NDRG2通過調(diào)控肝癌細胞磷脂和甘油三酯代謝抑制肝細胞癌的生長：基于代謝組學分析

王佳媛，袁依依，張 坤，孫 翔，卜 歆，董 健，吳有盛，田紅英，沈 嵐

1延安大學醫(yī)學院病原生物學教研室，陜西 延安 716000；空軍軍醫(yī)大學2基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，3口腔醫(yī)學院，陜西 西安 710032

肝細胞癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，臨床上該腫瘤具有預(yù)后較差和病死率較高的特點。目前，肝癌的治療方式眾多，諸如外科手術(shù)切除、放療、化療和分子靶向治療等治療手段都應(yīng)用于肝癌的治療。但是，肝細胞癌患者5年生存率依舊非常低，其治療效果仍然差強人意［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，2020年我國肝癌發(fā)病例數(shù)41萬例，死亡病例數(shù)39萬例，死亡率極高［2］。因此，肝癌的分子靶向治療藥物逐漸成為目前的研發(fā)熱點，尋找更加有效且穩(wěn)定的分子靶向藥物是肝癌生物治療領(lǐng)域的重要內(nèi)容。目前，臨床常見的肝癌分子靶向藥物：表皮生長因子受體EGFR抑制劑、血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR抑制劑、PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑等，都與腫瘤細胞代謝密切相關(guān)［3］。從腫瘤代謝重編程的角度探索新的肝癌分子靶向治療藥物是肝癌生物治療領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容之一。

肝臟是人體最大的化工廠，細胞代謝十分旺盛。肝癌細胞也具有很顯著的代謝重編程特點，即：葡萄糖有氧酵解、磷酸戊糖代謝亢進、脂肪酸合成亢進、谷氨酰胺水解代謝亢進等特點［4,5］。腫瘤細胞通過代謝重編程以滿足其迅速增殖時對生物能量和生物原材料的迫切需求［6］。腫瘤代謝重編程的發(fā)生與癌基因的活化和抑癌基因的失活密切相關(guān)。其中，腫瘤細胞中重要原癌基因Myc的活化、抑癌基因p53的失活都將促進腫瘤代謝重編程［7,8］。Myc可以直接或者間接調(diào)節(jié)多個糖酵解代謝的關(guān)鍵酶，促進腫瘤有氧糖酵解［9］；Myc與轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP1）調(diào)節(jié)脂肪生成,促進腫瘤發(fā)生［10］；Myc還可以通過抑制miR-23a/b促進谷氨酰胺酶表達，增強谷氨酰胺分解代謝［11］。p53轉(zhuǎn)錄激活多個與細胞呼吸代謝相關(guān)靶基因，參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞糖、脂、氨基酸代謝，抑制腫瘤代謝重編程，從而抑制腫瘤的惡性增殖［12］。

NDRG2是本實驗室克隆和發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤抑制基因。由于該基因在結(jié)構(gòu)上與已發(fā)現(xiàn)的N-myc下游調(diào)節(jié)基因NDRG1具有較高的同源性，故命名為NDRG2［13-15］。該基因在包括肝細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤組織和細胞中表達降低，恢復該抑癌基因的表達可以抑制肝癌細胞生長增殖、有氧酵解、侵襲轉(zhuǎn)移等多種腫瘤惡性表型［16,17］。同時，該基因的表達產(chǎn)物還可以協(xié)同mTOR抑制劑參與抑制腫瘤的有氧酵解代謝，增強分子靶向藥物依維莫司的治療效果［18］。因此，深入研究該腫瘤抑制基因在腫瘤脂代謝重編程中的功能，以及該基因在腫瘤分子靶向治療中的應(yīng)用價值，具有潛在的臨床意義。在本項研究中，我們恢復肝細胞癌中NDRG2的表達，觀察其對肝細胞癌脂質(zhì)代謝的調(diào)控效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 研究資料

1.1.1 主要儀器與試劑 Triple TOF 6500+質(zhì)譜儀(AB SCIEX)，LC-20A超高壓液相色譜儀（Shimadzu），色譜柱：Waters，ACQUITYUPLC CSH C18，1.7μm，2.1 mm×100 mm column，低溫高速離心機（Eppendorf 5430R），MTBE（霍尼韋爾），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備儀器廠），二氧化碳孵箱（Heraeus）。甲醇、乙腈（HPLC級，Merck）。pLenti6-POZ 質(zhì)粒、pLenti6-NDRG2 質(zhì)粒、psPAX2 質(zhì)粒、pMD2.G 質(zhì)粒為本室保存，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen），殺稻瘟菌素（Gibco）。磷脂酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海通蔚生物科技公司），油紅O染色及過碘酸-雪夫PAS染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）。

1.1.2 數(shù)據(jù)收集 在TNMplot網(wǎng)站（https://tnmplot.com/analysis/）獲得抑癌基因NDRG2在肝細胞癌組織與正常肝組織表達豐度的差異［19］。從THPA網(wǎng)站（https://www.pro-teinatlas.org/）獲得抑癌基因NDRG2在肝細胞癌患者肝癌組織的表達水平與患者生存期的相關(guān)性數(shù)據(jù)，并通過該數(shù)據(jù)庫分析NDRG2在多種腫瘤細胞株的表達豐度。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系HepG2和HEK293T細胞購自購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。細胞培養(yǎng)于含10%FBS的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中視細胞的生長狀態(tài)進行換液，并在細胞達到對數(shù)生長期、融合度為85%～95%時進行消化傳代。消化過程中，先將原培養(yǎng)基吸除，用PBS洗滌3次去除殘余培養(yǎng)基，然后加入適量含0.25%胰蛋白酶/EDTA對細胞進行消化，待細胞消化完全后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打均勻，將細胞懸液置于離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清后加入完全培養(yǎng)基重懸，按照一定比例進行傳代，或者計數(shù)后進行鋪板。

1.2.2 慢病毒包裝 接種HEK293T細胞于100 mm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，待密度達到80%左右進行轉(zhuǎn)染。包裝體系包括：10 μg 載體質(zhì)粒（pLenti-POZ 質(zhì)粒、pLenti-NDRG2質(zhì)粒），7.5 μg包裝質(zhì)粒（psPAX2質(zhì)粒），2.5 μg 包膜質(zhì)粒（pMD2.G 質(zhì)粒）以及40 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000。將上述體系混勻，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細胞培養(yǎng)皿放入5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換新的培養(yǎng)液，48 h后用0.45 μm濾器過濾收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)液。標記并保存于-80 ℃冰箱，用于感染細胞。

1.2.3 慢病毒感染 進行感染前1 d，將HepG2細胞以低密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分別置于含5%胎牛血清的McCoy's5A，DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將收集的病毒液融化離心后和新鮮的細胞培養(yǎng)液按1∶1混合加入培養(yǎng)板中。慢病毒組分為Lenti-POZ，Lenti-NDRG2兩組，其中Lenti-POZ，Lenti-NDRG2慢病毒帶有殺稻瘟菌素抗性基因。病毒感染24 h后，分別更換含有殺稻瘟菌素的新鮮培養(yǎng)液，隔天換液，經(jīng)過2周左右的壓力篩選獲得穩(wěn)定感染的細胞株。

1.2.4 細胞系鑒定與篩選 兩組慢病毒Lenti-POZ，Lenti-NDRG分別感染后HepG2細胞后，通過實時定量PCR實驗檢測分析NDRG2 mRNA含量，每單組樣本設(shè)3復孔。TRIzol 法提取各組HepG2細胞總RNA，用微量分光光度計檢測總RNA的純度和濃度，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min。采用TB Green Premix II預(yù)混液于熒光定量PCR 儀上進行測定，反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。β-actin基因作為內(nèi)參，mRNA相對含量通過公式2-△△Ct計算。所有qRT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計并合成。其中實時定量PCR實驗使用引物序列如下：NDRG2正向引物序列為5'-CAGGACAAACACCCGAGA-3'，反向引物序列為5'-AGCCATAAGGTGTCTCCACAG-3'。β-actin 正向引物序列為5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'；反向引物序列為5'-GTACGGCCAGAGGCGTACAG-3'；同時，通過Western blot實驗檢測分析NDRG2 蛋白含量。使用RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑的混合溶液從各組HepG2細胞中提取總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，并用5×上樣緩沖液配平，置于100 ℃充分變性10 min，蛋白樣品上樣后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h；4℃冷藏室搖床過夜孵育相應(yīng)一抗（NDRG2 抗體稀釋比例為1∶1000）；TBST 洗膜3次，10 min/次；室溫搖床上孵育二抗1 h（β-actin抗體稀釋比例1∶2000）；TBST洗膜3次，10 min/次；超敏ECL試劑顯影。

1.2.5 樣本處理 收集培養(yǎng)好的各組細胞去除完全培養(yǎng)基，使用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌2 遍，然后加入預(yù)冷的生理鹽水1 mL 制備細胞懸液并進行細胞計數(shù)，確保各樣本含有相同的細胞數(shù)且不少于1×107/mL。取等量細胞懸液離心，細胞沉淀最后加入1 mL 甲醇：乙腈：水（2∶2∶1，V/V）混合溶液，吹懸細胞置于1.5 mL離心管，保存于-80℃冰箱，用于質(zhì)譜分析。

1.2.6 LC/MS分析 LC-MS分析使用Triple TOF 6500+質(zhì)譜儀與LC-20A 超高壓液相色譜儀。色譜柱選用Waters ACQUITY CSHC18（2.5 μm，100×2.1 mm）進行分析。流動相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；Post Time：5 min；進樣量：3 μL。優(yōu)化的色譜梯度：0～2 min，5%B；2～13 min，5%～95%B；13～15 min，95%B。Post time 設(shè)為5 min，用于平衡系統(tǒng)。質(zhì)譜使用正離子模式結(jié)合負離子模式。

1.2.7 信息分析 基于質(zhì)譜檢測得到原始數(shù)據(jù)文件，首先將原始數(shù)據(jù)文件導入ScienxOS軟件中，進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準確度和可靠性對脂質(zhì)進行多元統(tǒng)計分析，分析方法包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLSDA）等，用以揭示不同組別脂質(zhì)的差異。利用層次聚類（HCA）和脂質(zhì)相關(guān)性分析，揭示了脂質(zhì)和樣本之間的關(guān)系。通過脂代謝通路等功能分析發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)相關(guān)的生物學意義。

1.2.8 代謝物含量的檢測 分別利用多種磷脂即神經(jīng)酰膽堿PC、磷脂酰甘油PG、磷脂酰乙醇胺PE、鞘磷脂酰絲氨酸SM、和神經(jīng)酰胺Cer 5種酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒檢測兩組HepG2細胞內(nèi)相應(yīng)種類磷脂的含量。每組設(shè)立7 個復孔，利用酶標儀檢測450 nm 處吸光值A(chǔ)450nm，測定含量并計算相應(yīng)種類磷脂的含量。

1.2.9 HepG2 細胞油紅染色（1）去掉細胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌2遍；（2）4%多聚甲醛固定10 min，水洗；（3）加油紅O工作液1～2 mL，室溫避光染色30 min，密封；（3）60%異丙醇沖洗30 s至背景透明，水洗；（4）蘇木素染液復染細胞核30 s；（5）流水沖洗后，甘油明膠封片，室溫晾干，于顯微鏡下觀察各組HepG2細胞內(nèi)脂滴沉積情況并拍照。

1.2.10 HepG2細胞PAS染色（1）去掉細胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌2遍；（2）4%多聚甲醛固定10 min，水洗后70%酒精洗滌；（3）0.5%高碘酸酒精溶液氧化10 min后70%酒精洗滌；（4）加入還原液1 min后70%酒精洗滌；（5）加入無色鹽基性品紅溶液1～1.5 h后流水洗滌10 min；（6）蘇木素染液復染細胞核3 min，1%鹽酸酒精分化；（7）流水沖洗，脫水，透明，封固后于顯微鏡下觀察各組HepG2細胞內(nèi)多糖沉積情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS10.0與GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，對符合正態(tài)分布的的計量資料采用t檢驗或方差分析比較。對于不符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以百分位數(shù)法進行比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)篩選分析

通過TNMplot 數(shù)據(jù)庫獲得379 例正常肝組織及809例肝細胞癌組織中NDRG2的表達含量，統(tǒng)計分析后得到正常人肝組織與肝細胞癌患者NDRG2表達差異箱式圖，進行對比可發(fā)現(xiàn)：相對正常肝組織，肝細胞癌患者的肝癌組織中NDRG2基因表達量明顯降低（圖1，P＜0.05）。

圖1 NDRG2基因在正常肝組織及肝細胞癌組織中的表達Fig.1 Expression of NDRG2 gene in normal liver and hepatocellular carcinoma tissues.

2.2 NDRG2表達與HCC預(yù)后的關(guān)系

通過THPA數(shù)據(jù)庫分析得到NDRG2表達量與肝細胞癌患者預(yù)后生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示：NDRG2表達量愈高，患者生存時間越長（圖2）。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用THPA數(shù)據(jù)庫分析NDRG2基因在各種類型腫瘤細胞中RNA的表達豐度，結(jié)果顯示：肝細胞癌HepG2細胞系中NDRG2基因的表達豐度最高（圖3）。

圖2 NDRG2表達與HCC病人生存曲線的相關(guān)性Fig.2 Correlation between NDRG2 expression and survival of HCC patients.

圖3 NDRG2基因在各種腫瘤細胞系中的表達豐度Fig.3 Expression of NDRG2 in different tumor cell lines.

2.3 NDRG2在肝癌細胞內(nèi)的表達含量分析

將攜帶NDRG2 cDNA及其對照組POZ的慢病毒感染肝癌細胞系HepG2后，通過實時定量PCR實驗檢測HepG2細胞內(nèi)NDRG2 mRNA含量，結(jié)果顯示：與對照組相比，NDRG2的表達明顯增強，約為對照組2.6倍（P＜0.001，圖4A）。同時Western blot實驗檢測2組細胞內(nèi)NDRG2蛋白含量，結(jié)果顯示：與對照組相比，攜帶NDRG2 cDNA的慢病毒感染后HepG2細胞內(nèi)NDRG2明顯增強（P＜0.001，圖4B），與實時定量PCR實驗結(jié)果一致。

圖4 慢病毒感染后HepG2細胞中NDRG2含量Fig.4 NDRG2 expression in HepG2 cells infected with lentivirus containing NDRG2 or control POZ.A: Real-time qPCR for detecting NDRG2 mRNA levels in the infected HepG2 cells.B:Western blotting for detecting NDRG2 protein levels in the infected HepG2 cells.***P＜0.001.

2.4 細胞LC/MS分析總樣本PCA分析

將QC樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖，進行譜圖重疊比較，結(jié)果表明各色譜峰的響應(yīng)強度和保留時間基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較?。▓D5A）。將所有實驗樣本和QC樣本提取得到的峰，標準化后經(jīng)Pareto-scaling處理后進行PCA分析（圖5B）。觀察樣本之間的分布趨勢，經(jīng)7-fold crossvalidation（7次循環(huán)交互驗證）得到PCA的模型參數(shù),找出可能存在的離散點（圖5C）。分別建立實驗組與對照組的PLS-DA 模型（圖5D）和OPLS-DA 模型（圖5E），分析NDRG2 過表達的實驗組HepG2 細胞與對照組HepG2細胞脂質(zhì)代謝物的差異。

圖5 細胞樣本的質(zhì)控分析與代謝輪廓分析Fig.5 Quality control analysis and metabolic profile analysis of HepG2 cells infected with lentivirus containing NDRG2 or control.A:Total ion chromatogram(TIC)of QCs samples.B:PCAanalysis of the total samples.C-E:PCAplots,PLS-DAplots and OPLS-DA plots of NDRG2 overexpression HepG2 cells and control HepG2 cells.

2.5 顯著性差異脂質(zhì)

根據(jù)OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值（VIP）來衡量各脂質(zhì)的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，挖掘具有生物學意義的差異脂質(zhì)。本實驗以VIP＞1為篩選標準，初步篩選出各組間的差異物。進一步采用單變量統(tǒng)計分析，驗證差異脂質(zhì)是否具有顯著性。選擇同時具有多維統(tǒng)計分析VIP＞1和單變量統(tǒng)計分析P＜0.05的脂質(zhì)，作為具有顯著性差異的脂質(zhì)；而VIP＞1且0.05＜P＜0.1則作為差異脂質(zhì)。

從脂質(zhì)代謝組學的研究結(jié)果可以看出NDRG2表達含量增加，導致肝癌細胞中下列脂類物質(zhì)出現(xiàn)明顯變化，其中：溶血磷脂酰膽堿LPC 18：4_1和鞘磷脂SM 40：0出現(xiàn)增加；同時：卵磷脂PC 40：3、磷脂酰甘油PG 32：1、磷脂酰乙醇胺PE 42：2、甘油二酯DAG 38：2_7、磷脂酰乙醇胺PE 44：6、神經(jīng)酰胺Cer 42：0_2、磷脂酰絲氨酸PS 40:0、和甘油二酯DAG 38：4_7等大量脂類物質(zhì)出現(xiàn)明顯降低（圖6）。這些NDRG2表達增強后發(fā)生顯著變化的脂質(zhì)代謝物主要是磷脂類代謝物（表1）。

圖6 NDRG2過表達與對照組肝癌細胞差異脂質(zhì)代謝物層次聚類分析Fig.6 Hierarchical clustering analysis of differential metabolites between NDRG2-overexpressing HepG2 cells and control cells.

表1 前10種NDRG2表達增強后發(fā)生顯著變化的脂質(zhì)代謝物Table 1 Top 10 lipid metabolites that show significant changes in NDRG2-overexpressing HepG2 cells compared with the control cells

2.6 NDRG2過表達對肝癌細胞磷脂含量的影響

ELISA的檢測結(jié)果顯示：與POZ對照組相比，NDRG2過表達的HepG2細胞內(nèi)磷脂酰絲氨酸PS（155±2.41vs145±2.3，P＜0.05）、磷脂酰甘油PG（113±1.73vs106±1.3，P＜0.05）、磷脂酰乙醇胺PE（14.55±0.55vs13.11±0.31，P＜0.05）、磷脂酰膽堿PC（443.5±1.55vs386.25±0.35，P＜0.05）和神經(jīng)酰胺Cer（261±1.85vs245±2.15，P＜0.05）含量減少。NDRG2抑制肝癌細胞內(nèi)多種磷脂的含量（圖7）。

圖7 酶聯(lián)免疫分析NDRG2過表達與對照組肝癌細胞內(nèi)磷脂代謝物含量Fig.7 ELISAanalysis of phospholipids content in NDRG2-overexpressing HepG2.*P＜0.05 vs control.

2.7 NDRG2過表達對肝癌細胞多糖和甘油三酯蓄積的影響

PAS染色顯示：與對照組相比，NDRG2過表達的HepG2細胞多糖堆積明顯減少，推測糖脂含量減少。油紅O 染色顯示：與對照組相比，NDRG2 過表達的HepG2細胞脂質(zhì)堆積明顯減少（圖8）。NDRG2表達增強后顯著抑制了肝癌細胞內(nèi)甘油三酯和多糖的含量與聚集。

圖8 PAS染色和油紅O染色分析NDRG2過表達與對照組肝癌細胞內(nèi)多糖和甘油三酯含量Fig.8 PAS staining and Oil Red O staining for detecting intracellular glycogen and triglyceride in NDRG2-overexpressing HepG2 cells and control cells(Scale bar=50μm).

3 討論

代謝組學研究目前在基礎(chǔ)和臨床研究各個領(lǐng)域廣泛開展。在腫瘤代謝的研究領(lǐng)域中，代謝組學可以在較廣范圍內(nèi)靈敏觀察到代謝物的變化，從而聚焦相應(yīng)代謝途徑及其調(diào)控模式［20］。本項研究主要關(guān)注腫瘤抑制基因NDRG2對肝細胞癌脂質(zhì)代謝重編程的調(diào)控效應(yīng)。目前，我們的研究結(jié)果顯示NDRG2主要參與調(diào)控肝細胞癌HepG2細胞系中的磷脂和甘油三酯代謝。由于磷脂和甘油三酯合成代謝與游離脂肪酸密切相關(guān)，推測NDRG2可能參與脂肪酸的合成代謝過程。后續(xù)擬從多株肝癌細胞模型及NDRG2基因敲除小鼠肝臟組織中深入開展表型及機制研究。

磷脂是細胞膜的重要成分，其在細胞物質(zhì)和能量代謝中發(fā)揮重要作用。肝癌細胞磷脂代謝在腫瘤發(fā)生早期就出現(xiàn)了異常：在肝細胞癌早期患者的肝組織中多種甘油磷脂含量較高，包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺以及甘油磷酸膽堿等［21］；在肝細胞癌代謝組學研究中常常觀察到溶血磷脂酰膽堿的含量有顯著變化［22］；在包括肝細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中，重要的鞘磷脂分子1-神經(jīng)鞘氨醇的含量都增加，大量神經(jīng)鞘氨醇的儲存可能與肝細胞癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)［23］。因此，在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中，磷脂代謝重編程既滿足了腫瘤生長的能量與物質(zhì)需求，也為腫瘤生長微環(huán)境提供支持。

肝細胞磷脂代謝調(diào)控過程中，mTORC2發(fā)揮重要功能［24］在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中，mTORC2可以促進心磷脂和鞘脂的生物合成［25］。心磷脂主要位于細胞線粒體中，促進細胞線粒體能量代謝［26］。鞘脂主要參與細胞膜的結(jié)構(gòu)組成，為新生的腫瘤細胞提供原材料［27］。因此，有效抑制mTORC2的活性是肝細胞癌分子靶向治療的潛在靶點［28,29］。

本項研究中，通過代謝組學的技術(shù)方法觀察到抑癌基因NDRG2參與調(diào)控肝細胞癌的磷脂代謝，其調(diào)控磷脂代謝的具體分子機制是什么？其是否影響mTORC2的活性以及如何調(diào)控mTORC2的活性都值得進一步分析和探討。同時，也有研究報道：NDRG2的表達產(chǎn)物可以和PTEN相互作用，從而促進PTEN磷脂酰肌醇磷酸酶的活性，抑制PI3K/Akt信號途徑［30］。那么，NDRG2對肝細胞癌磷脂代謝的調(diào)控是否依賴于PI3K/Akt/mTOR信號途徑也值得進一步研究。

綜上所述，本項研究通過生物信息學分析顯示腫瘤抑制基因NDRG2在肝細胞癌中具有重要的生物學功能，是肝癌顯著的獨立預(yù)后指標。通過代謝組學和酶聯(lián)免疫分析證實其參與調(diào)控肝細胞癌磷脂代謝重編程。該研究不僅為肝細胞癌磷脂代謝重編程的分子機制研究提供潛在靶點，而且為肝細胞癌的分子靶向治療提供新的思路。