半糯粳稻品種核心標記的篩選及DNA指紋圖譜的構(gòu)建

趙春芳，趙慶勇，呂遠大，陳濤，姚姝，趙凌，周麗慧，梁文化，朱鎮(zhèn)，王才林，張亞東

半糯粳稻品種核心標記的篩選及DNA指紋圖譜的構(gòu)建

趙春芳1，趙慶勇1，呂遠大2，陳濤1，姚姝1，趙凌1，周麗慧1，梁文化1，朱鎮(zhèn)1，王才林1，張亞東1

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/國家耐鹽堿水稻技術創(chuàng)新中心華東中心/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術研究中心，南京 210014；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源與生物技術研究所，南京 210014

【目的】構(gòu)建一套基于水稻重要性狀基因標記的品種DNA指紋鑒定體系，為加強主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種的種質(zhì)管理與品種保護奠定基礎?！痉椒ā恳?4個江浙滬主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種為供試材料，通過已知標記多態(tài)性鑒定、公共數(shù)據(jù)庫基因序列比對、基因組重測序等多種方法對水稻重要性狀調(diào)控基因的關鍵差異位點進行篩選，開發(fā)核心SNP或InDel標記；利用As-PCR技術將SNP標記發(fā)展為依據(jù)電泳條帶鑒別的簡單PCR標記，通過電泳條帶特征化和類型分析獲得基因型信息，構(gòu)建半糯粳稻品種的DNA指紋圖譜庫?！窘Y(jié)果】篩選出來源于40個水稻重要性狀調(diào)控基因的54個核心標記，包括18個SNP標記和36個InDel標記；54個標記在20個品種中共檢測到155個有效特征化條帶，轉(zhuǎn)化為155個0/1數(shù)據(jù)位點，建立各品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，可區(qū)分全部供試品種。遺傳多樣性分析表明，品種間遺傳相似性變異范圍為0.47—0.90，其中，南粳7718與蘇香粳100的相似性系數(shù)最小，而南粳9308與南粳9036的相似性系數(shù)最大，二者存在8個數(shù)據(jù)位點差異。親緣關系分析可將供試品種劃分為6個分支，其中，南粳7718為獨立分支，表明其與其他品種間的親緣關系較遠。核心標記鑒定效果的進一步驗證表明，該套標記可以對14個半糯粳稻新品種進行有效區(qū)分，聚類圖顯示其分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 3個類群，證實各品種間基因型信息的差異性；并利用該套標記鑒定了一個未知半糯水稻的品種真實性，根據(jù)基因型和聚類分析，將其判定為南粳9108?！窘Y(jié)論】經(jīng)優(yōu)化篩選，獲得可準確區(qū)分當前主推半糯粳稻品種的54個核心標記，并發(fā)展為可電泳檢測的簡單PCR標記，利用該套標記組合構(gòu)建了34個江浙滬地區(qū)主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種的DNA指紋圖譜。

水稻；半糯粳稻；DNA指紋圖譜；分子標記

0 引言

【研究意義】近年來，中國南方優(yōu)質(zhì)粳稻育種取得一定進展，培育出一系列低直鏈淀粉含量的優(yōu)良食味粳稻品種，其直鏈淀粉含量介于糯稻與黏稻之間，一般含有低直鏈淀粉含量的等位基因（如Wx、Wx等），也稱為“半糯粳稻品種”[1-2]。典型的代表性品種有：江蘇省的南粳46、南粳9108、寧香粳9號、蘇香粳100等，上海市的滬軟1212、松香粳1018等，浙江省的嘉58、嘉農(nóng)早香等[3-4]。這類半糯粳稻的米飯具有“軟、香、糯、彈”的食味特點，符合長三角地區(qū)人們喜食偏軟米飯的飲食習慣。半糯粳稻品種審定以來，在蘇、滬、浙、皖等省/市得到迅速推廣應用，已成為地產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高檔粳米的核心品種[5]。然而，在稻米產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，種子套牌假冒、稻谷摻雜事件層出不窮，嚴重擾亂種子和稻米市場，影響種業(yè)創(chuàng)新、品牌創(chuàng)建，給種植者和經(jīng)營者帶來經(jīng)濟損失，同時，育種家們發(fā)現(xiàn)品種存在種性退化、食味品質(zhì)下降等問題，進而影響了稻米品質(zhì)和品牌的市場競爭力。因此，構(gòu)建半糯粳稻品種的分子鑒定體系、建立各品種的DNA指紋圖譜具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】DNA指紋圖譜構(gòu)建的關鍵在于獲得核心分子標記并建立相應的檢測標準，國際植物品種權保護聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）在BMT測試指南草案中，將SSR和SNP確定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標記方法[6-7]，其中，SSR標記因具有多態(tài)性好、技術簡便快捷、共顯性等特點，在水稻種質(zhì)資源鑒定、遺傳群體構(gòu)建、基因定位及標記輔助育種等研究領域發(fā)揮了重要作用[8-9]。目前，中國水稻品種的審定監(jiān)管和真?zhèn)舞b定主要依據(jù)行業(yè)標準《NY/T1433-2014 水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法》的48個SSR標記和《NY/T2745-2021 水稻品種真實性鑒定SNP標記法》的96個SNP。兩套標記均是基于測序秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴的序列變異在全基因組范圍內(nèi)進行多態(tài)性篩選而建立，對變異豐富的秈稻品種或遺傳背景差異大的秈粳稻品種具有較高的鑒別能力[10-11]。特別地，農(nóng)作物SNP標記因具有針對性強、變異豐富、數(shù)量巨大等特點[12]，已逐漸取代了傳統(tǒng)SSR標記，目前，在幾乎所有研究物種中都被用作高效的遺傳標記，構(gòu)建了玉米、水稻、茶樹等多種作物的DNA指紋圖譜和分子身份證[13-14]。但是，兩類標記在對省內(nèi)栽培粳稻品種進行鑒別時，效果并不理想[15-16]，表現(xiàn)出較低的基因多樣性指數(shù)[17-19]，表明栽培水稻品種間基因交流頻繁，直接使用公共標記可能難以對其進行準確分子鑒定和指紋圖譜構(gòu)建。【本研究切入點】隨著水稻功能基因組的發(fā)展，水稻品質(zhì)、抗性、高產(chǎn)、株型等重要性狀調(diào)控基因被陸續(xù)克隆和功能研究，性狀關聯(lián)的基因組特定差異位點也得以發(fā)現(xiàn)[20-21]，并開發(fā)了相應PCR標記用于品種基因型檢測[22-23]。但是，迄今為止，將這些特定變異系統(tǒng)地進行多態(tài)性篩選，并應用于近緣栽培水稻品種間分子鑒別上的研究尚少?！緮M解決的關鍵問題】本研究以長江中下游地區(qū)主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種為對象，利用水稻重要農(nóng)藝性狀關聯(lián)的基因特異性SNP和InDel標記，構(gòu)建一套快速、精準的品種DNA指紋鑒定體系，以期為半糯粳稻品種的真實性鑒定和品種種性穩(wěn)定遺傳提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選取34個目前江浙滬地域生產(chǎn)上推廣應用的優(yōu)良食味半糯粳稻品種（電子附表1），其中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所培育的南粳系列粳稻品種16個，江蘇省地區(qū)研究所、南京農(nóng)業(yè)大學、種業(yè)公司等培育的粳稻品種11個，來源于上海市的粳稻品種6個，浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院培育品種1個，D1—D20編號品種用于核心標記的篩選，D21—D34編號品種用于核心標記的驗證。

1.2 DNA提取

所有試驗材料的種子經(jīng)浸種、催芽后，在光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽成苗。采用CTAB法提取每個樣品葉片的基因組總DNA[24]。利用超微量紫外可見分光光度計（Colibri）測定DNA濃度和質(zhì)量，將工作液濃度統(tǒng)一調(diào)整為50 ng·μL-1。

1.3 InDel標記設計與篩選

目前，已有日本晴、9311、蘇御糯、明恢63、桂朝2號等多個水稻品種全基因組數(shù)據(jù)公布（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/和http://rice.plantbiology.msu.edu/），通過對品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性、抽穗期等水稻重要性狀控制基因編碼區(qū)域序列的比對搜索，篩選插入缺失序列，在變異位點兩側(cè)合適位置分別設計InDel引物對。一些淀粉合成酶、稻瘟病抗性等基因的分子標記直接引自相關文獻報道[22-23, 25-28]。合成的InDel標記經(jīng)PCR擴增、PAGE凝膠電泳檢測，以判斷其擴增效果和在供試材料中的多態(tài)性，篩選獲取有效標記。

1.4 重測序和已克隆基因SNP/InDel的篩選

對InDel標記無法區(qū)分的南粳46（D1）、南粳9108（D3）、南粳505（D4）、南粳56（D7）、南粳9308（D8）、南粳9036（D9）、滬早香軟1號（D12）、金香玉1號（D14）等8個品種進行基因組重測序。按照Illumina的操作方法構(gòu)建文庫，再用Illumina HiSeq 2500 platform以平均每個樣本20×測序深度進行重測序，以日本晴為參考基因組對所有Paired-end reads進行定位，并通過質(zhì)量控制，刪除MAF＜5%，位點檢出率＜80%的SNP/InDel，得到196 314個SNP/InDel。根據(jù)變異位點在基因組中的分布位置可分為編碼區(qū)、基因間區(qū)和上下游區(qū)三類，編碼區(qū)變異率僅占15%左右，數(shù)量相對較少。由于待區(qū)分品種主要在抽穗期、株型等表型性狀上存在差異，對這些關鍵性狀的調(diào)控基因進行編碼區(qū)SNP/InDel搜索，篩選獲取功能位點，開發(fā)新的InDel和SNP標記。

1.5 SNP分型的PCR標記設計

當前SNP基因分型方法主要有基于凝膠電泳檢測和高通量自動化分型2類[4]，其中，等位基因特異性PCR（allele specific-PCR，As-PCR）是常用的基于凝膠電泳的SNP分型技術[29]。As-PCR標記通過在引物設計時將SNP堿基安排在引物序列3′末端，根據(jù)PCR擴增電泳條帶的有無，判斷靶序列的變異類型，直接獲得SNP分型結(jié)果。通過下載編碼區(qū)SNP兩側(cè)DNA序列，按照As-PCR標記四引物設計原則，在Tetra-Primer ARMS-PCR網(wǎng)站（http://primer1.soton.ac. uk/primer1.html）獲取各SNP標記的引物序列，經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳檢測四引物標記的效果。

1.6 電泳檢測及條帶特征化

18個SNP標記引物對的擴增產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，核酸染料染色。36個InDel標記引物對的擴增產(chǎn)物根據(jù)特征譜帶的長度及類型選擇不同類型凝膠，差異堿基數(shù)在10 bp以上，采用2.0%瓊脂糖凝膠檢測，差異堿基數(shù)不足10 bp，選擇9.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。將電泳圖上存在個體間差異的條帶記為特征化條帶，所有品種中共有條帶記為非特征化條帶。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳圖上的特征化條帶，將每個品種中同一位置上清晰且可重復出現(xiàn)的條帶記為1，無帶記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。采用SLT_NT-sys_2.10軟件中Similarity程序計算34個半糯粳稻品種的遺傳相似性，以Clustering程序中SHAN進行UPGMA（非加權組平均法）聚類分析，繪制各品種間的親緣關系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 分子標記篩選

在多個水稻品種全基因組數(shù)據(jù)庫中，下載品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性、抽穗期等水稻重要性狀控制基因編碼區(qū)域序列，通過序列比對搜索插入缺失位點，開發(fā)InDel標記，結(jié)合已開發(fā)的粒型、品質(zhì)和抗稻瘟病基因標記[22-23, 25-28]，對20個半糯粳稻品種（D1—D20）進行多態(tài)性檢測，經(jīng)標記優(yōu)化，篩選到29個擴增效果好、多態(tài)性高的InDel標記。根據(jù)29個標記的電泳特征譜帶對半糯品種進行類群劃分，發(fā)現(xiàn)該套標記無法對南粳46、滬早香軟1號、南粳9108、金香玉1號、南粳9036、南粳9308、南粳56、南粳505等8個品種有效地辨別。因而，將這8個品種進行基因組重測序和序列差異位點分析，重點對已克隆水稻重要性狀調(diào)控基因的SNP進行檢索，篩選到來源于17個基因的26個SNP或InDel功能位點。通過將編碼區(qū)SNP轉(zhuǎn)化為As-PCR四引物電泳標記，對半糯品種基因型進行鑒定。以29個InDel標記的品種分類結(jié)果為基準，通過逐步增加新SNP或InDel標記對各類群進行進一步區(qū)分，20個半糯粳稻品種被劃分為更多的類群，直到把各類群分到僅有一個半糯粳稻品種為止，且保證最相似2個半糯粳稻品種間的差異標記數(shù)（差異標記數(shù)是指該標記在二者間擴增的特征化條帶存在差異）占總標記數(shù)的5%以上。最終確定增加18個SNP標記和7個新InDel標記（InDel-1/InDel-2/InDel-9/InDel-10/ InDel-12/InDel- 14/InDel-16），可實現(xiàn)對20個半糯粳稻品種的相互區(qū)分。54個標記（36個InDel標記和18個SNP標記）來源于40個水稻重要性狀調(diào)控基因，標記的引物序列及詳細信息見表1。

2.2 核心標記的擴增效果及條帶特征化

54個標記可以在20個半糯粳稻品種（D1—D20）中均得到良好的擴增效果，通過PCR擴增條帶的凝膠成像，獲得各品種的DNA特征條帶。挑選符合目標產(chǎn)物大小的特征帶型進行凝膠回收、序列分析，以確證條帶正確性。以DNA Marker為對照，將DNA條帶進行有效特征化，并按照SNP-1—SNP-18、InDel-1—InDel-36的順序依次對特征化條帶進行位點編號，圖1和圖2顯示了部分標記的PCR擴增效果和DNA特征化條帶。獲得每個品種特征化信息即身份編號，說明54個標記可以實現(xiàn)對20個半糯粳稻品種的準確辨別。

M：DNA Marker；D1—D20分別對應20個半糯粳稻品種；*：有效特征化位點；×：無效位點

表1 54個標記的引物序列及詳細信息

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.3 DNA指紋圖譜庫構(gòu)建

按照SNP-1—SNP-18、InDel-1—InDel-36順序依次對特征化條帶進行位點編號，共檢測到155個特征化條帶位點，將每個品種中同一位置上清晰且可重復出現(xiàn)的條帶記為1，無帶記為0，獲得20個半糯粳稻品種的DNA特征條帶圖譜庫，建立了各品種包含155個位點的DNA特征指紋數(shù)據(jù)庫（表2）。

2.4 品種間親緣關系分析

根據(jù)54個標記檢測到的155個0/1數(shù)據(jù)矩陣，對20個半糯粳稻品種進行了遺傳多樣性分析。檢測到各半糯粳稻品種間遺傳相似性系數(shù)變異范圍為0.47— 0.90，最小值（0.47）在南粳7718和蘇香粳100間檢測到，表明二者親緣關系最遠。最大值（0.90）在南粳9308和南粳9036間檢測到，二者間8個數(shù)據(jù)位點存在差異，差異位點數(shù)占總位點數(shù)的5.2%（大于相似品種判定的臨界值5.0%）。由UPGMA聚類圖可知（圖3），20個半糯粳稻品種（D1—D20）分別處于不同的分支，表明54個核心標記可以對其進行準確鑒別。以遺傳距離0.34為閾值，34個品種可劃分為4個類群，其中，南粳7718單獨為第Ⅰ類群，表明與其他品種間的親緣關系均較遠，蘇香粳3號、早香粳1號、嘉58等劃分為第Ⅱ類群，南粳5055、南粳505、寧粳8號、徐稻9號等處于第Ⅲ類群，南粳46、滬早香軟1號、南粳9108、金香玉1號等劃分于第Ⅳ類群，同一單位選育品種（如南粳系列品種）未表現(xiàn)出聚集分布。

2.5 核心標記鑒定效果的驗證

為進一步驗證核心標記對其他半糯粳稻品種的區(qū)分效果，選取近年推廣應用的14個半糯粳稻品種（D21—D34），利用54個標記對其進行PCR擴增和凝膠成像。14個品種均可得到良好的擴增效果，其條帶大小均符合20個半糯粳稻品種（D1—D20）的DNA條帶特征。按照SNP-1—SNP-18、InDel-1—InDel-36的順序依次對特征化條帶進行編號，獲得14個半糯粳稻品種（D21—D34）的特征化信息。通過155個特征化條帶的0/1數(shù)據(jù)讀取，分別構(gòu)建了14個品種（D21—D34）的DNA指紋數(shù)據(jù)庫（表3），各品種間及其與D1—D20半糯粳稻品種間均存在多位點差異。從聚類圖中可以看出，14個品種（D21—D34）分布于第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等3個類群中，具有獨立分支（圖3），表明該套核心標記可以實現(xiàn)對市場主推半糯粳稻品種的準確鑒別。

表2 20個半糯粳稻品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫

2.6 品種真實性鑒定的案例分析

待鑒定水稻品種DX為34個品種中的一個疑似品種，以DX品種的葉片DNA為模板，利用54個標記進行PCR擴增、DNA條帶特征化和0/1數(shù)據(jù)矩陣建立，獲得DNA指紋數(shù)據(jù)庫。將該指紋數(shù)據(jù)庫導入已知半糯品種指紋數(shù)據(jù)庫進行聚類分析，得到含有DX品種的35個品種的聚類圖（圖3）。從聚類圖可以看出，DX品種與南粳9108位于相同位置，表明二者遺傳相似性最高。通過DNA指紋數(shù)據(jù)比較，DX與南粳9108存在1個位點差異，占總位點數(shù)的0.65%，遺傳相似度為99.5%。農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NYT1433-2014中將48個SSR標記中≥2個標記差異的品種認為是不同品種，按照標記比率計算約為5%差異；標準NY/T 2745-2021中將差異位點數(shù)≥4（總位點數(shù)為96），作為不同品種的判定標準，按照比例計算約為4.2%；在玉米及其他研究領域中將差異標記百分率5%作為品種真實性檢測結(jié)果的判斷標準[13]；而在國家標準《GB/T 38551-2020 植物品種鑒定-MNP標記法》中將遺傳相似度≥99%的2個品種，判定為相同品種或極近似品種。因此，判定待測水稻品種DX為南粳9108，符合品種真實性的判定標準。

字體加粗的品種（D1—D20）為篩選核心標記所用的20個半糯粳稻品種，其他（D21—34）為14個其他半糯粳稻品種；紅框表示對一個未知半糯粳稻品種DX的真實性鑒定

表3 14個其他半糯粳稻品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫

3 討論

3.1 核心標記的選擇

目前，水稻品種真?zhèn)蔚姆肿予b定較多研究中依據(jù)NYT1433-2014標準中的48個SSR標記[10-11, 30]，但是該套標記在鑒定區(qū)域內(nèi)栽培粳稻品種時的效果較差，表現(xiàn)出多態(tài)水平低、干擾條帶多、區(qū)分能力差等問題。其主要原因可能是生產(chǎn)上主栽粳稻品種往往來源于相同的骨干親本品種或者在同一品種基礎上僅改良少數(shù)甚至單個性狀的派生品種，造成品種間的遺傳差異越來越小。本研究34份水稻品種為江浙滬地區(qū)的主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種，其中，江蘇省品種居多，僅江蘇省農(nóng)業(yè)科學院培育的南粳系列品種有16個，品種間攜帶相同低直鏈淀粉含量基因型[1, 31]。系譜分析表明品種間近親繁殖系數(shù)高，遺傳信息交流頻繁，其中，有些品種是對已有品種某個性狀的定向改良，如南粳9108是在南粳46中選育的早抽穗型自然變異株，金香玉1號是對南粳9108稻瘟病抗性的定向回交選育。本研究也嘗試使用NY/T 2745-2021標準中96個SNP標記，但是，通過位點檢索，多數(shù)SNP位點在半糯粳稻品種中表現(xiàn)無差異。因此，基因組隨機分布的公共SSR標記或SNP標記均不能實現(xiàn)半糯粳稻品種間的分子鑒別。本研究選擇了錨定品種間的差異農(nóng)藝性狀，進行特定性狀調(diào)控基因的序列變異檢索，通過分子標記的多途徑開發(fā)、PCR優(yōu)化和多態(tài)性篩選，最終鑒定到擴增效果良好的18個SNP標記和36個InDel標記，組成54個核心標記。

該套PCR標記來自40個水稻重要性狀控制基因的核心序列，關聯(lián)了品質(zhì)（淀粉合成相關基因、分支酶基因、去分支酶基因）、香味、抗脅迫（抗病、抗脅迫）、株型、粒性等多方位的水稻關鍵性狀。因此，在構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的同時，也銜接了水稻重要性狀的表型特征，并且標記序列主要來自于基因的編碼區(qū)，與基因組其他位置序列同源性低，標記表現(xiàn)出錯配率低、重復性好、穩(wěn)定性高等良好的檢測效果，完全可以滿足區(qū)域內(nèi)水稻品種的真?zhèn)魏图兌辱b定，以及個性化DNA指紋圖譜構(gòu)建的需要。利用該套標記對34個半糯粳稻品種進行基因分型和統(tǒng)計分析，建立了每個品種唯一的基因型，實現(xiàn)了個體間的精準鑒別和區(qū)分，并可對未知品種準確地進行歸類和判定。相比較而言，本研究開發(fā)的54個核心標記（PCR標記）明顯優(yōu)于NYT1433-2014中的48個SSR標記。另外，該套標記操作簡便、使用成本低，特別適用于研究條件一般的實驗室進行小樣本量材料的鑒別。后續(xù)還可結(jié)合高效的SNP分型技術，如KASP、芯片定制、多重PCR等方法，進一步實現(xiàn)樣本的規(guī)?；b定。

3.2 浙江滬主栽半糯粳稻品種間遺傳差異

作物DNA指紋圖譜的作用是區(qū)分不同生物個體，除對品種及其變異具有靈敏的鑒別能力以外，還可以根據(jù)DNA指紋的差異程度進行遺傳聚類分析，掌握不同品種間的親緣關系和遺傳距離，幫助分析品種的特性[32-34]。目前，優(yōu)良食味半糯粳稻品種在長江中下游地區(qū)逐年擴大推廣，近三年僅在江蘇省年種植面積占全省水稻種植面積的1/3以上，并且是地產(chǎn)優(yōu)質(zhì)稻米品牌打造的主力品種。因此，構(gòu)建的DNA指紋圖譜可直接用于指導生產(chǎn)上品種種子和市場上品種品牌稻米的真實性鑒定?；诒狙芯?4個標記檢測到155個多態(tài)性位點，品種間兩兩比較的遺傳相似性系數(shù)為0.47—0.90，其中南粳品種間的相似性系數(shù)較高，如南粳9308和南粳9036、南粳晶谷和南粳3908間的遺傳相似性系數(shù)為0.90和0.88，揭示了南粳品種的遺傳基礎較狹窄，這與它們擁有共同的育種親本材料而直接相關。在DNA指紋圖譜上，這兩對品種間的標記差異位點數(shù)均在8個以上，大于差異率為5%“不同品種”的判定標準，說明本研究開發(fā)的核心標記用于當前長江中下游地區(qū)生產(chǎn)上主栽半糯粳稻品種的真實性鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建是可行的。通過聚類分析，同一單位培育品種未表現(xiàn)出聚集分布，而是與其他單位培育的品種相互聚集，說明不同單位半糯粳稻品種間存在相互基因滲透，這與親本材料的相互借鑒利用直接相關，如處于類群Ⅳ中的滬早香軟、嘉農(nóng)粳6號、蘇香粳100均與南粳系列品種共用親本南粳46或原始親本關東194。值得注意的是，南粳7718為單獨一個類群，表明與其他品種間的親緣關系較遠，即使與親本材料南粳5055（早熟晚粳稻品種）仍有較大遺傳距離，可能與選育過程中偏向選擇早熟型的熟期類型（南粳7718為中熟中粳稻），而導致其遺傳信息偏離；也有可能由另一親本材料較遠源的遺傳關系而引起的。在鑒定一個由公司提供的未知半糯樣品DX時，指紋數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，其與真實品種南粳9108（原種）間仍存在1個位點差異、而非100%相似度，說明品種在公司繁育過程中，可能由于隔離不嚴格、操作不規(guī)范而致使種子發(fā)生混雜或天然雜交串粉；當然，如果是多年種質(zhì)，也可能由于品種自身的分離變異而引起。研究結(jié)果進一步表明，該套鑒定體系可對當前使用的半糯粳稻種子的純度及與原種間的遺傳差異做出預判斷。

本研究結(jié)果還可應用于水稻種質(zhì)資源類群劃分、分子育種及其他相關研究中，為水稻品種管理、種子和稻米市場監(jiān)測、企業(yè)維權等提供檢測技術；同時，為水稻分子育種中通過標記輔助選擇加快優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高抗水稻新品種的選育進程奠定基礎。

4 結(jié)論

篩選出來源于40個水稻重要性狀基因的54個最佳PCR標記（18個SNP標記和36個InDel標記）組合，可精準對34個浙江滬地區(qū)主栽優(yōu)良食味半糯粳稻品種進行區(qū)分。54個標記共檢測到155個有效特征化條帶，組成34個品種的DNA指紋圖譜庫，并生成每個品種的0/1指紋數(shù)據(jù)。

[1] 趙春芳, 岳紅亮, 田錚, 顧明超, 趙凌, 趙慶勇, 朱鎮(zhèn), 陳濤, 周麗慧, 姚姝, 梁文化, 路凱, 張亞東, 王才林. 江蘇和東北粳稻稻米理化特性及和基因序列分析. 作物學報, 2020, 46(6): 75-85.

ZHAO C F, YUE H L, TIAN Z, GU M C, ZHAO L, ZHAO Q Y, ZHU Z, CHEN T, ZHOU L H, YAO S, LIANG W H, LU K, ZHANG Y D, WANG C L. Physicochemical properties and sequence analysis ofandgenes inrice cultivars from Jiangsu province and northeast of China. Acta Agronomica Sinica, 2020, 46(6): 75-85. (in Chinese)

[2] 王才林, 張亞東, 陳濤, 朱鎮(zhèn), 趙慶勇, 姚姝, 趙凌, 趙春芳, 周麗慧, 魏曉東, 路凱, 梁文化. 姊妹系間雜交快速培育優(yōu)良食味半糯粳稻新品種的育種效果. 中國水稻科學, 2021, 35(5): 455-465.

WANG C L, ZHANG Y D, CHEN T, ZHU Z, ZHAO Q Y, YAO S, ZHAO L, ZHAO C F, ZHOU L H, WEI X D, LU K, LIANG W H. Rapid breeding of new semi-glutinousrice varieties with good eating quality by crossing between sister lines. Chinese Journal of Rice Science, 2021, 35(5): 455-465. (in Chinese)

[3] 王才林, 張亞東, 朱鎮(zhèn), 趙凌, 陳濤, 林靜. 優(yōu)質(zhì)水稻新品種南粳46的選育與應用. 中國稻米, 2008(3): 38-40.

Wang c l, zhang y d, zhu z, zhao l, chen t, lin j. Breeding and application of a new high quality rice variety Nanjing 46. China Rice, 2008(3): 38-40. (in Chinese)

[4] 張麗霞, 費劍華, 周鋒利, 王凱, 胡澤軍, 曹黎明, 閆影, 吳書俊. 優(yōu)良食味粳稻新品種‘滬軟1212’的選育及其品質(zhì)特性. 分子植物育種, 2021, 19(13): 4443-4448.

ZHANG L X, FEI J H, ZHOU F L, WANG K, HU Z J, CAO L M, YAN Y, WU S J. Breeding and quality characteristics of a new high eating qualityrice variety ‘Huruan1212’. Molecular Plant Breeding, 2021, 9(13): 4443-4448. (in Chinese)

[5] 王才林, 張亞東, 趙春芳, 魏曉東, 姚姝, 周麗慧, 朱鎮(zhèn), 陳濤, 趙慶勇, 趙凌. 江蘇省優(yōu)良食味粳稻的遺傳與育種研究. 遺傳, 2021, 43(5): 442-458.

WANG C L, ZHANG Y D, ZHAO C F, WEI X D, YAO S, ZHOU L H, ZHU Z, CHEN T, ZHAO Q Y, ZHAO L. Inheritance and breeding ofrice with good eating quality in Jiangsu province. Hereditas, 2021, 43(5): 442-458. (in Chinese)

[6] 徐云碧, 王冰冰, 張健, 張嘉楠, 李建生. 應用分子標記技術改進作物品種保護和監(jiān)管. 作物學報, 2022, 48(8): 1853-1870.

XU Y B, WANG B B, ZHANG J, ZHANG J N, LI J S. Enhancement of plant variety protection and regulation using molecular marker technology. Acta Agronomica Sinica, 2022, 48(8): 1853-1870. (in Chinese)

[7] 滕海濤, 呂波, 趙久然, 徐巖, 王鳳格, 堵苑苑, 楊坤, 唐浩, 李祥羽. 利用DNA指紋圖譜輔助植物新品種保護的可能性. 生物技術通報, 2009(1): 1-6.

TENG H T, Lü B, ZHAO J R, XU Y, WANG F G, DU Y Y, YANG K, TANG H, LI X Y. DNA fingerprint profile involved in plant variety protection practice. Biotechnology Bulletin, 2009(1): 1-6. (in Chinese)

[8] 李茂柏, 王慧, 白建江, 樸鐘澤. 利用SSR分子標記構(gòu)建水稻品種DNA指紋圖譜的研究進展. 中國稻米, 2011, 17(1): 4-6.

LI M B, WANG H, BAI J J, PIAO Z Z. Research progress in constructing DNA fingerprints of rice varieties using SSR molecular markers. China Rice, 2011, 17(1): 4-6. (in Chinese)

[9] 楊夢婷, 黃洲, 干建平, 徐君馳, 龐基良. SSR分子標記的研究進展. 杭州師范大學學報(自然科學版), 2019, 18(4): 429-435.

YANG M T, HUANG Z, GAN J P, XU J C, PANG J L. Research progress of SSR molecular markers. Journal of Hangzhou Normal University (Natural Science Edition), 2019, 18(4): 429-435. (in Chinese)

[10] 李梓榕, 袁雄, 陳葉, 鄭興飛, 胡中立, 李蘭芝. 基于全基因組SNP高效鑒定水稻種質(zhì)資源并構(gòu)建指紋圖譜. 分子植物育種, 2020, 18(18): 6050-6057.

LI Z R, YUAN X, CHEN Y, ZHENG X F, HU Z L, LI L Z. Effective identification for varieties by genome-wide SNPs and establishment of fingerprint for rice germplasm. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(18): 6050-6057. (in Chinese)

[11] 鄭向華, 葉俊華, 程朝平, 魏興華, 葉新福, 楊窯龍. 利用SNP標記進行水稻品種秈粳鑒定. 作物學報, 2022, 48(2): 342-352.

ZHENG X H, YE J H, CHENG Z P, WEI X H, YE X F, YANG Y L.identification by SNP markers inL.. Acta Agronomica Sinica, 2022, 48(2): 342-352. (in Chinese)

[12] 王富強, 樊秀彩, 張穎, 劉崇懷, 姜建福. SNP分子標記在作物品種鑒定中的應用和展望. 植物遺傳資源學報, 2020, 21(5): 1308-1320.

WANG F Q, FAN X C, ZHANG Y, LIU C H, JIANG J F. Application and prospect of SNP molecular markers in crop variety identification. Journal of Plant Genetic Resources, 2020, 21(5): 1308-1320. (in Chinese)

[13] 田紅麗, 楊揚, 王璐, 王蕊, 易紅梅, 許理文, 張云龍, 葛建镕, 王鳳格, 趙久然. 兼容型maizeSNP384標記篩選與玉米雜交種DNA指紋圖譜構(gòu)建. 作物學報, 2020, 46(7): 1006-1015.

TIAN H L, YANG Y, WANG L, WANG R, YI H M, XU L W, ZHANG Y L, GE J R, WANG F G, ZHAO J R. Screening of compatible maizeSNP384 markers and the construction of DNA fingerprints of maize varieties. Acta Agronomica Sinica, 2020, 46(7): 1006-1015. (in Chinese)

[14] 樊曉靜, 于文濤, 蔡春平, 林浥, 王澤涵, 房婉萍, 張見明, 葉乃興. 利用SNP標記構(gòu)建茶樹品種資源分子身份證. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2021, 54(8): 1751-1760.

FAN X J, YU W T, CAI C P, LIN Y, WANG Z H, FANG W P, ZHANG J M, YE N X. Construction of Molecular ID for Tea Cultivars by Using of Single nucleotide Polymorphism (SNP) Markers. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(8): 1751-1760. (in Chinese)

[15] 朱勇良, 謝裕林, 黃凌哲, 吳建祥, 喬中英, 王建平, 黃萌, 陳培峰. 太湖稻區(qū)及國內(nèi)部分香稻SSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性初析. 植物遺傳資源學報, 2012, 13(4): 666-671.

ZHU Y L, XIE Y L, HUANG L Z, WU J X, QIAO Z Y, WANG J P, HUANG M, CHEN P F. Establishment of SSR fingerprint map and preliminary analysis of genetic diversity among aromatic rice from Taihu and other areas in China. Journal of Plant Genetic Resources, 2012, 13(4): 666-671. (in Chinese)

[16] LI Z J, CHEN Y H, ZHANG D J, ZHANG G F, LU B X. Genetic diversity analysis and DNA fingerprinting of the main japonica rice varieties in Heilongjiang province. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, 2018, 11(1): 23-29.

[17] 左示敏, 周娜娜, 陳宗祥, 許明, 許學宏, 毛從亞, 湯義華, 張亞芳, 葉凱, 顧世梁, 潘學彪. SSR標記在江蘇粳稻品種鑒定中的應用研究. 揚州大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版), 2014, 35(4): 46-51.

ZUO S M, ZHOU N N, CHEN Z X, XU M, XU X H, MAO C Y, TANG Y H, ZHANG Y F, YE K, GU S L, PAN X B. Identification ofrice varieties released in Jiangsu province by SSR markers. Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 2014, 35(4): 46-51. (in Chinese)

[18] 龔紅兵, 余波, 盛生蘭, 潘學彪, 曾生元, 李闖, 左世敏, 景德道, 林添資, 陳宗祥. 江蘇主栽粳稻品種的遺傳與食味結(jié)構(gòu)分析. 作物學報, 2016, 42(7): 1083-1093.

GONG H B, YU B, SHENG S L, PAN X B, ZENG S Y, LI C, ZUO S M, JING D D, LIN T Z, CHEN Z X. Genetic analysis and taste quality of main conventionalrice varieties grown in Jiangsu province. Acta Agronomica Sinica, 2016, 42(7): 1083-1093. (in Chinese)

[19] 賈裕, 王道一, 沈秋萍, 孫海燕, 羅兵. 太湖地區(qū)水稻育種親本遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建. 常熟理工學院學報, 2020, 34(5): 80-85.

JIA Y, WANG D Y, SHEN Q P, SUN H Y, LUO B. Genetic diversity analysis and fingerprint construction of rice breeding parents in the Taihu lake region. Journal of Changshu Institute of Technology, 2020, 34(5): 80-85. (in Chinese)

[20] LI Y, XIAO J H, CHEN L L, HUANG X H, CHENG Z K, HAN B, ZHANG Q F, WU C Y. Rice functional genomics research: past decade and future. Molecular Plant, 2018, 11: 359-380.

[21] 張昌泉, 馮琳皓, 顧銘洪, 劉巧泉. 江蘇省水稻品質(zhì)性狀遺傳和重要基因克隆研究進展. 遺傳, 2021, 43(5): 425-441.

ZHANG C Q, FENG L H, GU M H, LIU Q Q. Progress on inheritance and gene cloning for rice grain quality in Jiangsu province. Hereditas, 2021, 43(5): 425-441. (in Chinese)

[22] 田志喜, 劉巧泉, 湯述翥, 李家洋, 顧銘洪, 嚴長杰, 錢前, 嚴松, 謝會蘭, 王芳. 水稻淀粉合成相關基因分子標記的建立. 科學通報, 2010, 55(26): 2591-2601.

TIAN Z X, LIU Q Q, TANG S Z, LI J Y, GU M H, YAN C J, QIAN Q, YAN S, XIE H L, WANG F. Development of gene-tagged molecular markers for starch synthesis-related genes in rice. Chinese Science Bulletin, 2010, 55(26): 2591-2601. (in Chinese)

[23] YAN C, TIAN Z, FANG Y, YANG Y, LI J, ZENG S, GU S, XU C, TANG S, GU M. Genetic analysis of starch paste viscosity parameters in glutinous rice (L.). Theoretical and Applied Genetics, 2011, 122: 63-76.

[24] MURRAY M G, THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nuclear Acids Research, 1980, 8: 4321-4326.

[25] WANG Z, JIA Y, RUTGER J N, XIA Y. Rapid survey for presence of a blast resistance genein rice cultivars using the dominant DNA markers derived from portions of thegene.Plant Breeding, 2007, 126: 36-42.

[26] 劉洋, 徐培洲, 張紅宇, 徐建第, 吳發(fā)強, 吳先軍. 水稻抗稻瘟病基因的分子標記輔助選擇與應用. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2008, 41(1): 9-14.

LIU Y, XU P Z, ZHANG H Y, XU J D, WU F Q, WU X J. Marker-assisted selection and application of blast resistant genein rice. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(1): 9-14. (in Chinese)

[27] SHOMURA A, IZAWA T, EBANA K, EBITANI T, KANEGAE H, KONISHI S, YANO M. Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domestication.Nature Genetics, 2008, 40(8): 1023-1028.

[28] 王軍, 楊杰, 陳志德, 仲維功. 水稻香米基因標記的開發(fā)與應用. 分子植物育種, 2008, 6(6): 1209-1212.

WANG J, YANG J, CHEN Z D, ZHONG W G. Development and application of fragrance gene markers in rice. Molecular Plant Breeding, 2008, 6(6): 1209-1212. (in Chinese)

[29] MYAKISHEV M V, KHRIPIN Y, HU S, HAMER D H. High throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with universal energy-transfer-labeled primers. Genome Research, 2001, 11(1): 163-169.

[30] 王明湖, 張孝天, 吳國林, 蔣琪, 施勇烽. SSR標記在寧波地區(qū)水稻品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及純度鑒定中的應用. 中國稻米, 2009, 25(6): 50-54.

WANG M H, ZHANG X T, WU G L, JIANG Q, SHI Y F. DNA fingerprints construction and purity identification based on SSR markers for rice varieties in Ningbo city. China Rice, 2009, 25(6): 50-54. (in Chinese)

[31] 田錚, 趙春芳, 張亞東, 趙慶勇, 朱鎮(zhèn), 趙凌, 陳濤, 姚姝, 周麗慧, 梁文化, 路凱, 王才林, 張紅生. 江蘇省半糯型粳稻蒸煮食味品質(zhì)性狀的差異分析. 中國水稻科學, 2021, 35(3): 249-258.

TIAN Z, ZHAO C F, ZHANG Y D, ZHAO Q Y, ZHU Z, ZHAO L, CHEN T, YAO S, ZHOU L H, LIANG W H, LU K, WANG C L, ZHANG H S. Differences in eating and cooking quality traits of semi-waxyrice cultivars in Jiangsu province. Chinese Journal of Rice Science, 2021, 35(3): 249-258. (in Chinese)

[32] LU B R, CAI X X, XIN J. Efficientandrice identification based on the InDel molecular method: its implication in rice breeding and evolutionary research. Progress in Nature Science, 2009, 19: 1241-1252.

[33] EBANA K, YONEMARU J, FUKUOKA S, IWATA H, KANAMORI H, NAMIKI N, NAGASAKI H, YANO M. Genetic structure revealed by a whole-genome single-nucleotide polymorphism survey of diverse accessions of cultivated Asian rice (L.). Breeding Science, 2010, 60: 390-397.

[34] WANG C H, ZHENG X M, XU Q, YUAN X P, HUANG L, ZHOU H F, WEI X H, GE S. Genetic diversity and classification ofwith emphasis on Chinese rice germplasm. Heredity, 2014, 112: 489-496.

Screening of Core Markers and Construction of DNA Fingerprints of Semi-WaxyRice Varieties

ZHAO ChunFang1, ZHAO QingYong1, Lü YuanDa2, CHEN Tao1, YAO Shu1, ZHAO Ling1, ZHOU LiHui1, LIANG WenHua1, ZHU Zhen1, WANG CaiLin1, ZHANG YaDong1

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/East China Branch of National Center of Technology Innovation for Saline-Alkali Tolerant Rice/Jiangsu High Quality Rice R&D Center, Nanjing 210014;2Institute of Crop Germplasm and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【Objective】A set of variety DNA fingerprint identification system based on the core markers of genes regulating rice important traits was constructed, which will establish a foundation for strengthening the germplasm management and protection of the mainly promoted semi-waxyrice varieties with high eating quality.【Method】34 semi-waxyrice varieties mainly cultivated in Jiangsu, Zhejiang and Shanghai were used as the test materials. The key differential sequence sites in genes regulating rice important traits were screened and core SNP or InDel markers were developed through multiple methods such as polymorphism testing of existing markers, gene sequence alignment from public databases and genome resequencing. SNP markers were developed into simple PCR markers based on electrophoretic bands by As-PCR technology. Genotype information was obtained by electrophoretic band characterization and type analysis, and the DNA fingerprint database of the semi-waxyrice varieties was constructed. 【Result】 54 core markers derived from 40 key genes regulating rice important traits were obtained, including 18 SNP and 36 InDel markers; 155 characteristic and effective bands were identified by 54 markers in the tested rice varieties, which were transformed into 155 0/1 data sites. The DNA fingerprint database of each variety was established and could distinguish it from all tested varieties. Genetic diversity analysis showed that the variation range of genetic similarity among varieties was 0.47-0.90, among which the lowest similarity coefficient was detected between Nanjing 7718 and Suxiangjing 100, while the highest similarity coefficient was detected between Nanjing 9308 and Nanjing 9036, among which there were 8 differential data sites. Genetic relationship analysis indicated that 34 varieties were divided into 6 branches, of which Nanjing 7718 was an independent branch, suggesting it has a distant relationship from other varieties. Further verification of the identification effect of core markers showed that the set of markers could effectively distinguish 14 new semi-waxyrice varieties. The cluster diagram showed that they were distributed in three groups of Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ, confirming the differences of genotype information among varieties; using this set of markers, the authenticity of an unknown semi-waxy rice variety was also identified. According to genotype and cluster analysis, it was determined as Nanjing 9108.【Conclusion】After optimization and screening, 54 core markers that could accurately distinguish all the tested semi-waxyvarieties were obtained, and developed into simple PCR markers detected by electrophoresis. Using this set of marker combinations, the DNA fingerprints of 34 semi-waxyvarieties in Jiangsu, Zhejiang and Shanghai were constructed.

rice (L.); semi-waxyrice; DNA fingerprints; molecular markers

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.001

2022-07-25；

2022-09-09

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX[20]2002）、江蘇省重點研發(fā)計劃（BE2021301）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-01）

趙春芳，E-mail：czhao@jaas.ac.cn。通信作者張亞東，E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn

（責任編輯 李莉）