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    新型冠狀病毒核酸檢測弱陽性質(zhì)控失控分析及影響因素*

    2022-02-03 00:45:22李育敏付曉歌郭東月龔海娜曾子朗姚潔儀鄧巧梅李雙張秀明
    臨床檢驗雜志 2022年11期
    關(guān)鍵詞:弱陽性失控核酸

    李育敏,付曉歌,郭東月,龔海娜,曾子朗,姚潔儀,鄧巧梅,李雙,張秀明

    (深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學檢驗實驗室 & 深圳大學第三附屬醫(yī)院檢驗科,廣東深圳 518001)

    新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎,COVID-19)疫情在世界范圍內(nèi)持續(xù)流行,引發(fā)疫情的新型冠狀病毒(新冠病毒,2019-nCoV)基因組不斷變異,影響病毒的生物學特性。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第九版),新冠病毒核酸檢測陽性為確診的首要標準[1]。各醫(yī)療機構(gòu)應當加強核酸檢測的質(zhì)量控制,確保檢測結(jié)果準確可靠。按照《新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》要求[2],實驗室應開展室內(nèi)質(zhì)控,每批檢測至少有1份弱陽性質(zhì)控品(第三方質(zhì)控品,通常為檢出限的1.5~3倍)、3份陰性質(zhì)控品(生理鹽水),質(zhì)控品隨機放在臨床標本中,參與從提取到擴增的全過程。在新冠病毒核酸檢測過程中,第三方弱陽性質(zhì)控一旦出現(xiàn)失控,將會影響結(jié)果的準確判讀。目前針對核酸檢測失控現(xiàn)象分析的報道較少。本實驗室嚴格按照國家文件規(guī)定每批檢測至少1份弱陽性質(zhì)控(廣州邦德盛公司),現(xiàn)就實際工作中發(fā)現(xiàn)的弱陽性質(zhì)控失控案例進行總結(jié)分析,探討相關(guān)影響因素和解決措施,供臨床參考。

    1 案例分析

    1.1室內(nèi)質(zhì)控失控案例1 當天發(fā)現(xiàn)多批次弱陽性質(zhì)控ORF1ab基因無Ct值或Ct值增高現(xiàn)象(圖1A)。針對失控可能發(fā)生的原因,實驗室逐一排查。(1)核酸提取或擴增:實驗室采用的核酸提取試劑為重慶中元匯吉核酸提取試劑盒(磁珠法),擴增試劑為上海伯杰公司新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)。當天失控批次的所有樣本檢測內(nèi)標正常,表明核酸提取和擴增過程正常。(2)質(zhì)控品:更換另一廠家擴增試劑檢測弱陽性質(zhì)控,結(jié)果符合預期值(圖1B),排除質(zhì)控品質(zhì)量問題。(3)試劑:當天部分批次同時檢測弱陽性質(zhì)控和試劑盒自帶的陽性對照,ORF1ab均無Ct值或Ct值增高(圖1C),而另外部分批次試劑盒自帶的陽性對照ORF1ab和N的Ct值雖然接近預期值,但其熒光強度(Rn)仍低于前一天未失控批次自帶的陽性對照。結(jié)合第三方弱陽性質(zhì)控和自帶陽性對照均出現(xiàn)失控的現(xiàn)象,考慮為檢測試劑出問題的可能性大,更換同一廠家新批號試劑后,檢測弱陽性質(zhì)控Ct值符合預期值(圖1D),表明失控為試劑質(zhì)量問題所致。進一步調(diào)查也證實失控是發(fā)生在當天更換新批號試劑后,更換前檢測室內(nèi)質(zhì)控均符合預期值。廠商反饋為提高檢測靈敏度,對該批號試劑進行了優(yōu)化(具體環(huán)節(jié)不詳),考慮可能為優(yōu)化后反應體系如ORF1ab熒光探針等發(fā)生變化或其他干擾因素所致。

    1.2室內(nèi)質(zhì)控失控案例2 連續(xù)2天多批次弱陽性質(zhì)控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)增高現(xiàn)象(圖2A),質(zhì)控品均為同一批號,失控批次的樣本內(nèi)標檢測正常,試劑盒自帶的陽性對照ORF1ab和N的Ct值及Rn均正常(圖2B),考慮為該批號質(zhì)控品出問題的可能性大。更換新批號質(zhì)控品后ORF1ab Ct值檢測正常(圖2C),表明失控為該批號的質(zhì)控品自身質(zhì)量問題所致。

    1.3室內(nèi)質(zhì)控失控案例3 當天下午連續(xù)幾批弱陽性質(zhì)控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)明顯增高現(xiàn)象(圖3A-B),質(zhì)控品批號和擴增試劑批號均與前一天和當天上午相同,重新提取該批號質(zhì)控品后檢測ORF1ab的Ct值仍增高,更換新批號質(zhì)控品,用同一種擴增試劑同時檢測新、舊批號質(zhì)控,新批號質(zhì)控ORF1ab的Ct值明顯低于舊批號(圖3C),表明為舊批號質(zhì)控品問題所致,但是同一舊批號質(zhì)控品前后結(jié)果出現(xiàn)明顯差異,考慮可能為質(zhì)控品反復凍融或儲存不當發(fā)生了降解。繼續(xù)查看前后2天的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)當天上午檢測試劑盒自帶的陽性對照Ct值雖接近預期值,但熒光強度較前一天偏低,而且更換新批號質(zhì)控品后,ORF1ab Ct值雖明顯低于舊批號,但仍高于前一天,且熒光強度也較前一天弱,表明擴增試劑也存在問題。質(zhì)控品和試劑兩者均出現(xiàn)問題,因此考慮存儲不當?shù)目赡苄源?,而實驗室未發(fā)生斷電現(xiàn)象,考慮為冰箱門未封閉嚴密導致的溫度不達標。將擴增試劑和質(zhì)控品均更換后,檢測弱陽性質(zhì)控結(jié)果Ct值恢復至前一天預期值水平。采用新更換的試劑同時檢測新、舊質(zhì)控品,舊質(zhì)控較新質(zhì)控的ORF1ab Ct值更高,表明除儲存原因外,舊質(zhì)控品還存在多次使用、反復凍融的問題。

    注:黃色,內(nèi)標;綠色,N基因;藍色,ORF1ab基因。圖1 室內(nèi)質(zhì)控失控案例1

    注:黃色,內(nèi)標;綠色,N基因;藍色,ORF1ab基因。圖2 室內(nèi)質(zhì)控失控案例2

    注:黃色,內(nèi)標;綠色,N基因;藍色,ORF1ab基因。圖3 室內(nèi)質(zhì)控失控案例3

    1.4室內(nèi)質(zhì)控失控案例4 將中值質(zhì)控品(參考濃度:1.6×104copies/mL)稀釋20倍至800 copies/mL作為弱陽性質(zhì)控(檢出限500 copies/mL),稀釋初期檢測結(jié)果符合預期值,但是后續(xù)逐漸出現(xiàn)部分批次弱陽性質(zhì)控ORF1ab Ct值增高現(xiàn)象,檢測批次的Ct值強弱不等,重復性較差。而檢測質(zhì)控品原液(未稀釋)的Ct值符合預期值,且重復性較好,表明稀釋對質(zhì)控品的保存有一定影響,稀釋后質(zhì)控品存在降解和不穩(wěn)定現(xiàn)象。

    2 討論

    按照《新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》要求[2],實驗室開展室內(nèi)質(zhì)控,弱陽性質(zhì)控需采用第三方質(zhì)控品。目前,廠商制備的新冠病毒核酸檢測第三方質(zhì)控品以假病毒為原料,使用較為廣泛的有廣州邦德盛、北京康徹思坦等生物技術(shù)公司生產(chǎn)的室內(nèi)質(zhì)控品。相比試劑盒自帶的強陽性對照,采用第三方弱陽性質(zhì)控品的優(yōu)勢在于不針對于特定檢測系統(tǒng)和試劑進行優(yōu)化,具有廣泛的通用性,可更為客觀地評估檢測系統(tǒng)和反映誤差水平,更好地監(jiān)控不同廠家的試劑檢測弱陽性樣本的靈敏度,避免病毒拷貝數(shù)較低時,因檢測系統(tǒng)的靈敏度低導致弱陽性樣本漏檢,出現(xiàn)假陰性;其次陽性質(zhì)控的濃度越低,核酸污染的風險越小。3份陰性質(zhì)控品參與從提取到擴增的步驟,可有效監(jiān)測核酸檢測的全流程是否存在污染,也可以將其中1份生理鹽水暴露在生物安全柜內(nèi),直接加入到檢測試劑中監(jiān)測生物安全柜是否存在氣溶膠污染。3份陰性質(zhì)控檢測結(jié)果均為陰性,弱陽性質(zhì)控為陽性,且Ct值符合預期值,視為室內(nèi)質(zhì)控在控,否則為失控。

    核酸提取及擴增過程、試劑和質(zhì)控品質(zhì)量等出現(xiàn)問題均可引起失控。一般情況下,如樣本內(nèi)標檢測正常,核酸提取和擴增步驟出問題的可能性較小,那么發(fā)生失控首先考慮試劑或質(zhì)控品的問題。本研究分析的失控案例1和案例2分別由試劑和質(zhì)控品問題所致,而失控案例3分析原因后考慮為儲存不當所致的試劑和質(zhì)控品均出現(xiàn)問題,將擴增試劑和質(zhì)控品均更換后,檢測弱陽性質(zhì)控結(jié)果正常。因此,建議每批次同時檢測2份弱陽性對照,1份為第三方質(zhì)控品,1份為試劑盒自帶的陽性對照稀釋至檢出限的1.5~3倍(Ct值與第三方弱陽性質(zhì)控品接近),以便發(fā)生失控時能夠及時查找原因,采取糾正措施。另外檢測試劑配制好后應避光保存,并盡快使用,更換新批號試劑后,應按文件規(guī)定驗證試劑批間差異和關(guān)鍵耗材抑制物[3]。

    除以上原因外,質(zhì)控品的正確保存也是影響檢測結(jié)果的重要因素之一。本研究分析的失控案例3由于儲存原因所致保存溫度不達標,案例4由于將質(zhì)控品原液稀釋后影響了保存穩(wěn)定性。邦德盛液體質(zhì)控品首先對新冠假病毒(含ORF1ab、N、E和M基因)進行構(gòu)建和培養(yǎng),獲得培養(yǎng)液,對收獲的假病毒培養(yǎng)液進行初步定值,然后用陰性稀釋液稀釋至所需濃度,并添加了適量的穩(wěn)定劑。如實驗室因檢測弱陽性質(zhì)控的濃度要求,進行再次稀釋時采用的稀釋液或稀釋后儲存的耗材含RNase或抑制物等都可能影響質(zhì)控品的穩(wěn)定性,因此建議直接使用適合參考濃度(檢出限的1.5~3倍)的質(zhì)控品原液進行檢測,如邦德盛液體質(zhì)控品低值(參考濃度:1.4×103copies/mL),避免因稀釋造成的質(zhì)控不穩(wěn)定現(xiàn)象。另外質(zhì)控品原液及其提取后的核酸應嚴格按照說明書進行保存和使用,不可反復凍融或長時間存放于室溫及2~4 ℃,避免質(zhì)控品降解或變質(zhì)。

    在臨床新冠病毒核酸檢測過程中經(jīng)常會觀察到N基因和ORFlab基因的檢出率存在差異,N基因的陽性率通常高于ORF1ab基因,檢出的Ct值大于ORF1ab基因,這可能跟以下因素有關(guān)[4-10]:(1)ORF1ab基因特異性強,而N基因相對保守,易與其他病毒發(fā)生交叉反應;(2)新冠病毒轉(zhuǎn)錄新的mRNA均帶有N基因,而ORF1ab基因拷貝數(shù)較低;(3)2個基因序列不同,不同廠家的試劑設(shè)計對ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度存在差異等。同樣第三方弱陽性質(zhì)控品失控也常首先觀察到ORF1ab基因Ct值增高或檢測不出,而N基因可檢出。由于第三方質(zhì)控品非臨床樣本,其原因主要與試劑的靈敏度有關(guān)。

    綜上所述,新冠病毒核酸檢測出現(xiàn)弱陽性質(zhì)控失控,要從核酸提取、擴增和檢測結(jié)果全流程進行追溯分析,并結(jié)合試劑和質(zhì)控品綜合判斷失控原因及影響因素,及時采取相應的糾正措施,確保檢測結(jié)果準確可靠。

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