多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因組測(cè)序與同源性分析*

章志勇，李營(yíng)，姜健閣，薛萬華，邊奕鑫,2

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院德州醫(yī)院 德州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東德州 253000；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250033)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種革蘭陰性需氧非發(fā)酵菌，為常見的病原體之一。由于臨床上抗菌藥物的不合理應(yīng)用和過度使用，細(xì)菌耐藥率不斷上升，從對(duì)單一抗菌藥物耐藥逐漸發(fā)展為多重耐藥。多重耐藥菌是指對(duì)臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥的細(xì)菌[1]。常見的多重耐藥菌包含多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multi-drug resistanceAcinetobacterbaumannii, MDRAB)，是我國(guó)目前主要的“超級(jí)細(xì)菌”[2-3]。

分析德州市人民醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，近年來我院鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率維持較高水平，特別是碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在70%以上，與省內(nèi)其他同級(jí)醫(yī)院比較，我院鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率在平均水平以上，而腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌碳青霉烯類耐藥率維持較低水平(2%～3%)。為探究德州市人民醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率較高的原因，本研究收集臨床科室分離培養(yǎng)的23株MDRAB進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和耐藥基因及同源性分析，為臨床治療及醫(yī)院感染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2018年1月—7月德州市人民醫(yī)院住院患者臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)的鮑曼不動(dòng)桿菌23株，去除同一患者相同標(biāo)本來源的同種細(xì)菌。

1.2儀器與試劑 9120全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶、Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀和配套鑒定藥敏試劑NMIC/ID-4(美國(guó)BD公司)，MALDI Biotyper全自動(dòng)微生物質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng) 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)進(jìn)行菌株的分離、培養(yǎng)。取適量待測(cè)標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，置于35 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，溫育18～24 h。

1.3.2細(xì)菌鑒定與抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行鑒定及抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，并用MALDI Biotyper全自動(dòng)微生物質(zhì)譜儀對(duì)菌種的鑒定結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。依據(jù)2018年CLSI M100文件進(jìn)行藥敏結(jié)果判定，根據(jù)常規(guī)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氨基糖苷類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類以及碳青霉烯類5類抗菌藥物中的3類及以上藥物產(chǎn)生耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌作為研究的目標(biāo)菌。

1.3.3基因序列測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.3.3.1基因序列測(cè)序 菌種留存?zhèn)鞔笏腿A大基因(北京基因組研究所，中國(guó)深圳)進(jìn)行基因檢測(cè)。提取細(xì)菌基因組DNA、基因擴(kuò)增后，采用Illumina HiSeq 4000系統(tǒng)(美國(guó)Illumina公司)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的基因組進(jìn)行測(cè)序；使用Bioruptor超聲波儀(美國(guó)Diagenode公司)和物理化學(xué)方法隨機(jī)剪切基因組DNA以構(gòu)建read文庫(kù)。配對(duì)末端片段文庫(kù)根據(jù)Illumina HiSeq 4000系統(tǒng)的協(xié)議進(jìn)行測(cè)序。丟棄來自雙端測(cè)序的低質(zhì)量原始讀數(shù)后，利用SOAPdenovo v1.05軟件組裝測(cè)序讀數(shù)。使用針對(duì)細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒等微生物開發(fā)的glimmer3軟件，參照Hidden Markov模型對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌基因組組裝并進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。使用tRNAscan-SE、RNAmmer和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)tRNA、rRNA和sRNA進(jìn)行識(shí)別。整體分析可以劃分測(cè)序數(shù)據(jù)、組裝、基因組組分分析、基因功能分析、比較基因組學(xué)分析、DNA甲基化和結(jié)題報(bào)告7個(gè)模塊。

1.3.3.2同源性分析 將菌株基因組序列上傳至PubMLST.org，進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，應(yīng)用MEGA X version 10.1生物信息分析軟件依據(jù)16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用WHONET5.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

2 結(jié)果

2.1基本情況 在23株MDRAB中，主要來源為痰液標(biāo)本(20株，87.0%)，其次分別來源于支氣管肺泡灌洗液(1株，4.3%)、血液標(biāo)本(1株，4.3%)、尿液標(biāo)本(1株，4.3%)；科室來源主要是ICU(8株，34.8%)，其次是呼吸內(nèi)科(5株，21.7%)、神經(jīng)外科(5株，21.7%)、心內(nèi)科(1株，4.3%)、感染科(1株，4.3%)、神經(jīng)內(nèi)科(1株，4.3%)、腎內(nèi)科(1株，4.3%)、泌尿外科(1株，4.3%)；有ICU治療史的有18例(占78.3%)，無ICU治療史的5例(占21.7%)。

2.2抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 MDRAB對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星、慶大霉素、四環(huán)素的耐藥率為100%；對(duì)米諾環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星耐藥率為39.1%、77.8%、87%，而對(duì)多黏菌素B耐藥率為0%。

2.3全基因組測(cè)序耐藥基因分布結(jié)果 根據(jù)全基因測(cè)序技術(shù)分析23株MDRAB相關(guān)耐藥基因，共檢出36種耐藥基因，見表1。每株菌株共檢出29～34種耐藥基因。其中，對(duì)阿米卡星敏感的3株菌均缺失armA基因。

2.4同源性分析 根據(jù)菌株基因組序列，進(jìn)行MLST，使用MLST分型(Oxford)最終確定23株菌株來自7個(gè)分型，見表2。使用MLST分型(Pasteur)，顯示全部屬于ST2一種分型。16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：23株菌和AcinetobacterbaumanniistrainATCC 19606在1個(gè)大分支上，進(jìn)化距離近，而與醋酸鈣不動(dòng)桿菌不在一個(gè)分支，進(jìn)化距離遠(yuǎn)。但在大分支的基礎(chǔ)上，又分為2個(gè)小分支，菌株18A獨(dú)立為1支，其他22株菌與Acinetobacterbaumanniistrain ATCC 19606進(jìn)化距離更近，見圖1。

3 討論

本研究23例患者中有18例患者在診療過程中有ICU診療經(jīng)歷，說明患者在危重癥、免疫力低下、抗菌藥物大量使用狀態(tài)下，易成為MDRAB感染對(duì)象。此外，鮑曼不動(dòng)桿菌作為常見的環(huán)境菌，確認(rèn)其是致病菌還是定植菌，對(duì)臨床診斷十分重要。這需要保證每一例送檢標(biāo)本的質(zhì)量，避免定植菌給臨床治療帶來干擾和誤導(dǎo)，造成治療失敗。

碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療感染性疾病的最后手段，國(guó)內(nèi)的耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示不同等級(jí)醫(yī)院中耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率逐年上升[4-6]。MDRAB碳青霉烯耐藥的常見機(jī)制是產(chǎn)生水解碳青霉烯的β-內(nèi)酰胺酶，以B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)和D類苯唑西林水解型β-內(nèi)酰胺酶(OXA)最常見。本研究顯示23株MDRAB基因組中全部含有blaOXA-23-like(blaOXA-23和blaOXA-133)、blaOXA-51-like(blaOXA-66)基因，其檢出率為100%，并且多數(shù)菌株的blaOXA-23-like耐藥基因的上游發(fā)現(xiàn)了重復(fù)序列，說明該類基因在耐藥產(chǎn)生時(shí)起重要作用，與以往研究相一致[7-8]。VibriocholeraevarG基因編碼的蛋白質(zhì)是一種金屬β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)碳青霉烯類藥物水解活性強(qiáng)且不受酶抑制劑作用，本研究中此基因的檢出率(21.7%)雖然相對(duì)較低，但碳青霉烯類耐藥菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物通常都具有較高的耐藥性，需要引起關(guān)注。

表1 耐藥基因檢出情況

表2 菌株MLST多位點(diǎn)分型

圖1 基于16S rDNA序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

氨基糖苷修飾酶的修飾作用是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)于氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。有研究報(bào)道，鮑曼不動(dòng)桿菌分離株攜帶多個(gè)氨基糖苷類耐藥基因和16S rRNA甲基化酶基因，其中ANT(3″)-Ⅰ和armA每年都能檢測(cè)到[9]。本研究顯示，ANT(3″)-Ⅱb、APH(3′)-Ⅰa、armA基因檢出率均高于80%；對(duì)比藥敏結(jié)果，armA基因缺失的3株細(xì)菌對(duì)阿米卡星均敏感，說明16S rRNA甲基化酶在鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制中起到了更為主導(dǎo)的作用。

鮑曼不動(dòng)桿菌中的MDR由多種因素促成，除了產(chǎn)生水解酶的耐藥方式，還有復(fù)雜的外排泵系統(tǒng)。外排泵不僅參與MDR，而且會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的生物膜形成、毒力形成和致病等[10]。本研究中的多重耐藥菌株出現(xiàn)了13個(gè)RND外排泵、5個(gè)MFS家族外排泵、1個(gè)ABC、1個(gè)SMR和1個(gè)MATE家族的外排泵。除tet(D)基因檢出率為82.61%，tetR基因檢出率為78.26%外，其余基因檢出率為100%。由此可見，并非所有的外排泵都是由染色體編碼。一些細(xì)菌由于通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或抗性島獲得抗性基因而產(chǎn)生外排泵。例如，存在于鮑曼不動(dòng)桿菌AYE菌株中的抗性島AbaR1攜帶大約45個(gè)耐藥基因，其中25個(gè)與抗菌藥物耐藥相關(guān)，包括外排泵基因，例如tetA、cmlA等[11]。另外，鮑曼不動(dòng)桿菌通過基因水平調(diào)控各種外排泵的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)于多種抗菌藥物及消毒劑的抵抗力，因此，抑制外排泵對(duì)抗新出現(xiàn)的耐藥性至關(guān)重要。

目前同源性研究的方法主要是PFGE分型法、MLST以及16S RNA的DNA序列同源性分析等方法。通過測(cè)序獲取待測(cè)菌完整基因組數(shù)據(jù)，包括菌株類型、種屬鑒定、各種耐藥基因和毒力因子的信息[12]。根據(jù)獲得的基因組數(shù)據(jù)上傳至相應(yīng)網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分型，與PFGE分型法比較，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠。本研究通過對(duì)23株細(xì)菌進(jìn)行MLST以及16S RNA的DNA序列同源性分析，顯示MLST分型(Oxford)有7個(gè)型別，通過eBURST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其中ST540、ST191、ST1816,195、ST1806,208、ST1837,369、ST1816,1837,195,369為一個(gè)同分型組，ST381為一個(gè)單體組，而MLST分型(Pasteur)顯示全部屬于ST2一種分型，所以本院檢出的多重耐藥菌株有著非常接近的遺傳特征，來自同一來源。同時(shí)參考菌株來源及患者臨床信息，說明醫(yī)院感染的防控工作尤為重要，而MDRAB可作為院感工作的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。