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    基于TLR4 信號(hào)通路探討丹參多糖緩解LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎癥的作用機(jī)制

    2022-02-06 06:46:00靳國(guó)忠竇萌萌焦玉蘭吳占軍史萬玉包永占
    關(guān)鍵詞:乳腺炎炎性乳腺

    靳國(guó)忠,張 迪,劉 維,竇萌萌,焦玉蘭,3,吳占軍,史萬玉,2,包永占

    (1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071000;3. 瑞普生物藥業(yè)有限公司,河北 保定 071000;4.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所,河北 石家莊 050035)

    乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖中常見的疾病之一,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎是包括衛(wèi)生條件、擠奶方式、乳房血液循環(huán)和諸多病原微生物等在內(nèi)的多方面因素共同作用的結(jié)果[1]??茖W(xué)的養(yǎng)殖和管理可以最大程度的降低由飼養(yǎng)方面不足引發(fā)乳腺炎的概率,抗生素可以有效的治療由病原菌引起的乳腺炎癥反應(yīng)。但抗生素的長(zhǎng)期使用和濫用會(huì)提高細(xì)菌的耐藥性,抗生素還容易在動(dòng)物食品制品中殘留[2]。考慮到食品安全和耐藥殘留的問題,人們已經(jīng)開始積極尋找新的治療方法和藥物以求減少抗生素的使用[3]。天然中草藥及其提取物逐漸成為研究熱點(diǎn)[4]。

    LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分,在發(fā)病機(jī)制中經(jīng)常發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。炎癥過程中,LPS 的刺激會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞中Toll 樣受體信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)。更多的研究表明,Toll 樣受體4(TLR4)在LPS 誘導(dǎo)的炎癥過程中扮演了重要的角色[6]。LPS 侵入機(jī)體后,首先與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合,形成的結(jié)合體可以更好的與CD14 分子結(jié)合,之后將LPS 快速的呈遞給TLR4/MD-2 受體復(fù)合物,調(diào)節(jié)LPS 的識(shí)別[7]。TLR4 信號(hào)通路激活后,主要通過調(diào)節(jié)下游MyD88 和NF-κB 等蛋白來傳遞炎癥的發(fā)生[8]。使用藥物促進(jìn)機(jī)體內(nèi)清除脂多糖并調(diào)控TLR4 信號(hào)通路因子表達(dá)水平可以成為緩解炎癥損傷的研究方向。

    中藥丹參是唇形科植物丹參的干燥塊莖和根部,有活血祛瘀,涼血消癰之功效[9]。SMPs 是丹參主要的水提物之一,現(xiàn)代研究證實(shí),SMPs 具有調(diào)節(jié)免疫、減輕肝臟損傷、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種作用[10]。然而,SMPs 在脂多糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型中的抗炎作用及其分子機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)選取小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象,研究SMPs 的日常添加對(duì)乳腺炎是否具有調(diào)節(jié)作用,探討SMPs 調(diào)節(jié)乳腺炎的相關(guān)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    昆明小鼠共80 只,雌性60 只,雌性20 只,8 周齡,體重35 ~40 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按照雌性和雄性比例3∶1 合籠,提供充足的水和飼料,雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。分娩1 周后建立小鼠乳腺炎模型。

    1.2 試劑與材料

    丹參多糖(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司);脂多糖干粉試劑(SIGMA);TLR4,MyD88,P65抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);MPO 試劑盒(南京建成生物工程研究所);TNF-α,IL-6 和IL-1β ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);總RNA 提取試劑盒;反轉(zhuǎn)錄試劑盒;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物(見表1);免疫熒光試劑(寶生物工程(大連)有限公司)。

    表1 目的基因引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及序列號(hào)Table 1 Target gene primer sequence, amplified fragment length and sequence number

    1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與乳腺炎模型建立

    本試驗(yàn)將母鼠隨機(jī)分為5 組:對(duì)照組、模型組(0.2 mg/mL)、SMPs 低劑量(250 mg/kg)組、SMPs 中劑量組(500 mg/kg)組、SMPs 高劑量組(750 mg/kg)組,每組12 只。待母鼠分娩后,按照分組使用不同濃度SMPs 溶液對(duì)雌鼠進(jìn)行1 周的灌胃,對(duì)照組和模型組用等體積生理鹽水代替;1 周后,母鼠第4 對(duì)乳頭注射LPS 進(jìn)行乳腺炎造模。對(duì)照組用等量PBS 緩沖液代替。LPS 造模24 h 后,頸椎脫臼處死母鼠,取乳腺一部分使用4%甲醛溶液固定,一部分在-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 小鼠乳腺的組織學(xué)評(píng)價(jià)

    按照石蠟切片的制作流程對(duì)4%甲醛溶液固定好的乳腺組織進(jìn)行石蠟切片制作。制作好的切片進(jìn)行H&E 染色,中性樹脂封片。顯微鏡下觀察各組乳腺組織病理學(xué)變化。

    1.5 小鼠乳腺組織MPO 活性及炎性因子的測(cè)定

    -80 ℃冰箱中取出凍存的小鼠乳腺組織,稱取適量,加入生理鹽水將乳腺組織磨成10%的勻漿,在4 ℃下12 000 r/min 離心10 min,然后按照廠家說明書操作步驟,用試劑盒對(duì)MPO 活力和各炎性因子進(jìn)行評(píng)價(jià)測(cè)定。

    1.6 Western blot 檢測(cè)小鼠乳腺組織中TLR4 信號(hào)通路變化

    利用組織蛋白提取液提取乳腺組織內(nèi)蛋白,用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。將各組小鼠乳腺組織中總蛋白濃度調(diào)至同一水平,蛋白樣品用10% 的SDS-PAGE 分離,隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,并在5%脫脂牛奶中封閉。隨后,特異性一抗GAPDH、TLR4、MyD88 和p65 在4 ℃下孵育PVDF 膜過夜。室溫下用 TBST 洗滌3 次,每次5 min,然后使用特定二抗抗體孵育PVDF 膜2 h 后暗處進(jìn)行顯色操作。

    1.7 RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠乳腺組織中TNF-α,IL-6 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平變化

    按照總RNA 提取試劑盒的說明在無菌無酶的條件下使用經(jīng)高壓的器械嚴(yán)格操作進(jìn)行總mRNA 的提取,測(cè)定和調(diào)整濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。使用反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 說明書操作進(jìn)行各因子的mRNA 水平檢測(cè)。

    1.8 數(shù)據(jù)分析

    所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM 表示。這些數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism7 (Manufacturer, La Jolla, CA,USA)采用單因素方差分析和Tukey 多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 丹參多糖對(duì)各組小鼠乳腺組織中炎癥發(fā)生程度的影響

    空白對(duì)照組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,細(xì)胞核清晰可見且排列有序,代表腺泡結(jié)構(gòu)完整沒有病理損傷。模型組乳腺組織中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腺泡邊界模糊難以觀察,乳腺組織結(jié)構(gòu)變形被破壞,乳腺組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。SMPs 低劑量組乳腺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,腺泡結(jié)構(gòu)比較清晰。SMPs中劑量組乳腺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著減輕。SMPs 高劑量組乳腺組織中基本無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),整體更趨近于健康狀態(tài)(見圖1)。

    圖1 SMPs 對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織病理學(xué)變化的影響Fig. 1 Effect of SMPs on mammary histopathological changes in mastitis mice

    2.2 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)MPO 活性和促炎因子表達(dá)水平的影響

    在造模24 h 后,各組小鼠乳腺組織內(nèi)MPO 活性和促炎因子表達(dá)水平發(fā)生不同變化(見圖2)。與空白對(duì)照組相比,小鼠乳腺組織內(nèi)髓過氧化物酶(MPO)活力與炎性因子TNF-α,IL-1β 和IL-6的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上升(P<0.01),而與模型組相比,SMPs 各劑量組小鼠乳腺組織中MPO活性和炎性因子表達(dá)水平與模型組相比顯著下降(P<0.01),且呈一定的劑量依賴性。

    圖2 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中MPO 及炎性因子表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of SMPs on MPO and inflammatory factors expression in mouse mammary tissue

    2.3 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)TLR4 炎癥信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

    炎癥發(fā)生后,不同組別小鼠乳腺組織內(nèi)TLR4信號(hào)通路中蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)差異(見圖3)。與空白對(duì)照組相比,模型組TLR4 通路關(guān)鍵蛋白TLR4、MyD88 和NF-κB 表達(dá)水平顯著上升。與模型組相比,SMPs 低、中、高劑量組中TLR4 蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著降低,且劑量越高降低趨勢(shì)越顯著。在MyD88蛋白表達(dá)水平上,SMPs 低劑量組中MyD88 蛋白表達(dá)水平與模型組之間變化不顯著,SMPs 中、高劑量組MyD88 蛋白表達(dá)水平均有顯著下降。SMPs 低、中、高劑量組中NF-κB 蛋白表達(dá)水平與模型組相比均有顯著降低。

    圖3 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of SMPs on key protein expression in TLR4 signaling pathway in mouse mammary tissue

    2.4 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)TNF-α,IL-6 和IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

    為了驗(yàn)證炎性因子mRNA 表達(dá)水平是否受到調(diào)節(jié),采用RT-qPCR 法檢測(cè)因子TNF-α,IL-1β 和IL-6 mRNA 在乳腺組織內(nèi)的表達(dá)水平。如圖4 所示,LPS 刺激顯著上調(diào)了乳腺組織中TNF-α,IL-1β和IL-6 因子mRNA 表達(dá)水平(P<0.01)。與模型組比,SMPs 各用藥組組內(nèi)TNF-α,IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平有不同程度的顯著下降(P<0.05或P<0.01)。

    圖4 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中TNF-α,IL-1β 和IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 Effects of SMPs on mRNA transcription levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in mouse mammary tissue

    3 結(jié)論與討論

    在炎癥發(fā)生過程中,組織內(nèi)炎性因子表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯變化,據(jù)報(bào)道,TNF-α,IL-6 和IL-1β等促炎因子表達(dá)水平在乳腺組織炎癥中顯著上升[11],有研究指出, IL-1β 的產(chǎn)生會(huì)加重組織的損傷程度,通過調(diào)控IL-1β 的產(chǎn)生可以改變機(jī)體對(duì)損傷的抵抗能力[12]。有研究表明, IL-6 的相應(yīng)抗體或阻斷劑,可以用來治療關(guān)節(jié)炎[13]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組炎性炎因子TNF-α,IL-6 和IL-1β 的表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著上升,SMPs 各劑量組乳腺組織中炎性因子的表達(dá)水平與模型組相比明顯下降。這說明SMPs 的使用降低了炎性因子的表達(dá)水平,在一定程度上減輕了炎癥對(duì)乳腺組織的損傷。

    TLR4 受體在LPS 誘導(dǎo)的炎癥中活化表達(dá),之后通過一定的復(fù)合物二聚體可以激活MyD88 依賴途徑,進(jìn)一步調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的表達(dá),最終形成一條完整的炎癥傳遞鏈條[14]。為了闡明丹參多糖的抗炎機(jī)制,采用Westen Blot 法檢測(cè)TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白TLR4,MyD88 和NF-κB 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,這些蛋白表達(dá)水平在炎癥過程中顯著上升。眾多研究中,Zhou Ershun 等人使用封花素(CEP)抑制了NF-κB 因子在乳腺炎小鼠模型中的活化,從而實(shí)現(xiàn)了藥物的抗乳腺炎作用[15]。Xingxing Chen 等人進(jìn)一步探究了藥物荷花堿(Nuciferine)是通過抑制TLR4-NF-κB 信號(hào)通路來改善LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎癥[16]。盧勁曄等人采取NLRP3 抑制劑預(yù)處理,可以減輕大腸桿菌所致的乳腺組織損傷并且降低炎癥小體表達(dá)[17]。Maiju Rinne 等人闡釋了米托蒽酮、吡哌酮和米托蒽酮(2 羥乙基)哌 嗪(Mitoxantrone, pixantrone and mitoxantrone(2-hydroxyethyl)piperazine)等藥物在拮抗TLR4 受體方面的機(jī)制,這些藥物可以通過拮抗TLR4 進(jìn)一步達(dá)到抑制NF-κB 激活和TNF-α 生成的作用[18],這說明抑制信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)可以減輕炎癥。并不是所有的藥物都通過MyD88 依賴途徑來調(diào)節(jié)炎癥,在試驗(yàn)中也對(duì)SMPs 的具體作用路徑進(jìn)行探究[19-20]。本試驗(yàn)表明,SMPs 抑制了TLR4,MyD88和NF-κB 蛋白在LPS 誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織炎癥中的表達(dá)水平,說明SMPs 可能是通過MyD88 依賴途徑來調(diào)控TLR4/NF-κB 信號(hào)通路以達(dá)到保護(hù)乳腺組織的作用。

    乳腺組織在炎癥發(fā)生時(shí),促炎因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)的mRNA 轉(zhuǎn) 錄 水 平 會(huì) 上 升,這 與宿主防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答有關(guān)[21]。黃永周等人使用梔子苷治療患乳腺炎的小鼠,檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠乳腺上皮細(xì)胞中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下降[22]。本試驗(yàn)中模型組的促炎因子mRNA 水平顯著上升,用藥組的水平呈劑量依賴性下降,這直觀的說明了SMPs 在乳腺組織中可以發(fā)揮抗炎作用。

    綜上所述,SMPs 可以通過抑制TLR4 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥;同時(shí)還可以抑制組織內(nèi)促炎因子的表達(dá)來緩解炎癥對(duì)乳腺組織的損傷。SMPs 可以成為預(yù)防奶牛乳腺炎的潛在藥物。

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