張 蒙,王瑞芬,管雯斌,孫也淇,李凌軒,李俊磊,王立峰
胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤,也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)EBV感染與胃癌有關(guān)。2014年癌癥基因組圖譜(TCGA)提出EBV相關(guān)性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)是一種特殊的亞型,是免疫治療的主要受益群體[3]。EBVaGC是一組具有顯著臨床病理學(xué)特點及獨特基因改變的腫瘤。目前,國內(nèi)報道的EBVaGC較少。本文回顧性分析21例EBVaGC的臨床病理學(xué)特征,并結(jié)合相關(guān)文獻探討其治療及預(yù)后,以提高病理醫(yī)師對EBVaGC的認識。
1.1 材料收集2010年4月~2021年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院576例胃癌根治性手術(shù)標本,由兩名資深病理醫(yī)師重新復(fù)閱切片。所有病例均行EBER原位雜交檢測,篩選出EBVaGC標本21例。
1.2 方法
1.2.1HE及免疫組化 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片,行HE及免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法,DAB顯色,一抗包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、HER-2,購自上海羅氏公司;PD-L1購自美國Cell Signaling Technology公司;Claudin-18.2購自北京中杉金橋公司。參照試劑盒說明書操作,使用Leica全自動染色機及羅氏公司Ventana Ultra全自動免疫組化染色儀染色。
1.2.2EBER原位雜交 使用羅氏公司Ventana Ultra全自動免疫組化染色儀進行EBER原位雜交。原位雜交蛋白酶、EBER探針、原位雜交藍染染液和紅色復(fù)染劑均為羅氏工作液。參照U INFORM iVIEW Blue ISH染色程序操作。在陽性對照細胞核著色良好的情況下,腫瘤細胞核著色為深藍色記為陽性,以平均視野>5%的腫瘤細胞陽性且排除正常黏膜上皮細胞及間質(zhì)淋巴細胞陽性,歸類為EBVaGC[4]。
1.2.3FISH檢測 對HER-2免疫組化2+者加做FISH檢測,探針購自美國雅培公司,步驟參照試劑盒說明書操作。
1.3 結(jié)果判讀
1.3.1錯配修復(fù)蛋白(mismatch repair, MMR)免疫組化判讀標準 在內(nèi)對照(正常胃腺上皮及淋巴細胞等)細胞核著色良好的情況下,腫瘤細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽性;4個蛋白均陽性為錯配修復(fù)蛋白功能正常(mismatch repair-proficient, p-MMR),至少一種蛋白陰性則判定為錯配修復(fù)蛋白缺失(mismatch repair-deficient, d-MMR)。
1.3.2HER-2免疫組化判讀標準 0:無著色或<10%腫瘤細胞膜染色;1+:≥10%腫瘤細胞微弱或隱約可見膜染色,或僅有部分細胞膜染色;2+:≥10%腫瘤細胞有弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色;3+:≥10%腫瘤細胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色。參考2016版胃癌HER-2檢測指南[5],2+者須加做FISH檢測。
1.3.3Claudin-18.2免疫組化判讀標準 根據(jù)染色程度分為4級:無細胞膜或細胞質(zhì)染色為0分,弱細胞膜或細胞質(zhì)染色為1分,中等細胞膜或細胞質(zhì)染色為2分,強細胞膜或細胞質(zhì)染色為3分。以Claudin-18.2在≥40%腫瘤細胞染色程度≥2分定義為陽性[6]。
1.3.4PD-L1免疫組化判讀標準 采用綜合陽性評分(combined positive score, CPS)[7],即CPS=(PD-L1陽性腫瘤細胞+PD-L1陽性腫瘤相關(guān)免疫細胞)/腫瘤細胞總數(shù)×100,CPS值≥1即為PD-L1陽性,反之為陰性。
1.3.5FISH HER-2基因擴增檢測 在100倍油鏡下觀察胃癌細胞核,計數(shù)50個細胞,統(tǒng)計Ratio值,Ratio值=50個細胞核中紅信號總數(shù)/50個細胞核中綠信號總數(shù)。Ratio值<1.8為陰性;>2.2為陽性;1.8~2.2時,可以選擇增加計數(shù)細胞至100個,或重做實驗進行判讀。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,一致性檢驗采用完全隨機設(shè)計χ2檢驗及多個樣本率比較的χ2檢驗;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 臨床特征576例胃癌中檢出EBVaGC 21例,占同期胃癌的3.6%,其中男性17例(81.0%),女性4例(19.0%)。發(fā)病年齡42~74歲,平均61歲,中位年齡62歲;位于近端胃13例(61.9%),遠端胃8例(38.1%);腫瘤最大徑1.5~11 cm(表1)。
表1 EBV相關(guān)性胃癌21例臨床病理學(xué)特征
2.2 組織學(xué)特征7例(33.3%)腫瘤細胞彌漫片狀、小梁狀分布,細胞多角形、合胞樣,核空泡狀,核膜明顯,核分裂易見,間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞浸潤(圖1);7例(33.3%)腫瘤細胞排列成腺管狀,細胞中等大小(圖2);少數(shù)病例腫瘤細胞核被黏液推擠至一旁形成印戒細胞。Lauren分型:腸型7例(33.3%),彌漫型4例(19.0%),混合型2例(9.5%),不能確定型8例(38.1%)。WHO分型:伴淋巴樣間質(zhì)的癌7例(33.3%);其他非伴淋巴樣間質(zhì)的癌14例(66.7%):包括管狀腺癌7例(33.3%),低黏附性癌4例(19.0%),混合性腺癌2例(9.5%),未分化癌1例(4.8%)。
2.3 免疫表型及分子檢測21例EBER原位雜交均顯示腫瘤細胞核著色為深藍色(圖3、4),其中5% 2.4 EBVaGC與non-EBVaGC臨床病理特點比較EBVaGC和non-EBVaGC在發(fā)病部位、組織學(xué)類型、Lauren分型、PD-L1 CPS評分、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。根據(jù)腫瘤細胞EBER陽性百分比將EBVaGC劃分為5% 2.5 治療與預(yù)后21例患者均接受胃癌根治術(shù)并進行了D2淋巴結(jié)清掃,術(shù)后有8例患者行化療。2例失訪,5例死亡,14例生存,生存時間1.30~88.13個月。 胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在我國發(fā)病率僅次于肺癌和結(jié)腸癌[1,9]。自1990年Burke首次報道EBV陽性胃癌以來,越來越多的證據(jù)表明,部分胃癌的發(fā)生與EBV有關(guān)[10]。雖然EBV在成人中的感染率高達90%,但在胃癌中的感染率較低。2014年TCGA分子分型中EBVaGC約占9%,其發(fā)病率在各地區(qū)及人種之間有所不同,如北美白種人中EBVaGC發(fā)病率為16%,日本為7%;國內(nèi)報道吉林省約7.6%、安徽省4.1%、北京3.9%、山東省2.1%[11-12]。本組中EBVaGC僅占比3.6%,與國內(nèi)文獻報道基本一致。目前,其地區(qū)及人種之間感染率差異的原因有待于進一步探討[13]。 EBVaGC被定義為在腫瘤細胞中檢測到EBV感染[14],EBER原位雜交是診斷EBVaGC的金標準,但對于EBER陽性腫瘤細胞所占百分比目前尚未統(tǒng)一標準。根據(jù)腫瘤細胞EBER陽性百分比將EBVaGC劃分為5% ①②③④⑤⑥⑦⑧ 表2 EBV相關(guān)性胃癌與非EBV相關(guān)性胃癌性△臨床病理特征比較[n(%)] 本實驗發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC相比,其具有以下臨床病理特點:(1)好發(fā)于近端胃,平均最大徑5.5 cm。(2)Lauren分型以不能確定型最為常見,WHO分型以伴淋巴樣間質(zhì)的癌常見,但其他組織學(xué)亞型腺癌也可以檢出EBV陽性[11]。在本組21例EBVaGC中,僅1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌,僅根據(jù)組織學(xué)形態(tài)決定是否行EBER檢測可能會導(dǎo)致部分EBVaGC漏診。(3)腫瘤浸潤程度淺,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,TNM分期早。(4)與non-EBVaGC相比,EBVaGC中PD-L1 CPS評分高(85.7%vs28.8%),尤其在伴淋巴樣間質(zhì)的癌中PD-L1 CPS評分更高。(5)HER-2狀態(tài):本組21例EBVaGC免疫組化及FISH檢測顯示HER-2均無過表達和擴增,而對照組non-EBVaGC(162例,1例未做)中HER-2過表達者19例(11.7%)。此外,Bermudez等[15]報道在non-EBVaGC中16%病例表現(xiàn)出HER-2擴增;另有研究顯示胃癌中HER-2過表達的發(fā)生率為13.4%[16]。上述研究表明:在EBVaGC中HER-2表達和HER-2擴增均受抑制。(6)Claudin-18.2表達:本組21例EBVaGC中Claudin-18.2陽性率47.6%。目前,我國關(guān)于Claudin-18.2在胃癌中的表達數(shù)據(jù)較少,查閱相關(guān)文獻[2,17-18]發(fā)現(xiàn),在高加索人中EBVaGC的陽性率為77.7%,non-EBVaGC的陽性率為32.4%;在日本人群中EBVaGC的陽性率為84%,non-EBVaGC的陽性率為40%。盡管本實驗數(shù)據(jù)與文獻報道有差異(推測可能與不同抗體克隆號、不同人種及不同陽性標準有關(guān)),但Claudin-18.2在EBVaGC中的陽性率高于non-EBVaGC。此外,有學(xué)者報道在TCGA 4種分子亞型中,EBV亞型中Claudin-18.2的陽性率最高[2]。(7)4種MMR均無缺失,與文獻報道相符[19]。 目前,關(guān)于EBVaGC患者預(yù)后的研究結(jié)果不同。多項研究支持EBV感染是預(yù)后較好的因素,其中TCGA數(shù)據(jù)庫的一項研究顯示EBVaGC比其他分子亞型預(yù)后好[20]。此外,一項整合了東西方的超大樣本(375/4 244,8.2%)臨床數(shù)據(jù)也顯示EBVaGC患者的生存期更長[21-22]。然而,少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能與以下原因有關(guān):(1)樣本量小,一些患者尚未出現(xiàn)終點事件,刪失數(shù)據(jù)多,差異不顯著。(2)樣本內(nèi)一些患者具有特殊的分子改變,如TP53[23]、BCOR突變[24],具有這些分子改變的患者預(yù)后差且免疫治療效果不佳。本組中19例獲得隨訪,5例患者死亡,組織學(xué)類型均為非伴淋巴樣間質(zhì)的癌,且有3例PD-L1 CPS<1,另2例PD-L1 CPS為2,生存時間1.3~51.67個月,提示在EBVaGC中組織學(xué)類型為淋巴樣間質(zhì)的癌,PD-L1 CPS評分高者常伴有良好的預(yù)后[25]。 目前,PD-L1免疫檢查點阻斷劑在治療胃癌方面發(fā)揮著越來越重要的作用。在2021年CSCO胃癌診療指南[26]中,對于HER-2擴增陰性的轉(zhuǎn)移性胃癌,PD-L1免疫治療已上升至一線治療(PD-L1 CPS≥1三級推薦,PD-L1 CPS≥5一級推薦)。有文獻報道HER-2陽性胃癌和EBVaGC之間無交叉[27];本組21例HER-2均無擴增,提示PD-L1阻斷劑如帕博利珠單抗在胃癌(尤其是EBVaGC)治療中發(fā)揮越來越重要的作用[28-29]。 Claudin-18.2是Claudin家族的一員,是緊密連接的組成部分,可以調(diào)節(jié)細胞外屏障功能。Dottermusch等[18]研究發(fā)現(xiàn),胃癌中Claudin-18.2表達與EBV感染狀態(tài)有關(guān),并認為腫瘤細胞中Claudin-18.2表達可能與EBV介導(dǎo)的致癌機制有關(guān)。本組21例EBVaGC中47.6%病例Claudin-18.2陽性,提示EBVaGC中Claudin-18.2高表達有望成為新的潛在治療靶點[30-31]。 綜上所述,EBVaGC是一種具有獨特臨床病理特征的胃癌,好發(fā)于男性、近端胃、TNM分期早、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低、PD-L1 CPS評分高,約1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌。此外,與non-EBVaGC相比,EBVaGC中PD-L1 CPS評分高,Claudin-18.2陽性率高,HER-2擴增受抑制。盡管EBVaGC預(yù)后有爭議,但絕大多數(shù)文獻均支持該亞型預(yù)后好,生存時間長。PD-L1免疫檢查點阻斷劑和Claudin-18.2靶向藥的應(yīng)用,將使更多的EBVaGC患者獲益[32]。3 討論