人工疏果對‘愛媛28’橘橙果實糖酸含量及代謝基因表達的影響

宋江濤，諶丹丹，公旭晨，商祥明，李春龍，蔡永喜，岳建平，王帥玲，張卜芬，謝宗周，劉繼紅

人工疏果對‘愛媛28’橘橙果實糖酸含量及代謝基因表達的影響

宋江濤1，諶丹丹2，公旭晨1，商祥明1，李春龍1，蔡永喜3，岳建平3，王帥玲3，張卜芬3，謝宗周1，劉繼紅1

1華中農(nóng)業(yè)大學/園藝植物學教育部重點實驗室，武漢 430070；2宜昌市農(nóng)業(yè)科學研究院，湖北宜昌 443000；3湖北省宜都市果茶服務推廣中心，湖北宜都 443300

【背景】‘愛媛28’橘橙是雜交柑橘品種（′），因其優(yōu)良的果實品質(zhì)，受到人們的青睞。疏果是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中常用的一種提高果實品質(zhì)的技術，不僅能使果實體積明顯增大，而且還能夠增加果實可溶性固形物含量。但是，疏果增加果實可溶性固形物含量的具體機制仍然不清楚。【目的】本研究以枳（）為基砧、椪柑（）為中間砧的4年生‘愛媛28’橘橙作為試驗材料，探索疏果影響果實糖酸含量變化的具體機制。【方法】在‘愛媛28’果實幼果期進行疏果，每隔半個月左右測定疏果果實與未疏果果實的橫縱莖，采樣并測量單果重與糖酸含量，選擇糖酸含量差異明顯的時期測定糖酸代謝相關酶的活性及其對應編碼基因的相對表達量?！窘Y果】疏果顯著增加‘愛媛28’果實在生長中后期的橫縱莖和單果重，顯著加快果實檸檬酸含量的降解速度，但并未影響果實成熟時最終的檸檬酸含量；顯著增加了果實的葡萄糖和蔗糖含量，但對果糖含量沒有顯著影響。疏果顯著增強蔗糖代謝過程中的蔗糖合成酶SSⅡ（合成方向）、蔗糖合成酶SSⅠ（分解方向）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和檸檬酸分解代謝過程中的胞質(zhì)順烏頭酸酶（Cyt-ACO）、胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDH）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性。疏果顯著促進蔗糖代謝過程中在早期的相對表達量和在所有時期的相對表達量，以及檸檬酸分解代謝過程中、、、和在早中期的相對表達量?！窘Y論】人工疏果主要通過增強蔗糖合成代謝過程中蔗糖磷酸合成酶的酶活來促進果實可溶性糖的積累，提高檸檬酸分解代謝過程中相關酶的活性和基因表達水平，加快檸檬酸降解，從而在提升果實品質(zhì)中發(fā)揮重要作用。

疏果；‘愛媛28’；果實品質(zhì)；蔗糖代謝；檸檬酸代謝

0 引言

【研究意義】柑橘是世界第一大栽培果樹，同時也是僅次于小麥和玉米之后的世界第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品，其種植面積和產(chǎn)量均位于第一位[1]。柑橘果實不僅擁有極其豐富的營養(yǎng)元素，包括可溶性糖、有機酸、Vc、礦物質(zhì)等，還擁有化痰止咳、消腫止疼、健胃疏肝等多種保健療效的功能[2]。伴隨民眾生活條件的改善，對飲食品質(zhì)的要求也不斷提升，但是由于市場內(nèi)柑橘果實的品質(zhì)參差不齊，難以滿足人們對高品質(zhì)的需要，再加上化肥農(nóng)藥的過量使用，進一步降低了果實品質(zhì)，因此亟需改善柑橘的果實品質(zhì)。提高果實品質(zhì)的技術較多，疏果是其中常用的一種?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，疏果可以提高果實品質(zhì)，增加果樹產(chǎn)量[3-5]。在形成柑橘果實品質(zhì)的眾多因子中，糖酸含量是決定性因素[6]。柑橘果肉汁胞內(nèi)決定甜度的糖大多數(shù)是葡萄糖、果糖和蔗糖，前兩者為單糖，后者為雙糖，如果把蔗糖的糖度值定義為1，那么果糖為1.75，而葡萄糖則是0.75[7]。參與糖代謝的酶有蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（分解方向SSⅠ和合成方向SSⅡ）、酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（NI）。SS既能夠參與蔗糖的合成過程，也能夠參與蔗糖的分解過程，兩過程互為可逆反應[8]。劉翔宇等[9]發(fā)現(xiàn)以枳殼作為砧木的砂糖橘果肉中表達量顯著增加，蔗糖合成酶（合成方向）活性顯著更高，蔗糖含量也更高。SPS主要存在于胞漿中，參與蔗糖的合成代謝，其催化效率和含量決定了植物將同化物轉(zhuǎn)化為蔗糖的能力和最終蔗糖的含量[10]。魏清江等[11]推測與金柑果實中蔗糖含量的上升有密切的聯(lián)系。參與酸代謝的酶有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、檸檬酸合成酶（CS）、順烏頭酸酶（ACO）、NADP-異檸檬酸脫氫酶（NADP-IDH）、ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫羧酶（GAD）等。在線粒體內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）與二氧化碳和水分子結合后在PEPC的作用下轉(zhuǎn)化成草酰乙酸（OAA）與磷酸基團，之后OAA和乙酰輔酶A（Ac-CoA）通過CS轉(zhuǎn)化為檸檬酸[12]。果實檸檬酸降解能夠憑借多種途徑，如乙酰輔酶A途徑或者稱ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）途徑、谷氨酰胺合成酶（GS）途徑以及-氨基丁酸（GABA）途徑等。Guo等[13]發(fā)現(xiàn)‘紐荷爾’臍橙果實中檸檬酸的含量與Cyt-ACO活性的相關性為-0.9224，說明Cyt-ACO參與了柑橘果實檸檬酸的降解。Li等[14]發(fā)現(xiàn)CitNAC62和CitWRKY1能夠通過調(diào)節(jié)的表達來影響檸檬酸的積累。Feng等[15]發(fā)現(xiàn)楊梅果實發(fā)育過程中，檸檬酸含量逐漸降低，而和的表達量則逐漸上升，表明和可能在檸檬酸降解過程中發(fā)揮重要作用。Li等[16]發(fā)現(xiàn)在椪柑和溫州蜜柑果實發(fā)育過程中，隨著檸檬酸含量的逐漸降低，的表達水平逐漸增加，表明可能是檸檬酸降解的一個靶基因?！颈狙芯壳腥朦c】柑橘是湖北省進行商業(yè)化栽培的第一大水果，栽培面積與總產(chǎn)量都位于全省所有種植水果的第一位。據(jù)統(tǒng)計，2017年湖北省柑橘種植總面積達到21.8萬hm2，總產(chǎn)量約為466萬t，總產(chǎn)值約130億元，栽培面積位于全國第6位，總產(chǎn)量名列全國第3位[17]。宜都市是湖北省的主要柑橘產(chǎn)區(qū)之一。湖北省宜都市位于亞熱帶季風性氣候區(qū)，年均溫度高于15℃，10℃及以上的年活動積溫超過5 300℃，霜期不到100 d，年平均日照時數(shù)超過1 600 h，非常適合寬皮柑橘的栽培種植[18]?！異坻?8’橘橙（′）是日本學者于1990年以‘天草’為父本、‘南香’為母本，經(jīng)過雜交育種選育的一個橘橙類雜柑品種，后來被我國引入栽培。其果實成熟時果面呈現(xiàn)出美麗的深紅色，所以又被人們稱作‘紅美人’。因其優(yōu)良的品質(zhì)，受到人們的喜歡，在長江三角洲水果市場上的銷售價格曾高達40—60元/kg，經(jīng)濟效益十分可觀[19]。近年來，‘愛媛28’在湖北省宜都市作為優(yōu)良新品種進行栽培。但‘愛媛28’結果量大，在正常栽培條件下，每株樹結果多，導致果實較小，影響其商品性能?！異坻?8’易成花，且坐果率較高，為了避免果實品質(zhì)的降低，需要進行合理的疏花疏果[20]。因此，研發(fā)應用‘愛媛28’大果栽培技術，是生產(chǎn)上提升果品質(zhì)量的迫切需求。【擬解決的關鍵問題】通過研究疏果對‘愛媛28’柑橘果實糖酸含量、糖酸代謝相關酶活性以及對應編碼基因表達水平的影響，探索‘愛媛28’品質(zhì)提高的技術，并解析其可能機制，為生產(chǎn)上采用疏果調(diào)控雜柑果實品質(zhì)提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試材與取樣

試驗于2020年在湖北省宜昌市宜都市漁洋河生態(tài)家庭農(nóng)場進行。果樹露天栽培，果園管理水平中等。試驗材料為4年生的‘愛媛28’高接植株，基砧為枳，‘鄂柑一號’椪柑為中間砧。選擇生長狀況相似的健康樹6株，其中3株于7月20號（第二次生理落果結束后）進行疏果，另外3株不疏果作為對照（每株為1次重復，共3個重復）。疏果時，主要疏除病果、小果、朝天果等，密集果三去二，留下生長良好的果實，同一枝條上保持果距在15 cm左右，使最終葉果比達到45﹕1（對照約為30﹕1）。每株樹在東、西、南、北、中不同方向分別選擇3個果實，總共15個果實掛牌標記。分別于7月20日、8月3日、8月17日、9月1日、9月14日、9月31日、10月16日、11月3日（對應盛花期后87、101、115、130、143、159、175和193 d）測量掛牌果實的縱橫徑。同時，在每個時間點，每株樹采6個果實帶回實驗室拍照，并測量果實單果重（除去盛花期后87 d）。每果用刀切成兩半后，呈三角取三瓣的汁胞于液氮中研磨成細粉于-80℃留樣保存，用于測量可溶性糖和檸檬酸含量及分析糖酸代謝相關酶活性和基因表達量。

1.2 果實品質(zhì)的測定

使用數(shù)顯游標卡尺測量果實大??；使用百分之一電子天平稱量果實重量。

1.3 果實糖酸含量測定

葡萄糖：稱取約0.1 g組織，加入1 mL蒸餾水，研磨成勻漿，95℃水浴10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8 000×，25℃離心10 min，取上清液備用。

果糖、蔗糖：稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液，研磨成勻漿，80℃水浴10 min（蓋緊，防止水分散失），振蕩3—5次，冷卻后4 000×，25℃離心10 min，取上清；加入約2 mg活性炭，80℃脫色30 min（蓋緊，以防止水分散失）；再加入1 mL提取液，4 000×，25℃離心10 min，取上清液測定。

檸檬酸：稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿。11 000×，4℃離心10 min，取上清液置冰上待測。

分光光度法測定，試劑盒來自蘇州科銘生物技術有限公司，詳細操作見說明書，每個樣本3次重復。

1.4 果實酶活性測定

分光光度法測定，試劑盒來自蘇州科銘生物技術有限公司，選擇盛花期后101、130、159和193 d四個時期的樣本測定可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（S-AI）、蔗糖合成酶（合成方向SSⅡ和分解方向SSⅠ）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、檸檬酸合成酶（CS）、胞質(zhì)順烏頭酸酶（Cyt-ACO）、胞質(zhì)異檸檬酸脫氫酶（ICDH）、ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）、谷氨酸脫羧酶（GAD）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，操作見說明書，每個樣本3次重復。

1.5 總RNA提取及熒光定量PCR

用PLANT pure植物總RNA快速提取試劑盒（TaKaRa公司）提取植物總RNA。利用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后使用Nanodrop 1000紫外分光光度計（Thermo Scientific）測定濃度，稀釋到200 ng·μL-1后用于基因表達分析。利用諾唯贊qPCR試劑盒和Applied Biosystems Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System（ABI，USA）進行熒光定量PCR。反應體系共10 μL，反應程序為95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，60℃延伸15 s，40個循環(huán)[21]。蔗糖代謝相關基因的qPCR引物見表1。檸檬酸代謝相關基因的qPCR引物參考Guo等[22]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2019軟件對試驗結果進行整理分析，并繪制圖表，并用SPSS 16.0進行差異顯著性及相關性分析。

表1 實時定量PCR引物

2 結果

2.1 疏果對‘愛媛28’果實品質(zhì)的影響

果實的大小會隨著細胞的分裂分化而逐漸增大。如圖1所示，隨著果實的發(fā)育，‘愛媛28’果實的縱橫徑和單果重都逐漸上升；且花后159 d，疏果的果實縱橫徑和單果重顯著大于對照，與對照相比，疏果組的橫徑、縱徑和單果重分別增加了5.97%、13.45%和16.61%。果實在159 d轉(zhuǎn)黃，在193 d變?yōu)榧t色。

2.2 疏果對‘愛媛28’果實糖酸含量的影響

果實可溶性糖含量和組成與甜度密切相關，是柑橘果實品質(zhì)的決定因素之一，會隨著果實的發(fā)育成熟而逐漸上升。根據(jù)圖2，隨著果實的發(fā)育，可溶性糖含量總體呈上升的趨勢。在‘愛媛28’果實成熟期，蔗糖含量最高。其中，疏果果實的蔗糖含量在101、130、175和193 d顯著高于對照，而159 d顯著低于對照；疏果果實的葡萄糖含量在101、130、159和193 d顯著高于對照。兩處理間果糖含量無顯著差異。除了可溶性糖，果實有機酸也是決定果實品質(zhì)的關鍵因素之一。檸檬酸是柑橘果實含量最多的有機酸。柑橘果實有機酸含量的變化主要與檸檬酸含量的變化有關。本試驗發(fā)現(xiàn)，果實檸檬酸含量隨果實發(fā)育而逐漸下降，且疏果果實的檸檬酸含量顯著低于對照，但在成熟期沒有顯著差異（圖2-D）。因糖、酸含量主要在花后101、130、159和193 d存在顯著差異，所以選擇這4個時期的果實進行酶活性測定和基因表達分析。

圖2 疏果對果實蔗糖（A）、葡萄糖（B）、果糖（C）和檸檬酸（D）含量的影響

2.3 疏果對‘愛媛28’果實蔗糖代謝相關酶的影響

果實可溶性糖含量與蔗糖代謝過程密切相關。參與蔗糖代謝的酶主要有轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶。轉(zhuǎn)化酶S-AI參與了蔗糖的分解，活性在130 d達到最高，隨后迅速下降，在成熟期略有上升，且所有時期均無顯著差異。蔗糖合成酶有合成（SSⅡ）和分解（SSⅠ）兩種，兩者互為可逆反應。結果表明，SSⅠ和SSⅡ活性都隨著果實的發(fā)育逐漸上升，但成熟期SSⅠ活性下降，且疏果顯著增強二者的活性。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的關鍵酶，活性也隨著果實發(fā)育逐漸升高，且疏果顯著增強SPS活性（圖3）。

圖3 疏果對果實S-AI（A）、SS I（B）、SS II（C）和SPS（D）活性的影響

2.4 疏果對‘愛媛28’果實檸檬酸代謝相關酶的影響

檸檬酸代謝過程分為合成和分解兩個部分。合成過程發(fā)生在線粒體中，分解過程于細胞質(zhì)中完成。合成過程中，隨著果實的發(fā)育，PEPC的活性逐漸降低，且兩處理間無顯著差異（圖4-A），CS活性逐漸降低，且除了在130 d疏果組的活性顯著低于對照外，其他時期兩處理間無顯著差異（圖4-B）。分解過程中，ICDH的活性隨果實的發(fā)育逐漸上升，但在成熟期有所下降，且疏果顯著增強ICDH活性（圖4-C）。Cyt-ACO的活性也逐漸上升，并且疏果的果實在果實膨大期活性顯著高于對照（圖4-D）。GAD和ACL的活性均隨果實的發(fā)育而逐漸降低，并且兩處理間無顯著性差異（圖4-E和4-G）。GS的活性于130 d降至最低，而后逐漸上升，且在130 d后，疏果的果實活性顯著高于對照（圖4-F）。

2.5 疏果對‘愛媛28’果實蔗糖代謝相關基因表達的影響

在4個蔗糖合成酶基因中，疏果顯著促進在130 d的表達量，增強在101 d和130 d的表達量，誘導在130 d的表達量，但降低在101 d與159 d的表達量，對的表達量無顯著影響。蔗糖磷酸合成酶基因中，的表達量均隨果實的發(fā)育而逐漸上升，且疏果顯著促進的表達量。轉(zhuǎn)化酶基因中，疏果組液泡轉(zhuǎn)化酶基因的表達量在159 d最低，且與對照無顯著差異，但顯著誘導其他時期的表達。胞漿轉(zhuǎn)化酶基因的表達量無顯著變化（圖5）。

圖4 疏果對果實PEPC（A）、CS（B）、ICDH（C）、Cyt-ACO（D）、ACL（E）、GS（F）和GAD（G）活性的影響

2.6 疏果對‘愛媛28’果實檸檬酸合成相關基因表達的影響

在檸檬酸合成相關基因中，疏果并未影響的表達量，但顯著增加和在101 d和130 d的表達量。的表達量在101 d時顯著低于對照，在130 d顯著高于對照；的表達量在101 d和193 d顯著低于對照，而在130 d時顯著高于對照（圖6）。

2.7 疏果對‘愛媛28’果實檸檬酸降解相關基因表達的影響

檸檬酸分解基因中，疏果不影響的表達水平，但顯著增加在130 d和在101 d的表達量，顯著降低在101 d和在193 d的表達量。的表達量隨果實發(fā)育逐漸升高，且在101 d疏果組的表達量顯著高于對照；疏果顯著增加在130 d的表達量，但顯著降低其在101 d的表達量；疏果不影響的表達量。ATP-檸檬酸裂解酶基因中，疏果顯著增加在130 d和159 d的表達量；疏果組的表達量在101 d顯著低于對照，而在130 d顯著高于對照；的表達量漸漸提高，且130 d和159 d疏果組的表達量顯著高于對照。谷氨酰胺合成酶基因中，疏果顯著增加在101 d和130 d的表達量。谷氨酸脫羧酶基因中，疏果顯著增加在101 d和130 d的表達量；的表達量隨果實發(fā)育逐漸升高，且所有時期疏果組的表達量顯著低于對照（圖7）。

圖5 疏果對果實蔗糖代謝相關基因SSs、SPSs和VINV表達的影響

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圖6 疏果對果實檸檬酸合成相關基因和表達的影響

Fig. 6 Effects of fruit thinning on the expression ofandrelated to citric acid synthesis

2.8 相關性分析

糖代謝中，對照組蔗糖含量與S-AI、SPS、SS I和SS II的活性都呈正相關，但均未表現(xiàn)出顯著的相關性；疏果后蔗糖含量與SPS的活性表現(xiàn)出極顯著的正相關性，與SS II的活性表現(xiàn)出顯著正相關，與SS I的活性并未表現(xiàn)出相關性。酸代謝中，對照組檸檬酸含量與CS、ACL、GAD和PEPC的活性都呈正相關，與GS無相關性，與ACO和NADP-IDH的活性表現(xiàn)出負相關，且其中只有ACL的活性與檸檬酸含量存在極顯著相關性；疏果顯著增加了檸檬酸含量與ACO活性的相關性，但顯著降低了與ACL活性的相關性，且與GS的活性呈負相關（表2）。

糖代謝基因中，蔗糖含量與對照組、和呈正相關，且均無顯著相關性，與無相關性；疏果增加了蔗糖含量與、和的相關性，且其中與達到顯著正相關。檸檬酸合成基因中，檸檬酸含量與對照組呈正相關，而與和呈負相關，但均未表現(xiàn)出顯著的相關性；檸檬酸分解基因中，檸檬酸水平與呈正相關，與、、、和均呈負相關，但其中只有表現(xiàn)出極顯著負相關。疏果后，檸檬酸含量與無相關性，而與的相關性增加，且與呈現(xiàn)出顯著的負相關，與表現(xiàn)出正相關，且與的相關性顯著降低，但和表現(xiàn)出極顯著負相關（表3）。

圖7 疏果對果實檸檬酸降解相關基因ACOs、NADP-IDHs、ACLs、GSs和GADs表達的影響

表2 疏果對蔗糖和檸檬酸含量與其對應代謝相關酶相關系數(shù)的影響

*和**分別表示顯著相關和極顯著相關。下同

*: Correlation is significant at 0.05 level; **: Correlation is significant at 0.01 level. The same as below

3 討論

3.1 疏果顯著提高果實大小和可溶性糖含量

疏果通過降低營養(yǎng)競爭來促進果實的膨大。與吳黎明等[23]結果一致，本研究發(fā)現(xiàn)疏果顯著增加柑橘果實縱橫徑和單果重。糖酸含量是影響柑橘果實內(nèi)在品質(zhì)和風味的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實的發(fā)育，可溶性糖含量總體呈上升趨勢，并且成熟期時蔗糖含量最高，但低于果糖和葡萄糖含量之和，這與林媚和吳韶輝[24]的研究結果一致，說明‘愛媛28’主要積累還原糖。此外，疏果顯著增加蔗糖和葡萄糖含量，這與秦偉等[25]發(fā)現(xiàn)重度疏果的‘紅富士’蘋果糖含量在成熟期均高于對照的結果相一致，說明疏果確實能促進柑橘果實可溶性糖含量的積累。此外，隨著果實的發(fā)育，檸檬酸含量逐漸減少，這與Li等[26]發(fā)現(xiàn)柑橘果實檸檬酸含量先上升后減少的變化不完全一致，可能原因是第一次采樣前檸檬酸含量就已經(jīng)到達最高值或者最高值處于第一、二次采樣之間。并且，疏果雖然顯著加快了檸檬酸的減少速度，但成熟期的含量與對照相比無顯著差異，說明疏果只影響檸檬酸含量的減少速度，但不影響其最終的含量，這與吳黎明等[23]發(fā)現(xiàn)疏果不影響桃葉橙果實酸含量的結果一致。

表3 疏果對蔗糖和檸檬酸含量與其對應代謝相關基因相關系數(shù)的影響

3.2 疏果調(diào)控果實蔗糖代謝

果實糖代謝需要一些酶的參與，如INV、SS和SPS等。INV可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖與葡萄糖。本研究發(fā)現(xiàn)，S-AI的活性在130 d達到最高，表明其主要在果實膨大期發(fā)揮作用。但疏果并未影響其活性，說明其不是造成疏果果實葡萄糖含量顯著增加的原因。對的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢與其活性相似，且疏果顯著增加其表達量，這與龔榮高和張光倫[27]發(fā)現(xiàn)酸性轉(zhuǎn)化酶不是蔗糖積累關鍵原因的結論一致。除了轉(zhuǎn)化酶外，SS也擁有分解蔗糖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實的發(fā)育，SS I的活性逐漸升高，且疏果顯著增強其活性，這可能是疏果的果實葡萄糖含量顯著高于對照的原因。SS II的活性也隨著果實的發(fā)育而逐漸上升，并且疏果顯著增加其活性以及與蔗糖含量的相關性，這與Kubo等[28]發(fā)現(xiàn)負載量低溫州蜜柑果實SSⅡ的活性明顯高于對照的結果相一致。分析表達變化，發(fā)現(xiàn)疏果顯著增強果實膨大期的表達量，且其與蔗糖的相關系數(shù)達到0.943，說明可能參與了蔗糖的積累。SPS與蔗糖的生成有關，其活性越強，蔗糖含量往往也越高。本研究中，隨果實的發(fā)育，SPS的活性漸漸上升，蔗糖含量也逐漸升高，并且疏果顯著增強其活性，這與疏果的果實蔗糖含量顯著高于對照相一致。疏果顯著提高的表達量，說明疏果通過促進的表達來增強其活性，從而利于蔗糖的積累。

3.3 疏果調(diào)控果實檸檬酸代謝

果實檸檬酸是由PEPC和CS在線粒體內(nèi)催化合成而來。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實的發(fā)育，PEPC的活性逐漸降低，這與檸檬酸的變化趨勢相一致，說明PEPC的活性與檸檬酸的含量相關，這與張長明[29]的結果一致。但是疏果并未影響其活性。分析其編碼基因，發(fā)現(xiàn)疏果顯著增加了在果實膨大期的表達量，這與疏果果實檸檬酸含量顯著低于對照的結果不相符，說明PEPC不是果實檸檬酸積累的關鍵酶，這與文濤等[30]的結果一致。疏果對CS活性影響不大，在130 d時對照酶活顯著高于對照，但和表達量則表現(xiàn)出相反趨勢，可能和并不是決定CS活性的關鍵基因，并且和與檸檬酸含量表現(xiàn)出負相關性（表3），這與其參與檸檬酸的合成相矛盾，說明CS不是果實檸檬酸積累的關鍵酶。

隨著檸檬酸含量的下降，Cyt-ACO的活性逐漸升高，說明Cyt-ACO與檸檬酸的降解相關，這與Guo等[13]的發(fā)現(xiàn)一致。且疏果顯著提高了其活性，這與疏果的果實TA和檸檬酸含量顯著低于對照相一致。對其基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)疏果顯著增加了在果實膨大期的表達量，其中的表達趨勢與其活性變化幾乎一致，且與檸檬酸含量的負相關性最高，說明主要是在檸檬酸降解中起著重要作用。此外，ICDH的活性與檸檬酸的相關性達到-0.860，說明其參與了檸檬酸的降解，且疏果顯著增加了其活性。疏果也增強了在果實膨大期的表達，說明疏果通過促進的表達來提高其活性，從而加快檸檬酸的降解。進一步分析檸檬酸降解途徑發(fā)現(xiàn)，疏果對乙酰輔酶A途徑的ACL活性沒有顯著影響，但顯著增加的表達；疏果也未影響-氨基丁酸途徑的GAD活性，但顯著促進的表達，降低的表達；疏果顯著增加了谷氨酰胺途徑中的GS的活性，且顯著促進的表達，說明疏果通過影響谷氨酰胺途徑來影響檸檬酸的降解，這與Feng等[15]發(fā)現(xiàn)GS可能在檸檬酸降解過程中發(fā)揮重要作用的結果一致。

4 結論

研究結果證明疏果能夠有效增加‘愛媛28’果實的大小與質(zhì)量，通過增強蔗糖代謝過程中的SS和SPS的活性及檸檬酸代謝過程中的Cyt-ACO、ICDH和GS的活性以及對應編碼基因的表達，從而增加果實可溶性糖含量和加快檸檬酸的降解速度。

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Effects of Artificial Fruit Thinning on Sugar and Acid Content and Expression of Metabolism-Related Genes in Fruit of Beni-Madonna Tangor

SONG JiangTao1, SHEN DanDan2, GONG XuChen1, SHANG XiangMing1, LI ChunLong1, CAI YongXi3, YUE JianPing3, WANG ShuaiLing3, ZHANG PuFen3, XIE ZongZhou1, LIU JiHong1

1Key Laboratory of Horticulture and Botany, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070;2Yichang Academy of Agricultural Sciences, Yichang 443000, Hubei;3Service and Extension Centre of Fruit Trees and Tea in Yidu City, Yidu 443300, Hubei

【Background】Beni-Madonna tangor (′), a hybrid cultivar of citrus, is favored by consumers because of its excellent quality. Fruit thinning is a technique commonly used to improve fruit quality in the process of agricultural production. It can not only significantly increase the fruit volume, but also increase the content of soluble solids in the fruit. However, the specific mechanism of fruit thinning to increase the content of soluble solids in the fruit of Beni-Madonna is still unclear. 【Objective】 In this study, four-year-old Beni-Madonna tangor plants, with trifoliate orange () as a base rootstock and Ponkan as an intermediate stock, were used as experimental materials to explore the specific mechanism of fruit thinning on affecting the change of sugar and acid content in fruit. 【Method】Fruit thinning was carried out at the young fruit stage of Beni-Madonna fruit. The horizontal and vertical stems of fruit thinning and non-fruit thinning were measured every half a month or so. The samples were taken back and the single fruit weight and sugar and acid content were measured. The activities of sugar and acid metabolism related enzymes and the relative expression of their corresponding coding genes were measured when the sugar and acid content were significantly different. 【Result】The fruit thinning significantly increased the horizontal and vertical stems and single fruit weight of Beni-Madonna fruit in the middle and late stages of fruit growth, significantly accelerated the degradation rate of citrate content, but did not affect the final citrate content at fruit maturity, significantly increased the fruit glucose and sucrose content, but had no significant effect on fructose content. The fruit thinning significantly increased the activities of sucrose synthase SSⅡ (synthesis direction), sucrose synthase SSⅠ (decomposition direction), sucrose phosphate synthase (SPS) in sucrose metabolism and cytosolic aconitase (Cyt-ACO), cytoplasmic isocitrate dehydrogenase (ICDH) and glutamine synthetase (GS) implicated in citric acid catabolism. In addition, fruit thinning significantly promoted the early relative expression ofand the relative expression ofs at all stages in the process of sucrose metabolism, and the relative expression of,,,ands in the process of citric acid metabolism in the early and middle stages. 【Conclusion】The artificial fruit thinning mainly promoted the accumulation of soluble sugar in fruit by enhancing the enzyme activity of sucrose phosphate synthase in the process of sucrose anabolism, improved the activity and gene expression level of related enzymes in the process of citric acid catabolism, and accelerated citric acid degradation, thus playing an important role in improving fruit quality.

fruit thinning; Beni-Madonna; fruit quality; sucrose metabolism; citric acid metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.010

2022-02-28；

2022-06-15

國家重點研發(fā)計劃（2019YFD1001402）、湖北省重點研發(fā)計劃（2020BBA036，2022BBA0073）、湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新行動計劃

宋江濤，E-mail：912104398@qq.com。通信作者劉繼紅，E-mail：liujihong@mail.hzau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）