅紫色系蘭花的平均a*為13.96，顯著高于其他色系蘭花(P<0.05)；其次為紫色系蘭花，而黃綠色系、灰橙色系蘭花的平均a*分別為-1.87、-2.40，表明它們呈現(xiàn)一定程度的綠色。黃色系蘭花的b*最高，達(dá)44.62，b*最低的為棕色系蘭花，僅為1.26，各色系蘭花的b*均為正值，代表不同程度的黃色。C與b*呈現(xiàn)同樣的規(guī)律，色相角(h)也表現(xiàn)為黃綠色系、黃色系及灰橙色系蘭花高于棕色系、紫色系和紅紫色系蘭花。上述結(jié)果表明：紫色、紅紫色、棕色和黃色蘭花在CIEL*a*b*空間中處于由紅色向黃色過(guò)渡的區(qū)域，而黃綠色系和灰橙色系花處于由綠色向黃色過(guò)渡的區(qū)域。

A：L*值；B：a*值；C：b*值；D：C值；E：h值。圖3 不同色系蘭屬植物花色表型的CIE L*a*b*值Fig.3 CIE L*a*b* values in flowers of Cymbidium Sw.

2.2 類黃酮組成成分分析

類黃酮的鑒定基于保留時(shí)間、紫外可見(jiàn)吸收光譜(λmax)、特征質(zhì)荷比、分子離子峰和前人研究中報(bào)道的信息，詳見(jiàn)表4。在520 nm波長(zhǎng)下共檢測(cè)到6 種花青素苷，圖4A為花青素苷種類最豐富的品種大富貴苞片在520 nm下的色譜結(jié)果。在350 nm下共檢測(cè)到47種黃酮醇苷、7種黃酮苷、6種黃烷酮苷及4種未確定的成分，圖4B顯示了具有代表性的黑墨外瓣的類黃酮色譜結(jié)果。

2.2.1 花青素苷 本研究共檢測(cè)到2種花青素苷元，其中峰a1、a2、a3和a5均產(chǎn)生質(zhì)荷比(m/z)為287的碎片離子，為矢車菊素苷元(Cyanidin,Cy)的特征碎片離子(表4)。通常情況下，單糖優(yōu)先連接在花青素苷元的第3位羥基上，2個(gè)或2個(gè)以上的糖可同時(shí)連接在第3位羥基或分別連接在第3位、第5位羥基上[18]。峰a1處分子離子([M+H]+)的m/z為449，由矢車菊素苷元離子結(jié)合1 分子葡萄糖基(相對(duì)分子質(zhì)量為162)得到，與矢車菊素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品一致，因此將峰a1鑒定為矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O- glucoside)[8,19]。峰a2 Cy苷元(m/z為287)上連接了2個(gè)糖基(相對(duì)分子質(zhì)量分別為162、146)，MS2質(zhì)譜中只能觀察到m/z為449的碎片離子([M+H-146]+)，而沒(méi)有觀察到m/z為433的碎片離子([M+H-162]+)，表明Cy是被1種雙糖糖苷化的[20]，308為蕓香糖苷的特征質(zhì)荷比，因此將峰a2鑒定為矢車菊素3-O-蕓香糖苷(Cyanidin 3-O-rutinoside)[10,12]。峰a3分子離子的m/z約為757，根據(jù)文獻(xiàn)[13]將峰a3鑒定為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-rutinoside-5-O-glucoside)。峰a5[M+H]+對(duì)應(yīng)的m/z為535，較峰a1增加86(為丙二?；?，因而將其鑒定為矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-malonylglucoside)[12,15]。峰a4、a6處均產(chǎn)生碎片離子，m/z為301，為芍藥花素苷元(Peonidin,Pn)的特征碎片離子，根據(jù)前人的報(bào)道，分別將峰a4、a6鑒定為芍藥花素3-O-蕓香糖苷(Peonidin 3-O-rutinoside)、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Peonidin 3-O- malonylglucoside)[12]。

表4 24份蘭屬樣品花中類黃酮的HPLC-MS分析及結(jié)構(gòu)解析

2.2.2 黃酮醇 質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，共有 6 種黃酮醇苷元離子，在正離子模式下分別是m/z為287的山柰酚(Kaempferol,Km)、m/z為303的槲皮素(Quercetin,Qu)、m/z為317的異鼠李素(Isorhamnetin,Is)、m/z為319的楊梅黃素(Myricetin,My)、m/z為347的丁香亭(Syringetin,Sy)、m/z為349的二氫丁香亭(Dihydrosyringetin，DHS)。

分子離子峰f1、f8、f9、f46和f58均連續(xù)丟失86、162的相對(duì)分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為347、319、319、303和317的碎片苷元離子。86是丙二酰的特征質(zhì)荷比，162的相對(duì)分子質(zhì)量大小對(duì)應(yīng)1分子六碳糖，根據(jù)Abad-García等[21]的報(bào)道，葡萄糖是最常見(jiàn)的單糖，其次為半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸，而甘露糖、果糖和半乳糖醛酸最少見(jiàn)。因此推測(cè)峰f1為丁香亭3-O-丙二酰葡萄糖苷(Syringetin 3-O-malonylglucoside)；峰f8和f9的質(zhì)譜信息相同，互為同分異構(gòu)體，由于當(dāng)相同苷元連接不同的糖基時(shí)，半乳糖苷先于葡萄糖苷洗脫[22-23]，因此推測(cè)峰f8、f9分別為楊梅素3-O-丙二酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-malonylgalactoside)、楊梅素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-malonylglucoside)。結(jié)合質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)峰f46、f58分別為槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-malonylglucoside)、異鼠李素3-O-丙二酰葡萄糖苷(Isorhamnetin 3-O-malonylglucoside)[16]。

峰f2 [M+H]+在m/z為579處丟失232的相對(duì)分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為347的碎片苷元離子,232為琥珀酰阿拉伯糖苷的特征質(zhì)荷比(琥珀酰的特征質(zhì)荷比為100，阿拉伯糖苷的特征質(zhì)荷比為132)，因此推測(cè)峰f2為丁香亭3-O-琥珀酰阿拉伯糖苷(Syringetin 3-O-succinylarabinoside)。峰f21、f60、f63與f2 的質(zhì)譜行為相似，且質(zhì)譜信息相同，峰f21、f60、f63互為同分異構(gòu)體，皆丟失262的相對(duì)分子質(zhì)量，即丟失1分子琥珀酰(相對(duì)分子質(zhì)量為100)和1分子六糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為162)，產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子。根據(jù)上述分析結(jié)果，推測(cè)峰f21、f60、f63分別為楊梅素3-O-琥珀酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-succinylgalactoside)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-succinylglucoside)、楊梅素3-O-琥珀酰己糖苷(Myricetin 3-O-succinylhexose)。

峰f4分子離子([M+H]+)的m/z為511，丟失162 的相對(duì)分子質(zhì)量，產(chǎn)生m/z為349的碎片苷元離子，347為Sy的特征質(zhì)荷比，根據(jù)前人報(bào)道，349為二氫丁香亭的m/z[24]，因此將峰f4暫定為二氫丁香亭3-O-葡萄糖苷(Dihydrosyringetin 3-O-glucoside)。峰f14、f15互為同分異構(gòu)體，峰f49、f51和f53互為同分異構(gòu)體，其質(zhì)譜行為與峰f4相似，均丟失了1分子六碳糖(相對(duì)分子質(zhì)量為162)，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，推測(cè)峰f14、f15分別為山柰酚3-O-半乳糖苷(Kaempferol 3-O-galactoside)[25]、山柰酚3-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside)[10,15-16],峰f49、f51和f53分別為楊梅素3-O-半乳糖苷(Myricetin 3-O-galactoside)[26]、楊梅素3-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-glucoside)[25]和楊梅素3-O-己糖苷(Myricetin 3-O-hexose)。

峰f5、f13和f61分別是m/z為349、287、319的苷元離子結(jié)合相對(duì)分子質(zhì)量為294的雙糖(294是桑布雙糖特征質(zhì)荷比[27])，推測(cè)峰f5、f13和f61分別為二氫丁香亭3-O-桑布雙糖(Dihydrosyringetin 3-O-sambubioside)、山柰酚3-O-桑布雙糖(Kaempferol 3-O-sambubioside)和楊梅素3-O-桑布雙糖(Myricetin 3-O-sambubioside)。峰f11、f12中只檢測(cè)到質(zhì)荷比為349的碎片苷元離子，因此推測(cè)其為二氫丁香亭衍生物(Dihydrosyringetin derivative)。

峰f41的液相色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜特征與標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷相同， 則推測(cè)峰f41為蕓香苷(Rutin)[10,12,19]。由峰f37、f40的質(zhì)譜信息看出，它們與已知組分峰f41為同分異構(gòu)體。峰f40苷元的Qu上連接了2個(gè)糖基，分別為1分子鼠李糖(相對(duì)分子質(zhì)量為146)和1分子己糖(相對(duì)分子質(zhì)量為162)，在MS2質(zhì)譜信息中，只能觀察到m/z為465的碎片離子([M+H-146]+)，而沒(méi)有觀察到m/z為449的碎片離子([M+H-162]+)，表明Qu被1種雙糖糖苷化。由于m/z為465的碎片([M+H-146]+)的豐度小于m/z為303的碎片([Y0+，M + H - (146+162)])，因此判斷該雙糖是通過(guò)1→2糖苷鍵連接的[20]，進(jìn)而推測(cè)其為槲皮素-3-鼠李糖-(1→2)-葡萄糖[Quercetin 3-O-rhamnopyranosyl-(1→2)-glucopyranoside]，即槲皮素3-O-新橙皮糖苷(Quercetin 3-O-neohesperidoside)]。刺槐雙糖(Robinoside)[Rhamnopyranosyl-(1→6)-galactopyranoside]與蕓香糖苷[Rhamnopyranosyl-(1→6)-glucopyranoside]亦為同分異構(gòu)體，且當(dāng)它們連接相同苷元時(shí)，刺槐雙糖的出峰時(shí)間較蕓香糖早，根據(jù)已知組分峰f43與峰f45[12,25]、f50與f52[10,12,16]，可以推測(cè)峰f37為槲皮素3-O-刺槐雙糖(Quercetin 3-O-robinoside)。峰f16的質(zhì)譜信息與上述成分相似，但無(wú)同分異構(gòu)體，推測(cè)其為楊梅素3-O-蕓香糖苷(Myricetin 3-O-rutinoside)。

峰f17分子離子([M+H]+)的m/z約為595，丟失了1分子葡萄糖醛酸(相對(duì)分子質(zhì)量為176)和1分子琥珀酰(相對(duì)分子質(zhì)量為100)，產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子，推測(cè)其為楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖醛酸苷(Myricetin 3-O-succinylglucuronide)。

峰f18、f30、f31、f32、f34和f39的質(zhì)譜行為相似，均為分子離子連續(xù)丟失2分子糖苷后產(chǎn)生苷元離子。不同化合物中的糖苷化位置不同，如花青素通常發(fā)生在3碳位、5碳位，黃酮醇、黃烷-3-醇通常發(fā)生在3碳位、7碳位，黃酮、黃烷酮通常發(fā)生在7碳位[28]。峰f18連續(xù)丟失2分子鼠李糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為146)后產(chǎn)生m/z為319的碎片苷元離子，推測(cè)其為楊梅素3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖苷(Myricetin 3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside)。根據(jù)已有研究結(jié)果，推測(cè)峰f31、f32與峰f34分別為山柰酚3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside-7-O-glucoside)、槲皮素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O- galactoside-7-O-glucoside)和槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside-7-O-glucoside)[9,29]。峰f30與峰f39的質(zhì)譜行為一致，互為同分異構(gòu)體，且與峰f32、f34相似，推測(cè)峰f30與峰f39分別為楊梅素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-galactoside-7-O-glucoside)和楊梅素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(Myricetin 3-O-glucoside-7-O-glucoside)。

峰f19和峰f22的質(zhì)譜行為類似，都為分子離子連續(xù)丟失糖苷或?；擒蘸螽a(chǎn)生的苷元離子。峰f22與山柰酚3-O-蕓香糖-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-rutinoside-7-O-glucoside)的質(zhì)譜信息一致[9]。同理，推測(cè)峰f19為槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-丙二酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside-7-O- malonyl-glucoside)。

峰f26與峰f27的質(zhì)譜信息相同，根據(jù)已有研究結(jié)果，峰f26與楊梅素3-O-沒(méi)食子酰半乳糖苷(Myricetin 3-O-galloylgalactoside)的結(jié)構(gòu)一致[18]，因此推測(cè)峰f27為楊梅素3-O-沒(méi)食子酰葡萄糖苷(Myricetin 3-O-galloylglucoside)。同理，f35與已報(bào)道的槲皮素3-O-沒(méi)食子酰葡萄糖苷(Quercetin 3-O-galloylglucoside)結(jié)構(gòu)一致[27]。

從峰f20、f25、f29、f44、f55、f56、f57中均檢測(cè)到質(zhì)荷比為319的碎片苷元離子，但是根據(jù)分子離子信息，無(wú)法推測(cè)具體化合物，均暫認(rèn)為它們是楊梅素衍生物(Myricetin derivative)。

2.2.3 黃酮 根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在波長(zhǎng)為350 nm的條件下共檢測(cè)到7種黃酮苷，包括2種黃酮苷元離子，在正離子模式下分別為m/z為271的芹菜素(Apigenin，Ap)[30]、m/z約為301的金圣草黃素(Chrysoeriol，Ch)[31]。峰f3分子離子[M+H]+的m/z為609，丟失1分子蕓香糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為308)后，產(chǎn)生m/z為301的碎片苷元離子。通常情況下，黃酮、黃烷酮類糖元優(yōu)先連接在苷元的7位羥基上，因此推測(cè)峰f3為金圣草黃素7-O-蕓香糖苷(Chrysoeriol 7-O-rutinoside)[32]。峰f10分子離子丟失1分子阿魏酰葡萄糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為338)，推定為金圣草黃素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(Chrysoeriol 7-O-feruloylglucoside)。峰f38中檢測(cè)到Ch苷元，但根據(jù)分子離子的m/z無(wú)法推測(cè)其結(jié)構(gòu)組成，因而暫將其推測(cè)為金圣草黃素衍生物(Chrysoeriol derivative)。峰f47分子離子丟失1分子葡萄糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為162)和1分子木糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為132)，推測(cè)其為金圣草黃素7-O-桑布雙糖(Chrysoeriol 7-O-sambubioside)。峰f48分子離子丟失了2分子葡萄糖苷，經(jīng)MassBank查詢，與金圣草黃素7-O-槐糖苷(Chrysoeriol 7-O-sophoroside)一致(登記號(hào)：PN000073)。峰f24、f42均為芹菜素類衍生物，峰f24的質(zhì)譜信息與MassBank中芹菜素7-O-丙二酰葡萄糖苷(Apigenin 7-O-malonylglucoside)相符(登記號(hào)：PN000048)。峰f42的質(zhì)譜行為與峰f48相似，均為分子離子丟失2分子葡萄糖苷，因此推測(cè)峰f42為芹菜素7-O-槐糖苷(Apigenin 7-O-sophoroside)。

2.2.4 黃烷酮 從峰f6、f7、f23、f28、f36、f59中均檢測(cè)到m/z為273的碎片柚皮素(Na)苷元[30]，經(jīng)MassBank查詢，峰f6為柚皮素7-O-葡萄糖苷(Naringenin 7-O-glucoside)(登記號(hào)：PR306370)，峰f7為柚皮素7-O-蕓香糖苷(Naringenin 7-O-rutinoside)(登記號(hào)： PR302552)。峰f23分子離子丟失了1分子阿魏酰(相對(duì)分子質(zhì)量為176)和1分子鼠李糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為146)，推定其為柚皮素7-O-阿魏酰鼠李糖苷(Naringenin 7-O-ferulylrhamnoside)。峰f28分子離子丟失了1分子鼠李糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為146)，推測(cè)其為柚皮素7-O-鼠李糖苷(Naringenin 7-O-rhamnoside)。峰f36分子離子丟失了1分子阿魏酰(相對(duì)分子質(zhì)量為176)、1分子葡萄糖苷(相對(duì)分子質(zhì)量為162)，推測(cè)其為柚皮素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(Naringenin 7-O-feruloylglucoside)。峰f59的質(zhì)譜行為與峰f48相似，因而推測(cè)其為柚皮素7-O-槐糖苷(Naringenin 7-O-sophoroside)。

2.3 花色素組成與定量分析

由于蘭花外瓣、捧瓣和舌瓣有不同的著色模式，通常外瓣、捧瓣以同樣的方式著色，但是對(duì)于蝶花，其花瓣著色模式發(fā)生了變化，與舌瓣類似，是經(jīng)過(guò)修飾的，在顏色、形狀上都不同。本研究選取不同色系蘭花的不同組織部位進(jìn)行類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素含量的測(cè)定，可以較全面地分析蘭花色素分布特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，24份蘭屬植物花組織中均含有類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素(表5)。

2.3.1 類黃酮代謝物成分及含量 在24個(gè)樣品中共檢測(cè)到70種類黃酮代謝物，包括6種花青素苷類物質(zhì)、47種黃酮醇苷類物質(zhì)、7種黃酮苷類物質(zhì)、6種黃烷酮苷類物質(zhì)和4種未確定的代謝物。棕色系花瓣中共包含42種類黃酮代謝物，紫色系花瓣中共包含31種類黃酮代謝物，紅紫色系花瓣中共包含61種類黃酮代謝物，黃色系花瓣中共包含34種類黃酮代謝物，黃綠色系花瓣中共包含56種類黃酮代謝物，灰橙色系花瓣中共包含23種類黃酮代謝物。對(duì)每種類黃酮代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行橫向歸一化處理，由圖5可以看出，棕色系、紫色系、紅紫色系和灰橙色系花的類黃酮代謝物與黃色系、黃綠色系花的類黃酮代謝物具有明顯差異。

2.3.1.1 花青素苷 在參試的蘭屬植物花朵中，有16份中檢測(cè)出花青素苷，包含4種矢車菊素、2種芍藥色素(圖6)，其中只有大富貴苞片中檢出6種花青素苷，其余材料中檢測(cè)出1～5種花青素苷。蘭屬植物不同色系花朵所含花青素類別與含量差異較大， 總花青素苷(TAC)含量整體表現(xiàn)為棕色系>紫色系>紅紫色系>灰橙色系>黃綠色系>黃色系，分別為1 656.92 μg/g、430.62 μg/g、277.61 μg/g、142.88 μg/g、85.20 μg/g和0 μg/g(圖7)。從棕色系花中檢出4種花青素苷，包括矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷和芍藥花素3-O-蕓香糖苷，其中矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷的相對(duì)含量明顯高于其他色系；紫色系花中均含有花青素苷，共檢出6.0種花青素苷，平均每個(gè)材料檢出5.5種花青素苷，且均含有矢車菊素、芍藥花素；紅紫色系花中均含有花青素苷，共檢出6.0種花青素苷，每個(gè)材料中的花青素苷數(shù)量平均為3.4種，其中有7份樣品中只含有矢車菊素，3 份樣品中同時(shí)檢出矢車菊素、芍藥花素；灰橙色系花中有3種花青素苷，均為矢車菊素；在黃綠色系花中，只有2個(gè)材料中檢出花青素苷，其中從大富貴外瓣中檢出1種花青素，從瑞梅外瓣中檢出2種花青素苷，均為矢車菊素，在檢出花青素苷的樣品中，TAC含量處于最低水平；黃色系花的外瓣不含有花青素。此外，春蘭大富貴花朵不同部位含有的花青素苷種類和TAC含量不同，其苞片含有4種Cy、2種Pn，舌瓣含有3種Cy，外瓣只含有1種Cy；不同部位的TAC含量表現(xiàn)為苞片>舌瓣>外瓣，分別為520.74 μg/g、275.52 μg/g和52.87μg/g，差異顯著(P<0.05)。

在所有檢出花青素苷的樣品中，矢車菊素含量均高于芍藥花素含量，為主要的花青素類型，并且除F-19中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-葡萄糖苷為主外，有8個(gè)材料中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主，10個(gè)材料中的花青素苷含量以矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷為主。

樣品A～X見(jiàn)表1。B：棕色系；P：紫色系；RP：紅紫色系；Y：黃色系；YB：黃綠色系；GO：灰橙色系。代謝物相對(duì)含量采用歸一化處理，圖中的顏色取決于蘭屬花朵的濃度，藍(lán)色代表濃度較低，紅色代表濃度較高;##1、##2、##3、##4、##5表示未命名。圖5 24份蘭屬樣品花中類黃酮物質(zhì)相對(duì)含量熱圖Fig.5 A heat map of relative content of flavonoids in the flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

樣品A～X見(jiàn)表1。圖6 24份蘭屬樣品花中的花青素苷組成及含量Fig.6 The composition and content of anthocyanin in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

2.3.1.2 花黃素 除花青素苷外，在參試材料中共檢出64種花黃素，包括黃酮醇、黃酮和黃烷酮等。黃酮醇苷元有6種，分別為Km、Qu、Is、My、Sy和DHS，其中Km、Qu和My型苷元存在于所有樣品中，而少數(shù)樣品中未檢出Is、Sy或DHS苷元；黃酮苷元有2種，分別為Ap和Ch，其中Ch在所有樣品中都存在，而Ap僅存在于9個(gè)樣品中；黃烷酮苷元為Na，在4份樣品(O、S、U和W)中未檢出(表6)。由圖5可以看出，從不同色系的材料中檢出11～36個(gè)組分，峰f40、f41、f45、f46、f47為普遍存在的花黃素，其中峰f40僅C、K和L中未檢出，峰f41僅M、N中未檢出，峰f45僅C、T中未檢出，峰f46僅N、T中未檢出，而峰f47僅N、Q、S和U中未檢出；峰f13、f25、f27、f44、f49、f62、f63、f64分別為樣品N、V、G、R、J、I、T和Q所特有的，峰f37、f60為樣品B所特有的； 峰f7、f18僅存在于墨蘭(I、J和L)中，具有一定的種屬特異性。

由表4可以看出，在所有檢出的64種花黃素成分中，只有峰f15、f22、f31、f32、f34、f41、f43、f45、f46、f50、f52等11種曾在蘭科植物中報(bào)道過(guò)，峰f3、f6、f7、f13、f14、f24、f26、f35、f48、f51等10種在其他物種研究或數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道過(guò)，其余除峰f11、f12、f20、f25、f29、f33、f38、f44、f54、f55、f56、f57、f62、f64等14種沒(méi)有得到準(zhǔn)確鑒定外，有28種黃花素為首次報(bào)道，分別為丁香亭3-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f1)、丁香亭3-O-琥珀酰阿拉伯糖苷(峰f2)、二氫丁香亭3-O-葡萄糖苷(峰f4)、二氫丁香亭3-O-桑布雙糖(峰f5)、楊梅素3-O-丙二酰半乳糖苷(峰f8)、楊梅素3-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f9)、金圣草黃素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(峰f10)、楊梅素3-O-蕓香糖苷(峰f16)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖醛酸苷(峰f17)、楊梅素3-O-鼠李糖-7-O-鼠李糖苷(峰f18)、槲皮素3-O-葡萄糖-7-O-丙二酰葡萄糖苷(峰f19)、楊梅素3-O-琥珀酰半乳糖苷(峰f21)、柚皮素7-O-阿魏酰鼠李糖苷(峰f23)、楊梅素3-O-沒(méi)食子酰葡萄糖苷(峰f27)、柚皮素7-O-鼠李糖苷(峰f28)、楊梅素3-O-半乳糖-7-O-葡萄糖苷(峰f30)、柚皮素7-O-阿魏酰葡萄糖苷(峰f36)、槲皮素3-O-刺槐雙糖(峰f37)、楊梅素3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷(峰f39)、槲皮素3-O-新橙皮糖苷(峰f40)、芹菜素7-O-槐糖苷(峰f42)、金圣草黃素7-O-桑布雙糖(峰f47)、楊梅素3-O-半乳糖苷(峰f49)、楊梅素3-O-己糖苷(峰f53)、柚皮素7-O-槐糖苷(峰f59)、楊梅素3-O-琥珀酰葡萄糖苷(峰f60)、楊梅素3-O-桑布雙糖(峰f61)和楊梅素3-O-琥珀酰己糖苷(峰f63)。同時(shí)，本研究檢出的楊梅素、丁香亭和柚皮素類衍生物為首次在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)。

由圖7可以看出，不同色系蘭屬植物花中的類黃酮含量存在一定差異，總類黃酮(TFC)、總黃酮醇、總黃酮和總黃烷酮含量最高的均為棕色系，分別為12 817.74 μg/g、10 504.35 μg/g、1 296.60 μg/g和1 016.80 μg/g，遠(yuǎn)高于其他色系，且差異顯著(P<0.05)，而其他色系之間的總類黃酮含量無(wú)顯著差異；紫色系的TFC、總黃酮醇和總黃酮含量均最低，灰橙色系的總黃烷酮含量最低。棕色系花瓣中的黃酮醇類物質(zhì)主要以山柰酚、槲皮素、丁香亭和二氫丁香亭為苷元，黃酮類物質(zhì)以芹菜素、金圣草黃素為苷元，其中金圣草黃素7-O-桑布雙糖含量顯著高于其他色系；黃烷酮以柚皮素為苷元，其中柚皮素7-O-葡萄糖苷、柚皮素7-O-蕓香糖苷含量明顯高于其他色系。黑墨、櫻姬爪和白墨為墨蘭，其TFC、總黃酮醇、總黃烷酮含量在所有樣品中分別位列第1、2、4位，可見(jiàn)墨蘭的TFC、總黃酮醇和總黃烷酮含量相對(duì)較高，具有一定的種屬特異性，詳見(jiàn)圖5、表5和表6。

除大富貴舌瓣、玉兔捧瓣外，所有樣品中的黃酮醇在總類黃酮中均占最高比例，為53.01%～97.93%，其中占比最高的為韓國(guó)小姐；大富貴舌瓣中的黃酮醇、黃酮占比接近；玉兔捧瓣中的黃酮醇占比僅為32.02%，而黃酮占比為67.02%；各樣品中的黃烷酮占比較低，為0～14.01%。由此可見(jiàn)，黃酮醇為蘭屬植物花的主要花黃素類型(表5)。由表6可以看出，有18個(gè)樣品中Qu含量在總黃酮醇含量中的占比達(dá)33.92%～75.81%，為主要的黃酮醇類型；而滇梅中的Km占比達(dá)55.44%，為主要的黃酮醇類型；金公主外瓣中以My為主要的黃酮醇類型，占比為30.87%；玉兔、FH-16、FH-19和大富貴舌瓣中以Ch為主要的黃酮醇類型，占比分別為39.12%、43.91%、46.99%和29.95%。除玉兔、白墨、金公主、FH-16、FH-19、大富貴舌瓣和瑞梅外，有21份樣品中的槲皮素3-O-蕓香糖苷(蕓香苷)含量最高，為主要的黃酮醇類物質(zhì)。

同一類色素對(duì)應(yīng)的不同色系花柱上標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同色系蘭屬植物花中花色素含量Fig.7 Anthocyanin content in flowers of Cymbidium Sw. samples with different colors

2.3.2 類黃酮的主成分分析 以不同色系的24種蘭花為樣本，以類黃酮組成及含量作為變量，用Origin 2021進(jìn)行主成分分析。如圖8所示，共提取出特征值大于1的2個(gè)主成分，不同材料分布在不同象限中，其中第1主成分的特征值為7.339，貢獻(xiàn)率為66.716%，第2主成分的特征值為2.012，貢獻(xiàn)率為18.290%，2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.006%，表明前2個(gè)主成分基本可以代表24種蘭花含有的85%的類黃酮信息。變量山柰酚3-O-半乳糖苷、山柰酚3-O-刺槐雙糖、槲皮素3-O-新橙皮糖苷、槲皮素3-O-蕓香糖苷、槲皮素3-O-丙二酰葡萄糖苷、柚皮素7-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷含量在第1主成分的正方向有較高的載荷系數(shù)，即與第1主成分表現(xiàn)為正相關(guān)，主要為槲皮素、山柰酚和矢車菊素類物質(zhì)，表明槲皮素、山柰酚為蘭花植物花中的主要黃酮醇，矢車菊素為主要的花青素；變量芍藥花素3-O-蕓香糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷含量在第2主成分的正方向有較高的載荷系數(shù)，表明與第2主成分呈正相關(guān)，為芍藥花素類花青素苷。

從得分結(jié)果可以看出，黑墨(I)、櫻姬爪(J)、大富貴苞片(B)、白墨(L)、韓國(guó)小姐(Q)沿第1主成分正向分布，并且黑墨與峰f14、f43、f40、f41、f46、f6、a1、a3、a6靠近，表明這些成分在黑墨花瓣中的含量占有較高比例；凝香紫(A)、大富貴苞片(B)、櫻姬爪(J)、FH-19W、FH-16U沿第2主成分正向分布，表明這幾個(gè)材料都含有芍藥花素，其中大富貴苞片向峰a4、a6靠近，表明其中芍藥花素占有較高比例。其余材料包括紅紫色、黃色、黃綠色和灰橙色系，均分布于第1主成分、第2主成分的負(fù)方向，且具有較低的載荷系數(shù)，表明它們與第1、第2主成分呈弱負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，主成分分析能夠反映不同蘭花材料的類黃酮組成及含量差異。

2.3.3 類胡蘿卜素定量分析 由圖7可知，不同色系蘭屬植物花中類胡蘿卜素含量為158.75～2 067.56 μg/g，其中紫色系含量最高，紅紫色系含量最低。所有樣品中都含有類胡蘿卜素，含量為50.92～2 532.13 μg/g，含量最高的為大富貴苞片，其次是蒼巖素(2 173.34 μg/g)，紅霞中的含量最低(表5)。黃色系黃金小神童、FH-10中的類胡蘿卜素含量分別為551.53 μg/g、105.66 μg/g。大富貴不同部位的類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為苞片(2 532.13 μg/g)>外瓣(1 576.77 μg/g)>舌瓣(145.64 μg/g)，差異顯著(P<0.05)。

從不同種群花中的類胡蘿卜素含量來(lái)看，春蘭類的類胡蘿卜素含量較高，除大富貴舌瓣、揚(yáng)紅荷外瓣外，其他部分的類胡蘿卜素含量均達(dá)到1 000.00 μg/g以上，而其他蘭屬植物除黑墨以外，類胡蘿卜素含量均在1 000.00 μg/g以下，尤其是蓮瓣蘭品種、春蘭與大花蕙蘭雜交種的整體類胡蘿卜素含量水平較低，平均含量分別為137.28μg/g、123.35μg/g。

2.3.4 總?cè)~綠素含量的定量分析 由圖7可以看出，不同色系蘭屬植物花中葉綠素含量排序?yàn)樽厣?紫色系>黃綠色系>紅紫色系>黃色系>灰橙色系，含量分別為214.94 μg/g、180.01 μg/g、159.76 μg/g、22.39 μg/g、19.74 μg/g和1.97 μg/g，前3名與后3名間存在顯著差異(P<0.05)。由表5可以看出，所有樣品中都含有葉綠素，含量為1.97～419.92 μg/g，總?cè)~綠素含量最高的為蒼巖素外瓣，其次是大富貴外瓣，為316.23 μg/g，瑞梅外瓣的葉綠素含量也較高，達(dá)179.70 μg/g，在所有樣品中位列第5位，這些均為春蘭綠花品種，且與其他品種間差異明顯；大富貴花中不同部位的葉綠素含量排序?yàn)橥獍?316.23 μg/g)>苞片(73.73 μg/g)>舌瓣(8.71 μg/g)，差異顯著(P<0.05)。

PC1：主成分1；PC2：主成分2；a1～a6：分別為矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷；f1～f64：檢出的花黃素，詳見(jiàn)表4。圖8 24份蘭屬樣品花中類黃酮含量的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of the contents of flavonoids in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples

表5 24份蘭屬樣品花中花色素組成及含量

表6 24份蘭屬樣品花中花黃素組成及含量

2.4 花色表型與花色素含量的相關(guān)性分析

為了分析參試蘭屬植物花瓣的顏色與花色素含量的關(guān)系，對(duì)花色CIEL*a*b*參數(shù)與胡蘿卜素、葉綠素、類黃酮、花青素苷物質(zhì)及類黃酮主成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析。如表7、表8所示，明度(L*)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.557、-0.533，與a1、a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.460、-0.472；紅綠程度(a*)與葉綠素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.463(P<0.05)；黃藍(lán)程度(b*)與TAC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.528，與Cy、a1、a3、a5和a6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.496、-0.455、-0.405、-0.448和-0.411(P<0.05)；飽和度(C)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.558和-0.532(P<0.01)，與a1、a3和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.497、-0.448和-0.494(P<0.05)，且與Sy含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.405(P<0.05)。

3 討論

3.1 24份蘭屬樣品花中類黃酮組成概況

本研究利用HPLC-MS方法分析了24個(gè)蘭屬樣品花中的類黃酮成分，共檢測(cè)出6種花青素，包括4種矢車菊素、2種芍藥花素；另外檢測(cè)到64種黃酮醇、黃酮、黃烷酮類物質(zhì)，包括山柰酚、槲皮素、異鼠李素、楊梅黃素、丁香亭、芹菜素、金圣草黃素和柚皮素類物質(zhì)，其中山柰酚、槲皮素、楊梅黃素和金圣草黃素為所有樣品共有的。對(duì)現(xiàn)有蘭科植物花中黃酮組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中都檢測(cè)出了矢車菊素、槲皮素、山柰酚和異鼠李素，但是不同研究中檢測(cè)出的花青素、花黃色素種類和數(shù)量差別較大，本研究檢出的花黃色素種類、數(shù)量高于以往的研究。張藝祎[14]在四川獨(dú)蒜蘭花瓣中檢測(cè)到4種矢車菊素、飛燕草素；宋小蒙[13]在金釵石斛蘭花中鑒定出 13 種矢車菊素、飛燕草素衍生物；Wang 等[12]在不同色系大花蕙蘭中檢測(cè)出6種矢車菊素、芍藥色素糖苷，6種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李文建等[29]在建蘭花瓣中檢測(cè)到8種矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素、芍藥花素，12種槲皮素、山柰酚和異鼠李素；王紫珊[10]在卡特蘭Pink Lady花瓣中共發(fā)現(xiàn)9種矢車菊素、芍藥花素和矮牽牛素衍生物，18種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李崇暉等[9]從不同顏色蝴蝶石斛蘭品種花中共檢測(cè)出28種矢車菊素糖苷與19 種槲皮素、山柰酚和異鼠李素糖苷；李崇輝等[16]在文心蘭唇瓣中檢測(cè)到5 種矢車菊素、芍藥花素糖苷和23種黃酮、黃酮醇苷(苷元有木樨草素、金圣草黃素、槲皮素、山柰酚和異鼠李素)；Griesbach[33]在大花蕙蘭中檢測(cè)到黃酮芹菜素糖苷。本研究檢出的楊梅素、丁香亭和柚皮素類衍生物均為首次在蘭科植物中發(fā)現(xiàn)，類黃酮種類多樣性的增加豐富了對(duì)蘭科植物花中類黃酮生物合成途徑的認(rèn)識(shí)。

表7 24份蘭屬樣品花色表型參數(shù)與花色素含量的相關(guān)性

表8 24份蘭屬樣品花色表型參數(shù)與類黃酮類物質(zhì)主要成分含量的相關(guān)性

通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)，參試蘭花花中主要的類黃酮成分為黃酮醇、黃烷酮、花青素，其中主要黃酮醇為槲皮素、山柰酚，主要黃烷酮為柚皮素，主要花青素為矢車菊素，與本研究中類黃酮定量分析結(jié)果相互印證。從類黃酮定量分析結(jié)果看出，共有16份材料含有花青素，不同色系蘭花材料的TAC含量表現(xiàn)為棕色系>紫色系>紅紫色系>灰橙色系>黃綠色系>黃色系，在紅紫色、紫色和棕色系花瓣中含有大量花青素，而灰橙色系花瓣中TAC含量較低，黃綠色系外瓣不含TAC或含量極低，黃色系外瓣中無(wú)花青素。在檢出花青素的16份樣品中，花青素類型均以矢車菊素為主，其中有8個(gè)樣品以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主，7個(gè)樣品以矢車菊素3-O-丙二酰葡萄糖苷為主。所有樣品中均檢出花黃素，其中黃酮醇占比最大，且以槲皮素為主，槲皮素3-O-蕓香糖苷含量最高，這與前人的研究結(jié)果相似。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，矢車菊素3-O-蕓香糖苷、芍藥花素3-O-蕓香糖苷為大花蕙蘭的主要花青素苷，在黃色、綠色和白色系大花蕙蘭外瓣中沒(méi)有花青素。莊于彥[11]在研究有紅色斑點(diǎn)的文心蘭花色素成分時(shí)檢出矢車菊素、芍藥花素2種苷元，并認(rèn)為紫花品種具有較高的花青素含量，且以矢車菊素為主，綠色系、白色系蝴蝶石斛蘭花中不含花青素[9]。以上研究結(jié)果表明，矢車菊素是蘭屬植物花中主要的花青素，其次為芍藥花素，以矢車菊素 3-O-蕓香糖苷為主要成分；槲皮素、山柰酚和異鼠李素為普遍存在的黃酮醇類物質(zhì)，并且以槲皮素為主，槲皮素-3-O-蕓香糖苷為主要成分。

3.2 24份蘭屬樣品花色素對(duì)花色的影響

為了探究花色素對(duì)花色表型的影響，本研究統(tǒng)計(jì)了花青素、花黃素、類胡蘿卜素、葉綠素及類黃酮主成分與花色的相關(guān)性。前人研究發(fā)現(xiàn)，文心蘭、蝴蝶蘭的總花青素苷含量與花色的明度(L*)、色相(b*)呈顯著負(fù)相關(guān)[9,16]。本研究結(jié)果與之相似，由不同色系的花色表型與花色素含量之間的相關(guān)性分析結(jié)果可知，L*與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明總花青素及矢車菊素含量是影響L*的重要因素，隨著TAC或Cy含量的增加，可使花色變暗，反之可使明度提高；L*與a1和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷是影響L*的主要花色素。紅綠程度(a*)與葉綠素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明當(dāng)a*>0時(shí)，隨著葉綠素的積累，花瓣的紅色程度會(huì)減弱；當(dāng)a*<0時(shí)，花瓣的綠色程度會(huì)加深，說(shuō)明葉綠素是影響花色紅綠程度的重要因素。b*與TAC含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Cy、a1、a3、a5和a6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明總花青素、矢車菊素及矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素3-O-丙二酰葡萄糖苷含量是影響b*的重要花色素，并且隨著TAC、Cy、a1、a3、a5和a6含量的增加，當(dāng)b*>0時(shí)，花瓣的黃色程度會(huì)隨之下降；當(dāng)b*<0時(shí)，花瓣的藍(lán)色程度會(huì)隨之增加，花色向紅紫色和紫色方向變化；隨著TAC、Cy、a1、a3、a5和a6含量的降低，b*發(fā)生相反變化。飽和度(C)與TAC、Cy含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與a1、a3和a5含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明總花青素、矢車菊素以及矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-蕓香糖苷-5-O-葡萄糖苷、矢車菊素 3-O-丙二酰葡萄糖苷為影響花色飽和度的主要色素，并且隨著TAC、Cy、a1、a3、a5的積累，花瓣的色彩飽和度會(huì)隨之下降。而除Sy含量與C呈顯著負(fù)相關(guān)外，花黃素含量與花色表型沒(méi)有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明花黃素不是顏色參數(shù)的主要影響因素，與Li等[34]的研究結(jié)果一致，但可作為輔助色素，影響花青素色素的顏色，有研究結(jié)果表明，花黃素與糖苷發(fā)生的共色作用可以使花青素更加穩(wěn)定[35]。

有研究者認(rèn)為，蘭花紅色部分(暗紅色和暗紫紅色)的花色主要取決于花青素苷元比例，芍藥花素含量越高，花色越偏向紅色；矢車菊素含量越高，花色越偏向紫色；類胡蘿卜素可以使花呈現(xiàn)黃色、橙色[11]。本研究中所有檢出花青素的樣品均以矢車菊素為主，并且花色呈現(xiàn)紅紫色至紫色。

本研究對(duì)春蘭大富貴花朵不同部位花色素進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，TAC含量表現(xiàn)為苞片>舌瓣>外瓣，類胡蘿卜素含量表現(xiàn)為苞片>外瓣>舌瓣，葉綠素含量表現(xiàn)為外瓣>苞片>舌瓣，均存在顯著差異。大富貴苞片呈現(xiàn)紫色，其花青素、類胡蘿卜素和葉綠素含量均具有較高水平，由于具有較高含量的花青素，使花色向紅紫色、紫色方向變化，明度降低，而較高含量的葉綠素使花色綠色程度加深，同時(shí)由于類胡蘿卜素與花青素協(xié)同作用，可使花色呈現(xiàn)出單一類花色素?zé)o法呈現(xiàn)的橘紅色至紅色、青銅色至棕色的變化[36]，在上述3種花色素的綜合作用下，大富貴苞片顏色向紫色方向變化。同理，黑墨花中含有極高含量的花青素(為大富貴苞片的3.14倍)，使其花色較暗，在與較高含量的類胡蘿卜素、葉綠素協(xié)同作用下呈現(xiàn)出棕色。大富貴舌瓣呈白底紅斑，其類胡蘿卜素、葉綠素含量較低，而花青素含量較高，前人研究發(fā)現(xiàn)，大花蕙蘭綠色、白色花的舌瓣紅斑明顯則表明花青素含量較高，紅斑淺淡則表明只含有微量花青素[12]。此外，在文心蘭舌瓣為黃色、綠色的材料中也未檢出花青素[16]。以上研究結(jié)果表明，參試蘭屬植物花舌瓣紅斑部分主要由花青素決定，舌瓣底色主要受類胡蘿卜素、葉綠素影響；大富貴外瓣為綠色并有1條紅筋，其葉綠素、類胡蘿卜素含量較高，TAC含量較低，推測(cè)其瓣綠色主要受葉綠素影響，而瓣紅筋部分由花青素產(chǎn)生。

在所有參試材料中都檢測(cè)到了類胡蘿卜素、葉綠素，黃色系和黃綠色系花瓣中類胡蘿卜素水平與紅紫色系沒(méi)有明顯差異，但黃色系不含有花青素，黃綠色系含有低含量或不含有花青素，表明使參試蘭屬植物花色呈黃色的主要花色素是類胡蘿卜素。與本研究結(jié)果相似的是，Hieber等[37]發(fā)現(xiàn)切花文心蘭Onc. Gower Ramsey系列的黃色唇瓣中的主要黃色色素是幾種類胡蘿卜素。與粉紅色、紅色系月季相比，黃色月季花瓣中的花青素苷含量很低，總黃酮醇含量適中，類胡蘿卜素含量最高[8]。

根據(jù)RHCSS評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究有8份材料被判斷為黃綠色系，但目測(cè)又可將其分為綠色、黃綠色，綠色包括大富貴外瓣以及蒼巖素、瑞梅、白墨、蓮瓣素、翠玉外瓣，其中白墨、蓮瓣素和翠玉外瓣葉綠素含量較低，為11.87～110.64 μg/g，類胡蘿卜素含量也較低，為72.99～513.38 μg/g，且不含花青素，葉綠素為這3個(gè)材料的主要花色素；蒼巖素、大富貴和瑞梅外瓣葉綠素含量水平較高，為154.6～316.23 μg/g，雖然類胡蘿卜素含量均為黃色系材料的2～5倍，達(dá)799.60～1 611.13 μg/g，且大富貴、瑞梅外瓣含有少量的花青素，含量為52.87～99.95 μg/g，但可能由于葉綠素水平較高因而呈現(xiàn)綠色，表明葉綠素對(duì)蘭屬植物花色呈現(xiàn)綠色有重要影響。此外，凝香紫、黑墨與韓國(guó)小姐外瓣的葉綠素含量在種群內(nèi)也處于較高水平，但其外瓣分別呈現(xiàn)紫色、棕色及紅紫色，可能與其同時(shí)含有高含量的花青素有關(guān)。

綜上，推測(cè)花青素、葉綠素是本研究中參試蘭屬植物花呈色的關(guān)鍵色素，類胡蘿卜素是黃色花的主要色素。

3.3 24份蘭屬材料花中類黃酮代謝途徑推測(cè)

根據(jù)花中代謝物的相對(duì)含量，結(jié)合前人的研究結(jié)果[12,29]，推測(cè)蘭屬植物花瓣中類黃酮代謝途徑如下：香豆酰-COA和丙二酰-COA依次在查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)的催化下生成柚皮素(是合成所有類黃酮所必需的)。柚皮素在黃酮合酶(FNS)催化下生成芹菜素，進(jìn)而在F3′H催化下生成木樨草素，在甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)催化下生成金圣草黃素[38-39]，這是黃酮合成的關(guān)鍵分支步驟。柚皮素受黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的催化，生成二氫山柰酚(DHK)，DHK分別受類黃酮-3′-羥化酶(F3′H)、類黃酮-3′-5′-羥化酶(F3′5′H)的作用，合成二氫槲皮素(DHQ)和二氫楊梅素(DHM)。DHK、DHQ和DHM在黃酮醇合成酶(FLS)作用下分別生成山柰酚、槲皮素和楊梅素，這是黃酮醇合成的關(guān)鍵分步驟[40]。槲皮素、楊梅素進(jìn)而在甲基轉(zhuǎn)移酶MT作用下分別生成異鼠李素、丁香亭。另外，DHK、DHQ和DHM 在二氫黃酮醇還原酶(DFR)和花青素苷元合成酶(ANS)的催化下分別產(chǎn)生著色的花青素如天竺葵素、矢車菊素和飛燕草素[36]，其中矢車菊素受到MT的催化而合成芍藥花素，飛燕草素接連受到MT的催化，分別合成矮牽牛素和錦葵素(圖9)。綜合分析可知，本研究參試蘭屬花組織中檢測(cè)到矢車菊素和芍藥色素的衍生物，表明花青素的形成涉及ABP通路中的矢車菊素合成分支。

虛線框表示本研究未涉及的代謝途徑；CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；FNS：黃酮合成酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；F3′H：類黃酮-3-羥化酶； F3′5′H：類黃酮 3′5′-羥化酶；FLS：黃酮醇合成酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；ANS：花青素合成酶； 3GT：類黃酮 3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；MT：轉(zhuǎn)甲基酶。圖9 24份蘭屬材料花中類黃酮代謝途徑Fig.9 Metabolic pathways of flavonoids in flowers of 24 Cymbidium Sw. samples