新風膠囊含藥血清抑制脂多糖誘導的類風濕關節(jié)炎大鼠的滑膜成纖維細胞焦亡

王露琳，汪 元，劉 健，黃傳兵，張皖東，萬 磊，孫 玥，黃 旦

1安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230038；2安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，安徽 合肥 230031

類風濕關節(jié)炎（RA）是全身自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎為主要特征，患者可出現(xiàn)雙手小關節(jié)對稱性腫脹疼痛、活動不利、關節(jié)畸形，嚴重者可出現(xiàn)關節(jié)功能喪失，并出現(xiàn)多系統(tǒng)受累表現(xiàn)［1,2］?；ぱ资荝A的基本病理基礎，滑膜成纖維細胞（FLS）的異常增殖會分泌大量的炎性因子，新生的炎性因子又持續(xù)不斷的刺激FLS異常增殖，兩者之間相互促進，形成惡性循環(huán)［3］。近年來NLRP3炎癥小體在RA滑膜炎癥中的作用越來越受到研究者的重視，研究表明，NLRP3炎癥小體能夠誘導pro-IL-1β、pro-IL-18等促炎因子的成功剪切和最終釋放，從而誘導細胞炎癥反應。RA的發(fā)生發(fā)展過程中可能伴隨著NLRP3炎性小體的活化［4］，因此抑制NLRP3炎性小體的活化，可能是抑制RA-FLS細胞焦亡發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新風膠囊（XFC）不僅能夠改善RA患者臨床癥狀，減輕患者炎癥反應［5,6］，同時能明顯緩解AA大鼠組織腫脹度和炎癥指數(shù)，抑制過度表達的炎性因子［7,8］。有研究發(fā)現(xiàn)，RA關節(jié)滑膜中細胞焦亡和程序性壞死均明顯增強，提示細胞焦亡可能在RA滑膜炎的發(fā)病中起著重要作用，可能成為RA的治療潛在靶點［9］，RA-FLSs的過度增殖及焦亡等在RA的破壞和持續(xù)炎癥中發(fā)揮關鍵作用［10］。吳寧等［10］通過數(shù)據(jù)挖掘指出了與RA-FLSs焦亡相關的蛋白和細胞因子，并得出可能存在的焦亡通路，但具體機制仍不明確。本課題組前期僅研究了RA-FLSs凋亡［8］，關于焦亡研究還未深入。因此，本文通過構建RA-FLS 焦亡模型，擬從NLRP3炎癥小體信號通路闡明XFC對RA滑膜成纖維細胞焦亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞 RA-FLS購自iCell（賽百慷（上海）生物技術股份有限公司）。SPF級雄性SD大鼠20只，體質量200±20 g，源于安徽省實驗動物中心，許可證號：SCXK（皖）2019002，實驗通過倫理委員會批準，動物倫理編號：AHUCM-rats-2019008。按照標準飼養(yǎng)，適應性培養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.1.2 藥物 XFC由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心提供（皖藥制字Z20050062，批號：20200115），由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成，每粒藥含生藥0.4 g）。

1.1.3 試劑與儀器 脂多糖（Solarbio）；NLRP3、Caspase-1、GSDMD（Affinity）；Cell Counting Kit 8（Bestbio）；IL-18（Human）ELISA KIT、IL-1β（Human）ELISA KIT（RUIXIN Biotech）；NLRP3 抑制劑MCC950（MCE）等。酶標分析儀（Rayto，RT-6100）；高速冷凍離心機（Anhui Jiawen Instrument Equipment Co.,Ltd，JW-3021HR）；透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7700）；自動曝光儀（P&Q Science&Technology，JS-M6P）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo，3111）等。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 SD大鼠分為2組：空白組和XFC組予采用經(jīng)人大鼠體表面積比值折算成相當于人臨床等效用量0.324 mg/g 灌胃（等價于臨床等效劑量的20倍）［8］，空白組予等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃3 d，2次/d，末次給藥2 h后，取大鼠腹主動脈血，2500 r/min，離心15 min取上清，56 ℃水浴箱中孵育0.5 h，滅活除菌后分裝，儲存在-80 ℃冰箱里備用。

1.2.2 CCK-8法檢測XFC對RA-FLS最佳干預濃度和時間 細胞中加入不同濃度的XFC 含藥血清（2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%），分別干預12、24、48、72 h后，根據(jù)CCK-8法篩選不同濃度XFC含藥血清對RAFLS細胞活力的影響，篩選出XFC含藥血清最佳濃度和時間。

1.2.3 分組與模型制備 將RA-FLS放于20%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為空白組（RA-FLS）、模型組（RA-FLS+5 μg/mL 的LPS，培養(yǎng)48 h）、MCC950組（RA-FLS+LPS+MCC950）、XFC組（RA-FLS+LPS+XFC含藥血清）。

1.2.4 CCK-8檢測細胞活性 在96孔版中接種RA-FLS懸液（100 μL/孔），在恒溫箱中培養(yǎng)。3個復孔/組，各組按標準進行不同處理24 h，各孔中放CCK-8溶液（10 μL），孵育2 h 37 ℃，通過酶標儀測吸光度A450nm，計算細胞活性。

1.2.5 細胞焦亡形態(tài)學檢測 棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，加入2.5%戊二醛，4 ℃、固定3 h，收集細胞后，1000 r/min 10 min，離心成1.5～2 mm×2～3 mm大小的細胞團塊，再使用1%的鋨酸室溫固定2 h。PBS漂洗后，經(jīng)過乙醇、丙酮脫水。用812、丙酮包埋滲透后烤箱聚合48 h，溫度60 ℃。切片60～80 nm后鈾鉛雙染色15 min（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛），透射電鏡下觀察、采集圖像。

1.2.6 ELISA檢測IL-1β、IL-18濃度 使用IL-18（Human）ELISA KIT、IL-1β（Human）ELISA KIT（RUIXIN Biotech）試劑盒檢測，操作按試劑盒說明書完成。

1.2.7 qRT-PCR 法檢測NLRP3、caspase-1 和GSDMD mRNA表達 按照Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA，以1.0 μLcDNA為模板進行擴增，依次按照95 ℃1 min；95 ℃20 s、60 ℃1 min（40個循環(huán)）。按2-ΔΔCt法進行定量分析，引物由Sangon Biotech提供（表1）。

表1 引物列表Table 1 List of primers for RT-PCR

1.2.8 Western blot 檢測NLRP3、caspase-1 和GSDMD蛋白表達使用Western blotting法檢測蛋白，收集細胞沉淀，加入10%RIPA（含1mM PMSF），置于冰上、裂解細胞20 min，離心收集收集上清液（即細胞總蛋白）。電泳后，將被分離的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉恒溫封閉2 h。放入1∶1000對應一抗，4 ℃搖動孵育過夜。PBST洗PVDF膜后，再加入稀釋（1∶10 000）的二抗溶液，37 ℃孵育2 h，PBST洗3次。利用混合好的ECL溶液反應顯色，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，蛋白表達的灰度值用ImageJ軟件進行，最后與內參條帶內的灰度值進行比較，得到蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。各組數(shù)據(jù)以數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 XFC含藥血清作用于RA-FLS最佳干預濃度和時間

將不同濃度2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%XFC作用于RA-FLS：12、24、48、72 h后。細胞活力隨時間及新風膠囊濃度的增加逐漸降低，當新風膠囊濃度為20%、作用時間為24 h時，細胞活力最接近50%，故選擇20%、24 h為XFC含藥血清作用于RA-FLS的最佳濃度和時間（圖1）。

圖1 RA-FLS最佳含藥血清濃度和時間測定Fig.1 Determination of the optimal concentration and treatment time of the drug-containing serum for RA-FLS.

2.2 XFC含藥血清對RA-FLS細胞活性的影響

與空白組相較，模型組RA-FLS細胞活力顯著上升（P＜0.05）；與模型組相較，XFC 組和MCC950 組RAFLS細胞活力明顯降低（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組RA-FLS細胞活性的影響Fig.2 Viability of RA-FLS in different groups.*P＜0.05 vs blank group;##P＜0.01 vs model group.

2.3 XFC含藥血清對RA-FLS焦亡情況的影響

通過透射電鏡觀察焦亡情況，與空白組相較，模型組細胞膜破裂，細胞形成大量小泡（即焦亡小體），細胞內容物流出；與模型組相較，XFC組、MCC950組細胞焦亡情況較前改善（圖3）。

圖3 各組RA-FLS細胞焦亡情況Fig.3 Pyroptosis of RA-FLS in different groups(electron microscopy,scale bar=2μm).A:Blank group.B:Model group.C:XFC group.D:MCC950 group.Cell membrane ruptures are marked with red arrows.

2.4 XFC含藥血清對IL-1β和IL-18的影響

與空白組比，模型組IL-1β和IL-18濃度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比，XFC組和MCC950組IL-1β和IL-18濃度顯著下降（P＜0.05，P＜0.01，圖4）。

圖4 各組IL-1β、IL-18的濃度Fig.4 Concentrations of IL-1β and IL-18 in each group.**P＜0.01 vs blank group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.

2.5 XFC含藥血清對焦亡相關mRNA表達的影響

qRT-PCR法檢測以下指標，與空白組相較，LPS組GSDMD、caspase-1、NLRP3 mRNA表達明顯上調（P＜0.01）；與模型組相較，MCC950組和XFC組GSDMD、caspase-1、NLRP3 mRNA表達明顯下調（P＜0.01，圖5）。

圖5 各組細胞焦亡相關mRNA水平變化Fig.5 Changes of pyroptosis-related mRNAlevels in RA-FLS in each group.**P＜0.01 vs blank group;##P＜0.01 vs model group.

2.6 XFC含藥血清對焦亡相關蛋白表達的影響

與空白組相較，LPS組GSDMD、caspase-1、NLRP3蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；與模型組相較，MCC950組和XFC組能抑制GSDMD、caspase-1、NLRP3蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01，圖6、7）。

圖6 各組細胞焦亡相關蛋白表達Fig.6 Expressions of pyroptosis-related proteins in RA-FLS in each group.A: Blank group;B:Model group;C:XFC group;D:MCC950 group.

3 討論

目前RA的病理機制尚未完全闡明，但免疫炎癥反應始終貫穿RA發(fā)生發(fā)展的始終,炎癥反應的長期刺激會引起關節(jié)疼痛、腫脹、變形，最終導致關節(jié)畸形、關節(jié)功能喪失等，降低患者生活質量和幸福度［11,12］，是RA病情逐步進展的重要環(huán)節(jié)。細胞焦亡是一種新型炎性程序性細胞死亡方式，其焦亡過程為：細胞膜形成孔隙，細胞持續(xù)腫脹直至胞膜破裂，胞膜失去完整性，細胞內容物得以釋放，從而引起炎癥反應，釋放炎性因子，反過來促進細胞焦亡，如此循環(huán)反復后炎癥反應被無限擴大，進一步損傷機體［13-14］。本次研究通過LPS誘導RA-FLS制備滑膜炎癥模型，并給予新風膠囊含藥血清進行干預，發(fā)現(xiàn)LPS誘導的RA-FLS細胞活力上升，細胞膜破裂或趨于破裂，細胞形成大量焦亡小體，經(jīng)新風膠囊含藥血清干預后RA-FLS細胞活力明顯下降，焦亡小體減少，與NLRP3抑制劑MCC950組結果相同。這說明LPS能誘導RA-FLS發(fā)生炎癥反應，引起滑膜成纖維細胞焦亡，而新風膠囊含藥血清對LPS誘導的RA-FLS有明顯抑制作用，并能有效改善滑膜炎癥導致的細胞焦亡。

關于細胞焦亡的上游通路，即炎性小體的激活可能參與RA的疾病進程已有報道。然而，RA中細胞焦亡的研究相對較少。NLRP3炎癥小體是一類模式識別受體，可識別內源性及外源性的危險信號，介導caspase-1的成熟活化，參與IL-1β和IL-18加工、分泌，誘導細胞炎癥［15］。迄今為止，關于GSDMD的研究主要集中于它對細胞焦亡的調控作用，NLRP3炎癥小體介導caspase-1的成熟活化，同時切割GSDMD-N，釋放其有識別功能的N端，使N端結構插入細胞膜，細胞膜形成孔隙，完整性消失，導致細胞滲透壓失衡，最終胞膜被破壞，誘導細胞焦亡［16,17］。上調的NLRP3與RA細胞焦亡密切相關［18］。有研究表明，RA患者體內包括caspase-1、短長度NLRP3及全長NLRP3在內的NLRP3炎性體組分表達水平均顯著升高［19］。抑制NLRP3炎性小體的激活則可顯著改善膠原誘導關節(jié)炎模型小鼠的炎性反應［20］。在RA發(fā)病過程中，炎癥反應起著決定性作用，而細胞焦亡會加劇炎癥反應，NLRP3在細胞焦亡中扮演重要角色，其激活產(chǎn)生的caspase-1通過切割GSDMD-N，使胞膜被GSDMD孔通途化后，釋放炎癥因子，擴大炎癥反應，誘導細胞焦亡，因此NLRP3/GSDMD通路介導的滑膜成纖維細胞焦亡，可能成為潛在的治療靶點。本研究結果表明，與LPS組相比，給予NLRP3抑制劑MCC950和新風膠囊含藥血清均能降低RA-FLS 細胞NLRP3、caspase-1、GSDMD的mRNA和蛋白表達，表明新風膠囊抗細胞焦亡的作用可能與抑制NLRP3炎癥小體的活化及其下游炎癥因子的釋放相關，從而抑制滑膜成纖維細胞焦亡的發(fā)生，最終達到控制RA患者炎癥反應，達到治療RA炎癥的作用。

圖7 各組RA-FLS相關蛋白水平變化Fig.7 Changes of pyroptosis-related proteins in each group.**P＜0.01 vs blank group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.

RA屬中醫(yī)“痹證”、“鶴膝風”、“尪痹”范疇，本團隊提出RA的中醫(yī)基本病機在于脾虛濕盛、痰瘀痹阻，并研制新風膠囊應用于臨床，療效明確［5,6］。方中以黃芪、薏苡仁為君藥，具有益氣健脾化濕之功，現(xiàn)代藥理學研究顯示黃芪可以抑制IL-1β、IL-18、caspase-1的表達，降低炎癥相關指標，抑制炎癥反應［21,22］，薏苡仁可能通過下調NLRP3、caspase-1蛋白的表達，抑制細胞焦亡，從而改善炎癥反應［23］，臣藥雷公藤、蜈蚣通經(jīng)絡止痹痛，研究表明，雷公藤能抑制IL-1β、caspase-1分泌［24］，蜈蚣破瘀通絡止痛，降低炎癥因子水平，具有改善細胞焦亡的作用［25］，諸藥合用，共同起到健脾化濕通絡、抑制細胞焦亡作用。本研究可進一步證明XFC可以抑制RA-FLS細胞焦亡。因此，深入研究XFC治療RA細胞焦亡的機制研究具有重大意義。

綜上所述，XFC含藥血清可抑制RA-FLS異常增殖，抑制其焦亡，從而下調炎癥細胞因子的分泌，減輕關節(jié)局部炎癥反應而發(fā)揮治療作用，其分子機制可能與抑制NLRP3炎癥小體、caspase-1、GSDMD蛋白表達，降低IL-1β、IL-18細胞因子的表達水平有關。該結果為XFC臨床治療RA提供新依據(jù)，并且表明了NLRP3炎癥小體可能成為中醫(yī)藥治療RA新的靶點。