EGFR突變和CIP2A表達(dá)與肺腺癌臨床特征的關(guān)系及相關(guān)性

孫曉靜，陳 穎，阮 婷，呂彥天

目前肺癌的靶向治療，尤其是EGFR-TKI治療，可以顯著提高EGFR突變患者的生存，但患者的5年生存率仍較低(10%～20%)[1]，治療中多發(fā)生耐藥[2-4]。尋找肺癌耐藥的相關(guān)機(jī)制，是臨床面臨的迫切任務(wù)。2007年研究表明，CIP2A是一種與PP2A相互作用的內(nèi)源性抑制因子，CIP2A在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且CIP2A高表達(dá)與肺癌預(yù)后不良相關(guān)，CIP2A缺失可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖和凋亡[5-7]。激活EGFR信號(hào)可通過MEK-MAPK途徑上調(diào)CIP2A表達(dá)，而CIP2A可通過PI3K-AKT途徑介導(dǎo)厄洛替尼誘導(dǎo)EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡和肺癌的增殖[8-9]。本文旨在探討肺腺癌中EGFR突變和CIP2A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年3月～2016年1月南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除、氣管鏡活檢及肺穿刺活檢的105例肺腺癌組織。另收集78例距離癌組織邊緣5 cm以上相應(yīng)癌旁組織，且病理證實(shí)為正常肺組織。105例患者中，男性48例，女性57例，中位年齡57歲；吸煙者46例，非吸煙者59例；肺癌分期依據(jù)第八版UICC/AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)：0/Ⅰ期49例，Ⅱ期24例，Ⅲ期18例，Ⅳ期14例。根據(jù)2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分類：原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)13例，微浸潤(rùn)腺癌(microinvasive adenocarcinoma, MIA)29例，浸潤(rùn)腺癌(invasive adenocarcinoma, IA)63例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

患者術(shù)后隨訪包括臨床癥狀、腫瘤標(biāo)志物、影像檢查等。隨訪截至2021年2月，52例患者接受了輔助治療(化療或EGFR-TKI治療)。其中42例患者復(fù)發(fā)，27例死亡?？偵嫫跒榇_診至患者死亡或隨訪結(jié)束時(shí)間，其中死亡病例通過電話隨訪、住院記錄或入戶調(diào)查確定。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用SP法，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作，一抗CIP2A(ab84547)稀釋濃度為1 ∶100。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)染色陽性細(xì)胞占整個(gè)癌區(qū)或良性組織的百分比評(píng)估表達(dá)分級(jí)：陰性(0～5%)、弱陽性(5%～25%)、中等陽性(26%～50%)和強(qiáng)陽性(51%～100%)，切片均經(jīng)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法判讀。

1.2.2EGFR突變檢測(cè) 石蠟包埋肺癌組織以10 μm厚切片，送至病理實(shí)驗(yàn)室或基因公司提取DNA，并通過探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)法檢測(cè)EGFR突變狀態(tài)[10]。

1.2.3Western blot檢測(cè) 不同肺癌細(xì)胞株A549、H1975、H460、PC-9、H520、H1975、H226、SKMES、HCC827、HCC827-GR(由蘇州大學(xué)呼吸研究所惠贈(zèng))及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B培養(yǎng)于6孔板中，棄去培養(yǎng)上清，PBS清洗2次，每孔加入200 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天公司)，輕輕搖晃1～2 min后，收集裂解液至EP管，放入100 ℃水浴中變性7 min，-20 ℃冷卻備用。以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，140 mA、90 min，冰浴條件下用NC膜轉(zhuǎn)膜，200 mV、120 min，快速封閉液(碧云天公司)封閉NC膜15 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌4次后，加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2～3 h，ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，放入Biorad凝膠成像儀曝光。

1.2.4CIP2A干擾細(xì)胞株的構(gòu)建 靶向作用于CIP2A的siRNA慢病毒序列由上海吉滿公司合成，干擾序列1：5′-AAACTTCTCTCAACATACTAGC-3′，干擾序列2：5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3′，對(duì)照序列：5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′，將肺癌H1975細(xì)胞株鋪在6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至板底的60%，PBS洗2次去除死細(xì)胞和代謝物，更換為2 mL含1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔加入5 μL siRNA(空白對(duì)照及干擾序列，病毒滴度1×108TU/mL)，培養(yǎng)24 h后PBS洗2次，重新更換2 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48～72 h后收集細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)干擾效果。

1.2.5CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將構(gòu)建的干擾CIP2A的肺癌細(xì)胞株H1975消化后用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×104個(gè)，取96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)不同分組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，以24、48、72及96 h為時(shí)間點(diǎn)。在不同時(shí)間點(diǎn)向待測(cè)孔中緩慢加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)相應(yīng)孔的OD值，并繪制增殖曲線。

1.2.6細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干擾CIP2A的H1975肺癌細(xì)胞株，消化離心后加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS重懸后離心，后再加入1 mL冰浴預(yù)冷的70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定24 h，1 000g離心5 min，沉淀細(xì)胞。每個(gè)樣品加入0.5 mL染色緩沖液，碘化丙啶染色液(1 ∶20)25 μL，RNase A(1 ∶50)10 μL。分成H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，BD流式細(xì)胞儀根據(jù)程序設(shè)定測(cè)定各樣品周期。

1.2.7細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干擾CIP2A的肺癌細(xì)胞株H1975，消化離心，以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，每毫升1.5×105個(gè)H1975細(xì)胞接種到Tranwell上室中[侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)Transwell上室預(yù)鋪50 μL Matrigel膠(1 ∶7)凝固后，每毫升加2.5×105個(gè)H1975細(xì)胞接種到Tranwell上室中]，下室加入10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基。分H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽輕輕拭去上室肺癌細(xì)胞，甲醇固定30 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色0.5 h后風(fēng)干，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)比較CIP2A蛋白和EGFR突變?cè)诜蜗侔┖驼７谓M織中的表達(dá)及與臨床病理特征關(guān)系，Spearson法分析CIP2A蛋白表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)的相關(guān)性，Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，ImageJ 7.1軟件測(cè)定Western blot蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值。肺癌細(xì)胞株組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中CIP2A的表達(dá)CIP2A蛋白表達(dá)主要定位于肺腺癌細(xì)胞胞質(zhì)中。105例肺腺癌組織中CIP2A的陽性率為64.76%(68/105)，78例癌旁組織中CIP2A的陽性率為8.97%(7/78)(圖1，表1)。CIP2A在肺腺癌組織中強(qiáng)陽性28例，中等陽性26例，弱陽性14例，而癌旁組織中CIP2A均為弱陽性。EGFR突變型肺癌中CIP2A的表達(dá)較EGFR野生型高(圖1)。χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIP2A在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

ABCDEF

表1 肺腺癌及癌旁肺組織中CIP2A的表達(dá)

2.2 肺腺癌中EGFR突變情況ARMS法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，105例肺腺癌組織中45例為EGFR野生型，60例存在EGFR突變，其中18外顯子突變(G719X)2例，18和19外顯子共同突變1例，20外顯子突變3例，19外顯子缺失(19del)33例，21外顯子突變(L858R)21例。

2.3 肺腺癌中CIP2A表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性60例EGFR突變型肺腺癌中55例CIP2A蛋白陽性，45例EGFR野生型肺腺癌中13例CIP2A蛋白陽性。Spearson相關(guān)分析顯示：肺腺癌組織中EGFR突變與CIP2A蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.650，P<0.001，表2)。

表2 肺腺癌EGFR突變與CIP2A表達(dá)的相關(guān)性

2.4 肺腺癌患者無進(jìn)展生存相關(guān)的預(yù)后因素進(jìn)一步將患者年齡、性別、吸煙情況、病理分期、EGFR突變狀態(tài)及CIP2A表達(dá)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡(P=0.195)、性別(P=0.918)、吸煙狀態(tài)(P=0.203)與預(yù)后無明顯相關(guān)性，而病理分期(HR=5.715，95%CI=1.612～20.260，P=0.002)、CIP2A表達(dá)(HR=1.946，95%CI=0.662～5.716，P=0.015)、EGFR突變狀態(tài)(HR=2.870，95%CI=1.105～7.445，P=0.037)與預(yù)后具有相關(guān)性(表3)。

表3 肺腺癌患者預(yù)后單因素分析

2.5 肺癌細(xì)胞株中CIP2A的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析CIP2A在不同肺癌細(xì)胞株和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CIP2A在肺癌細(xì)胞株中具有不同水平的表達(dá)，而正常肺上皮細(xì)胞無明顯表達(dá)。ImageJ軟件進(jìn)一步測(cè)量CIP2A蛋白的相對(duì)表達(dá)量，在EGFR敏感突變株HCC827(19del)和PC-9(19del)中CIP2A的相對(duì)表達(dá)量分別為0.41和0.55，而在EGFR耐藥突變株中H1975(T790M)中表達(dá)更高，相對(duì)表達(dá)量為0.89(圖2A)。同時(shí)選取HCC827和吉非替尼誘導(dǎo)后耐藥的HCC827-GR檢測(cè)CIP2A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)吉非替尼誘導(dǎo)耐藥后CIP2A的表達(dá)明顯升高(0.56vs0.92)(圖2B)。

圖2 Western blot法檢測(cè)肺癌細(xì)胞株中相關(guān)蛋白的表達(dá)：A. CIP2A在不同肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)；B. HCC827及吉非替尼耐藥細(xì)胞株HCC827-GR中CIP2A的表達(dá)

2.6 CIP2A干擾肺癌細(xì)胞株的構(gòu)建以EGFR耐藥突變株H1975為細(xì)胞系，建立干擾CIP2A的細(xì)胞株，干擾CIP2A表達(dá)后，CIP2A蛋白表達(dá)水平明顯降低(相對(duì)蛋白表達(dá)量由0.81降至為0.15、0.12)，表明細(xì)胞株構(gòu)建成功(3A)。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)干擾CIP2A后肺腺癌常見信號(hào)通路EGFR相關(guān)信號(hào)通路PI3K及MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：干擾CIP2A后，H1975的P-AKT蛋白明顯抑制(相對(duì)蛋白表達(dá)量由0.95降至0.51、0.44，而P-ERK蛋白無明顯變化(蛋白表達(dá)量分別為0.81、0.79、0.83)(圖3B)，表明PI3K-AKT通路可能參與肺腺癌中CI2PA介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥的通路。

2.7 干擾CIP2A后肺癌細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖：干擾CIP2A后，48 h開始H1975-Sh-1和H1975-Sh-2組細(xì)胞較H1975-Sh-NC組細(xì)胞增殖速度減慢，72 h后更為顯著(H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2組的OD值分別為2.12±0.34、1.51±0.23、1.60±0.21，P<0.01)，表明干擾CIP2A可抑制肺癌細(xì)胞的增殖(圖4)。

圖3 A.驗(yàn)證干擾CIP2A肺癌細(xì)胞株構(gòu)建；B.干擾CIP2A后肺癌細(xì)胞株中相關(guān)信號(hào)通路的變化

圖4 干擾CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞周期：干擾CIP2A后，H1975-Sh-1、H1975-Sh-2組細(xì)胞周期G1期占(68.93±3.56)%，G2期占(3.14±0.21)%，S期占(27.11±1.53)%，H1975-Sh-NC組G1期占(57.50±2.06)%，G2期占(6.34±0.83)%，S期占(36.08±2.09)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)，表明干擾CIP2A后，肺癌細(xì)胞G1期增加，S期及G2期減少，增殖受抑制。

圖5 干擾CIP2A后肺癌細(xì)胞周期的變化

細(xì)胞遷移和侵襲：遷移實(shí)驗(yàn)顯示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組透過Transwell下室的平均每視野細(xì)胞數(shù)分別為387±46、125±29、98±17(P<0.01)；侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三組透過Transwell下室的平均每視野細(xì)胞數(shù)分別為279±35、95±28、67±12(P<0.01)，提示干擾CIP2A可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖6)。

圖6 干擾CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1組細(xì)胞加入吉非替尼后研究干擾CIP2A后細(xì)胞增殖變化。從第3天開始H1975-Sh-1組較H1975-Sh-NC組細(xì)胞增殖速度減慢，在第4天更為明顯(2.84±0.25vs1.72±0.18，P<0.01)，提示干擾CIP2A可部分恢復(fù)肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性(圖7)。

圖7 加入吉非替尼對(duì)干擾CIP2A肺腺癌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

目前證實(shí)CIP2A在許多實(shí)體和血液腫瘤中過表達(dá)，CIP2A過表達(dá)是胃癌、卵巢癌和舌癌等許多癌癥的不良預(yù)后因素[11-12]，這可能與CIP2A和c-Myc形成的正反饋有關(guān)。目前，CIP2A在肺癌中的研究數(shù)據(jù)有限，結(jié)果也不完全一致。多數(shù)報(bào)道證實(shí)CIP2A在肺癌組織中過表達(dá)，但其與臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚。Xu等[6]研究顯示，CIP2A表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、TNM分期、病理類型和組織學(xué)分化無關(guān)。Cha等[7]研究表明，CIP2A過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期相關(guān)。在預(yù)后方面，多數(shù)研究顯示CIP2A表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)[5-7,12]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIP2A在肺腺癌組織中高表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)。各研究結(jié)論不盡相同的原因可能與入組樣本量、鑒定CIP2A表達(dá)的參考水平不一致以及各分期患者數(shù)量不同相關(guān)。

CIP2A具有促進(jìn)肺癌增殖的作用，抑制CIP2A表達(dá)，肺癌細(xì)胞增殖受到抑制并促進(jìn)凋亡的形成[8]。本實(shí)驗(yàn)首先通過免疫組化檢測(cè)肺癌組織，發(fā)現(xiàn)CIP2A與EGFR突變之間具有相關(guān)性，并且CIP2A在EGFR突變型肺腺癌中的表達(dá)量相對(duì)更高，兩者可能在肺癌的治療中具有協(xié)同作用。EGFR信號(hào)通路通常由MEK-MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、遷移、黏附和存活[13]。研究表明[14]，CIP2A表達(dá)受EGFR-MEK-ETS1通路、p53失活、E2F1和ATF-2(激活轉(zhuǎn)錄因子2)調(diào)控，因此，推測(cè)EGFR可以通過MEK-MAPK途徑促進(jìn)CIP2A在腫瘤中的表達(dá)，而EGFR突變型比EGFR野生型更有能力激活下游信號(hào)通路。在EGFR野生型患者中，厄洛替尼與多西他賽或培美曲塞的療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.37)，表明EGFR-TKI在肺癌治療中的作用不一定完全依賴EGFR突變，而這種抗腫瘤作用可能與抑制CIP2A蛋白有關(guān)[8]。因此，有必要從分子水平進(jìn)一步研究EGFR突變(包括耐藥突變)和CIP2A在肺癌細(xì)胞增殖和侵襲中的作用。

EGFR是近年來在治療晚期肺癌中發(fā)現(xiàn)的最具治療性的分子標(biāo)志物。EGFR-TKI已成為EGFR突變晚期肺癌患者一線治療的首選。然而，絕大多數(shù)患者在獲得9.2～19.3個(gè)月的無進(jìn)展生存期后，不可避免地因后續(xù)繼發(fā)耐藥而導(dǎo)致疾病進(jìn)展[2-3]。目前關(guān)于EGFR-TKI繼發(fā)耐藥的機(jī)制已有大量研究報(bào)道[15-16]，主要分為EGFR依賴型和EGFR非依賴型。EGFR-T790M突變是第一、二代EGFR-TKIs EGFR依賴性獲得性耐藥最主要的原因，占50%～60%[17-18]。其耐藥機(jī)制為當(dāng)EGFR-T790M突變時(shí)，EGFR蛋白ATP結(jié)合囊中的T790M殘基可增強(qiáng)其與ATP的親和力，從而介導(dǎo)EGFR-TKI的抗性并降低其療效[19]。H1975細(xì)胞株是具有T790M突變的肺腺癌細(xì)胞株，故選用H1975細(xì)胞株作為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的CIP2A干擾細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾CIP2A后肺癌細(xì)胞株表現(xiàn)為抑制腫瘤增殖、遷移及侵襲的表型變化。為進(jìn)一步研究哪些信號(hào)通路參與此種改變，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot法檢測(cè)常見的EGFR相關(guān)信號(hào)通路PI3K及MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：干擾CIP2A后，肺癌細(xì)胞中P-AKT蛋白明顯抑制，而P-ERK蛋白無明顯變化，表明PI3K-AKT通路可能參與了CI2PA介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥的通路。PI3K是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)激酶家族的成員，其中PIK3α可以PIP2磷酸化為PIP3，后者能夠激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖能力。有研究顯示PI3K-AKT/mTOR通路激活可能與EGFR耐藥相關(guān)，發(fā)生率為4%～11%，其中包括E545K、E542K、R88Q、N345K和E418K突變[20]。

另外，Saafan等[21]在適應(yīng)厄洛替尼的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HCC4006rErlo0.5中發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)CIP2A的基因表達(dá)明顯升高，可作為獲得性耐藥的模型，并且CIP2A可導(dǎo)致AKT信號(hào)的結(jié)構(gòu)性激活，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與之一致。除了肺癌，在乳腺癌研究中[22]，CIP2A過表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞株SKBR3和78617對(duì)拉帕替尼(ErbB2/EGFR抑制劑)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制具有抗性；相反，通過慢病毒shRNA干擾CIP2A可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)拉帕替尼誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡的敏感性。這些研究表明，CIP2A在EGFR-TKI繼發(fā)的耐藥研究中具有更進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

綜上，肺腺癌中CIP2A表達(dá)明顯增加，并與EGFR突變呈正相關(guān)。EGFR-TKI耐藥可能與CIP2A高表達(dá)有關(guān)，干擾CIP2A可能成為肺癌靶向治療的新思路，未來仍需要進(jìn)一步探討CIP2A在肺癌EGFR突變耐藥方面的機(jī)制。