BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌303例臨床病理學(xué)特征

李 棟，劉藝璇，李雪晴，王麗麗，林東亮，谷海燕，王婧楠，王繼綱

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，我國甲狀腺癌的發(fā)病率在過去幾十年內(nèi)始終處于上升趨勢。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，占85%～90%[1]，文獻(xiàn)報道東亞人群中BRAF V600E基因突變率遠(yuǎn)高于西方國家，在日本PTC人群中BRAF V600E基因突變率約為85%[2]，在美國PTC人群中BRAF V600E基因突變率約40%[3]。一般認(rèn)為BRAF V600E突變型PTC需要更加積極的治療策略，而在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)部分BRAF V600E野生型PTC也具有高侵襲性的生物學(xué)行為。目前，國內(nèi)尚無BRAF V600E野生型PTC的大樣本研究報道，有關(guān)該類型的臨床病理特征以及基因?qū)W變異特點尚待進(jìn)一步分析。本文收集303例BRAF V600E野生型PTC，探討其臨床病理特征、診斷、鑒別診斷，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年11月青島大學(xué)附屬醫(yī)院PTC手術(shù)標(biāo)本9 729例，其中4 757例行BRAF V600E免疫組化檢測；其中陽性者4 007例(84.2%)，陰性者750例(15.8%)。甲狀腺微小PTC(最大徑<1 cm)的預(yù)后良好，本組排除微小癌病例。本組共納入1 564例PTC，其中BRAF V600E陽性者1 261例(80.6%)，BRAF V600E陰性者303例(19.4%)。收集BRAF V600E陰性病例的病理切片和臨床資料，包括患者年齡、腫瘤大小、部位、數(shù)目、被膜侵犯(被膜下生長)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴發(fā)病變等情況。隨訪時間1～4年，通過查閱本院病歷存檔系統(tǒng)獲取術(shù)后復(fù)查影像學(xué)結(jié)果，并通過細(xì)胞病理學(xué)或組織病理學(xué)結(jié)果判斷有無術(shù)后復(fù)發(fā)。PTC組織病理學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)WHO(2017)內(nèi)分泌腫瘤：包括經(jīng)典型、包裹型、濾泡型(完全為濾泡性的生長方式，乳頭不超過1%，否則視為經(jīng)典型)、柱狀細(xì)胞型等多種。本實驗獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 BRAF V600E免疫組化染色及結(jié)果判讀免疫組化染色采用美國Ventana Medical Systems開發(fā)的VENTANA anti-BRAF V600E(克隆號VE1，針對氨基酸596-606的人工合成肽)鼠單抗，在Roche Bench mark ULTRA全自動免疫組化染色平臺上進(jìn)行。染色切片采用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的組織，脫蠟后，抗原修復(fù)(細(xì)胞調(diào)理液1)100 ℃ 64 min，過氧化物酶抑制劑5 min，一抗孵育36 ℃ 16 min，Opti View DAB IHC檢測試劑盒(包括HQ Linker和HRP Multimer，Ventana Medical Systems)，用蘇木精Ⅱ和藍(lán)染試劑復(fù)染組織4 min。采用染色系統(tǒng)推薦的陰性試劑質(zhì)控小鼠單抗代替一抗評價非特異染色，陽性對照用已知的陽性PTC切片作為質(zhì)控對照。BRAF V600E(VE1)的陽性染色模式為低倍鏡下可見確切的腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染色，結(jié)果由兩位病理醫(yī)師根據(jù)腫瘤中是否存在特異性胞質(zhì)染色來評估：對腫瘤細(xì)胞內(nèi)高于背景的、任何強(qiáng)度的明確胞質(zhì)染色判定為陽性。其中，對2017年5月～2019年6月連續(xù)103例BRAF V600E陰性石蠟標(biāo)本同時行ARMS-PCR檢測(ADx-ARMS BRAF基因V600E突變檢測試劑盒，廈門艾德生物公司)，檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 靶向基因二代測序采用All-in-One Cancer Panel進(jìn)行測序和生物信息分析(項目編號：X101SC20051089-Z01-J001)。該方法可以檢測560個與癌癥及用藥密切相關(guān)基因以及TERT基因的啟動子突變熱點區(qū)段，有效測序深度1 000×。15例BRAF V600E野生型PTC標(biāo)本(同時經(jīng)免疫組化及ARMS-PCR驗證)進(jìn)行測序，包括7例經(jīng)典型、5例濾泡型、1例柱狀細(xì)胞型、1例嗜酸細(xì)胞型、1例實性型。測序標(biāo)本采用石蠟包埋的癌和癌旁組織(11例為淋巴結(jié)，4例為癌旁正常甲狀腺組織)進(jìn)行基因組DNA提取、文庫構(gòu)建、庫檢及上機(jī)測序。DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為180～280 bp的片段，采用Agilent Sure Select XT Custom 試劑盒進(jìn)行建庫和捕獲，末端修復(fù)和加A尾后，在片段兩端分別連接接頭進(jìn)行文庫制備。帶有特異index的文庫與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，使用帶鏈霉素的磁珠將捕獲目標(biāo)基因的目標(biāo)片段，經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢；根據(jù)有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)行Illumina Hi Seq PE150測序。測序結(jié)束獲得原始測序序列后進(jìn)行基因變異信息挖掘及分析。利用Sam tools軟件檢測患者正常組織中的胚系突變，篩選可能的癌癥易感基因；將體細(xì)胞突變結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的已知驅(qū)動基因進(jìn)行比較，篩選已知驅(qū)動基因。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗分析BRAF野生型和突變型PTC的臨床病理特征差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAF V600E野生型PTC的臨床病理學(xué)特點303例BRAF V600E野生型PTC中，男性67例，女性236例，男女比為1 ∶3.5，年齡11～70歲，平均42歲，中位年齡43歲(圖1)；病灶最大徑1～7.5 cm，平均1.8 cm，198例有被膜侵犯(或發(fā)生于被膜下)(65.3%)，207例有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(68.3%)，120例伴橋本甲狀腺炎(39.6%)，80例為多發(fā)病灶(26.4%)。在1 261例BRAF V600E突變型PTC中，男性298例，女性963例(男女比為1 ∶3.2)，年齡17～77歲，平均44歲(中位年齡43歲)，病灶最大徑1～8 cm，平均1.58 cm，900例有被膜侵犯或位于被膜下(71.4%)，717例有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(56.9%)，221例伴有橋本甲狀腺炎(17.5%)，411例病灶多發(fā)(32.6%)。隨訪BRAF V600E野生型PTC患者134例，其中3例復(fù)發(fā)(出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，均未進(jìn)行二代測序)。隨訪BRAF V600E突變型PTC患者146例，其中6例復(fù)發(fā)(出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。

圖1 303例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌的年齡及性別分布

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示：與BRAF V600E突變型PTC相比，BRAF V600E野生型PTC更常伴發(fā)橋本甲狀腺炎，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 BRAF V600E突變型與野生型甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征對比分析[n(%)]

2.2 BRAF V600E野生型PTC的病理學(xué)亞型103例BRAF V600E免疫組化陰性PTC的ARMS-PCR檢測結(jié)果均為野生型，采用免疫組化和ARMS-PCR兩種方法的檢測結(jié)果完全一致。BRAF V600E野生型PTC組織學(xué)類型：大部分為經(jīng)典型(79例)，其他類型包括濾泡型21例、柱狀細(xì)胞型1例、嗜酸細(xì)胞型1例、實性型1例(圖2～6)。

2.3 BRAF V600E野生型PTC的基因變異15例BRAF V600E野生型PTC中共篩選出30個腫瘤易感基因突變(圖7)；此外，在4例樣本中檢出9個癌癥驅(qū)動基因外顯子區(qū)域的突變(表2)，其中1例濾泡型PTC出現(xiàn)NIN無義突變，1例經(jīng)典型PTC出現(xiàn)CHIC2、KAT6B、AXIN1錯義突變和PHF6同義突變，1例經(jīng)典型PTC出現(xiàn)LPHN3錯義突變和DOCK8移碼突變，1例經(jīng)典型出現(xiàn)IKZF1和NLRP1同義突變。本組15例均未檢測到RAS基因及TERT啟動子突變。

②③④⑤⑥圖2 經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌:以乳頭狀結(jié)構(gòu)為主,核為磨玻璃樣,常見核溝和核內(nèi)假包涵體 圖3 濾泡型甲狀腺乳頭狀癌:完全或幾乎完全由濾泡構(gòu)成,核磨玻璃樣,可有核溝和核內(nèi)假包涵體 圖4 柱狀細(xì)胞型甲狀腺乳頭狀癌:乳頭被覆假復(fù)層柱狀上皮,缺乏典型的乳頭狀癌樣核特征 圖5 嗜酸細(xì)胞型甲狀腺乳頭狀癌:嗜酸性濾泡上皮細(xì)胞,核具有典型的乳頭狀癌樣特

表2 15例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本的二代測序結(jié)果*

3 討論

BRAF V600E突變是PTC中常見的突變之一，既往研究認(rèn)為BRAF V600E狀態(tài)與PTC臨床生物學(xué)行為和預(yù)后相關(guān)，BRAF V600E突變是PTC預(yù)后不良的獨立影響因素[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E突變狀態(tài)與PTC患者臨床預(yù)后無相關(guān)性：BRAF V600E突變與PTC組織學(xué)亞型有關(guān)，與其他臨床病理特征未見相關(guān)性，不能作為PTC的獨立預(yù)后因子[5-6]。研究結(jié)果不同的原因可能是存在BRAF以外的其他因素，如重要的未知的驅(qū)動基因變異；其次不同人群中BRAF突變率存在顯著差異，如既往與預(yù)后相關(guān)的報道中BRAF突變率分別為48.5%、37.3%、45.7%[3-4,7]，而無預(yù)后相關(guān)的報道中BRAF突變率較高，分別為86.5%、65%、56%[5-6,8]。本組BRAF突變率為80.4%，也遠(yuǎn)高于西方人群的報道。

圖7 15例BRAF V600E野生型甲狀腺乳頭狀癌的癌癥易感基因

本組發(fā)現(xiàn)，相對于BRAF V600E突變型PTC，BRAF野生型PTC更常伴發(fā)橋本甲狀腺炎；在BRAF V600E突變型PTC中橋本甲狀腺炎的檢出率為17.5%，而BRAF V600E野生型PTC中的檢出率為39.6%。目前，大部分研究認(rèn)為合并橋本甲狀腺炎的PTC中BRAF V600E陽性率低[9-10]，與本實驗結(jié)果基本一致。有研究表明，橋本甲狀腺炎可通過調(diào)控腫瘤特異性免疫反應(yīng)來降低腫瘤的侵襲風(fēng)險，抑制PTC的進(jìn)展，是PTC的保護(hù)性因素[11]。然而，橋本甲狀腺炎中的濾泡上皮經(jīng)常發(fā)生萎縮后不典型增生，在此基礎(chǔ)上可能更易發(fā)展為PTC，多為BRAF V600E野生型。

本組BRAF V600E突變型與野生型PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有顯著性，BRAF V600E突變型PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是56.9%，而BRAF V600E野生型為68.3%，提示BRAF V600E野生型PTC同樣具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。既往大多數(shù)研究認(rèn)為BRAF V600E突變型PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高[12]，更易發(fā)生被膜侵犯[13-14]。不同研究結(jié)果的差異可能因其他重要的驅(qū)動基因或分子生物學(xué)指標(biāo)在不同人群中的分布差異，僅憑BRAF V600E指標(biāo)可能難以評估真實的生物學(xué)行為。本組BRAF V600E突變型PTC被膜侵犯的比例高于野生型病例(71.4%vs65.3%)，但這并不能說明BRAF V600E是PTC發(fā)生被膜侵犯的危險因素，也不能說明BRAF V600E突變型具有較強(qiáng)的侵襲性，因為部分PTC好發(fā)于甲狀腺被膜下，且被膜侵犯的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)病理醫(yī)師的主觀性較強(qiáng)，作者認(rèn)為以被膜外軟組織的侵犯轉(zhuǎn)移作為局部浸潤侵襲性的指標(biāo)可能更具代表性。此外，Yan等[15]在研究PTC臨床病理特征時發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E突變與腫瘤多灶性相關(guān)，這與本組結(jié)果一致，與BRAF V600E野生型PTC相比，BRAF V600E突變型PTC更易發(fā)生多個病灶，并且多發(fā)于雙側(cè)甲狀腺。本組中復(fù)發(fā)病例數(shù)較少(僅有9例)，且隨訪時間均未超過5年，仍不能根據(jù)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或被膜侵犯情況來判斷預(yù)后，還需進(jìn)行更長時間的隨訪來研究BRAF V600E野生型PTC的遠(yuǎn)期結(jié)局。

文獻(xiàn)報道男性PTC患者的BRAF V600E基因突變率高于女性，提示男性患者預(yù)后比女性差[12]；而Basolo等[16]和本實驗結(jié)果均未顯示不同性別組中的BRAF V600E基因突變存在顯著差異，本組男性患者腫瘤BRAF V600E突變率高于女性。未來可進(jìn)一步研究來驗證性別應(yīng)用于PTC患者危險分層和管理時，是否應(yīng)該區(qū)分BRAF V600E基因突變狀態(tài)。

本組發(fā)現(xiàn)BRAF V600E野生型PTC中約80%病例的組織學(xué)亞型為經(jīng)典型，約20%病例為濾泡型。雖然本組并未對BRAF V600E突變型PTC的組織學(xué)亞型進(jìn)行分類，但既往報道濾泡型PTC中BRAF多為野生型[17]，BRAF野生型PTC中濾泡型的比例相對較高。既往研究發(fā)現(xiàn)不同基因變異可能與組織學(xué)類型和生物學(xué)行為密切相關(guān)[18]：BRAF突變PTC常為經(jīng)典型；RAS突變PTC多表現(xiàn)為濾泡型；RET/PTC1重排常發(fā)生在年輕散發(fā)的PTC患者，預(yù)后相對較好；RET/PTC3重排好發(fā)于射線暴露PTC且多為實體型；ETV6-NTRK3重排也與射線暴露相關(guān)，且具有較強(qiáng)的侵襲性；TERT啟動子突變好發(fā)于老年男性患者。多項大樣本的高通量測序研究均提示：BRAF和RAS突變是PTC中較為常見的基因突變，但相對于歐美國家，中國人群BRAF突變發(fā)生率高，RAS突變率低[19-20]。本組15例BRAF V600E野生型PTC中均未檢測到RAS突變，亦提示我國人群RAS突變發(fā)生率較低。進(jìn)一步文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，本組病例檢出的9種體細(xì)胞基因突變在既往PTC測序研究中罕見報道，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證，明確這幾種基因突變的臨床病理意義有助于對BRAF V600E野生型PTC進(jìn)一步分型。

綜上，與文獻(xiàn)報道BRAF V600E突變可作為PTC獨立的預(yù)后危險因素不同，本組發(fā)現(xiàn)BRAF V600E野生型PTC更易合并橋本甲狀腺炎和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示應(yīng)對BRAF V600E野生型PTC進(jìn)行進(jìn)一步的危險度分層，尋找預(yù)后相關(guān)影響因素。進(jìn)一步明確BRAF V600E突變對PTC的影響及其對PTC患者預(yù)后的影響，尋找其他有價值的分子生物學(xué)指標(biāo)，對這類疾病的精準(zhǔn)篩查、風(fēng)險監(jiān)測及個體化治療具有重要作用。