清香型大曲白酒釀造中發(fā)酵微生物的分析研究

曹苗文，相里加雄，楊凱環(huán)，郭新節(jié)，王富貴，薛梓宸

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司中國(guó)汾酒城管理中心，山西 汾陽 032200）

清香型大曲白酒釀造用大麥和豌豆制曲，以高粱為釀酒原料，采用“清蒸清燒、地缸發(fā)酵、清蒸二次清”工藝，白酒具有“清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)、余味凈爽”的風(fēng)格特點(diǎn)。清香型白酒是多菌種自然發(fā)酵，發(fā)酵微生物種類極為豐富。高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，清香型白酒發(fā)酵酒醅中真核OTU 共有275個(gè)，原核OTU 有1767 個(gè)。主要是醋酸桿菌科（Acetobacteriaceae）、乳酸桿菌科（Lactobacilliaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、假絲酵母（）、畢赤酵母科（Pichiaceae）等。龐大的微生物菌群代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，豐富白酒口感，影響白酒品質(zhì)。

大曲是白酒發(fā)酵重要的微生物來源，也為發(fā)酵提供了多種酶類。在清香型白酒釀造中要添加10%的大曲，所以同時(shí)還具有投糧作用。清香型大曲有3 種：清茬曲、后火曲和紅心曲，清茬曲的液化力、糖化力、蛋白分解酶活性高，后火曲的發(fā)酵力最高。研究發(fā)現(xiàn)，清茬曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬（）和葡萄球菌屬（），后火曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（），紅心曲的優(yōu)勢(shì)菌群為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和高溫放線菌屬（），3 種大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。

清香型白酒釀造是固態(tài)、開放性的自然發(fā)酵，環(huán)境中的微生物也是發(fā)酵微生物的重要來源。在河北某清香型酒廠的釀造環(huán)境中（地面、工具）發(fā)現(xiàn)了15 種優(yōu)勢(shì)微生物屬，包括乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、畢赤酵母菌屬（）、復(fù)膜孢酵母菌屬（）、酵母菌屬（）等。

從以往研究中可以發(fā)現(xiàn)，大曲、環(huán)境與發(fā)酵酒醅中有很多共有微生物。那么，大曲和環(huán)境哪個(gè)對(duì)發(fā)酵微生物的影響更大，哪個(gè)是更重要的微生物來源，值得我們深入研究。本研究以大曲、環(huán)境、發(fā)酵酒醅中的微生物群落為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲、環(huán)境、發(fā)酵酒醅中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)并分析比較，意在分析得出發(fā)酵微生物的主要來源，有利于深入理解白酒發(fā)酵過程，便于在生產(chǎn)中對(duì)白酒品質(zhì)進(jìn)行控制和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

取樣時(shí)間：2020年5月—7月。

取樣地點(diǎn)：某清香型白酒生產(chǎn)車間。

采集范圍：（1）大曲：采集粉碎好的3 種大曲，紅心曲、清茬曲、后火曲。（2）生產(chǎn)環(huán)境：工具、柵場(chǎng)和發(fā)酵室地面、柵場(chǎng)和發(fā)酵室墻面、發(fā)酵地缸邊沿和內(nèi)壁、發(fā)酵地缸周圍土壤0～5 cm。取樣方法參考文獻(xiàn)。（3）發(fā)酵材料：取同一批大米查材料的發(fā)酵0 d、發(fā)酵15 d 和出缸酒醅。分別采集每個(gè)發(fā)酵階段的酒醅表層、表層往下約50 cm 處及底層三個(gè)層次的酒醅樣品，每個(gè)層次采集中心點(diǎn)5 cm 范圍內(nèi)和緊貼地缸內(nèi)壁的位置，然后將酒醅混合作為一個(gè)樣品以消除取樣誤差，混合后取500 g 存于無菌自封袋中。

1.2 DNA提取和高通量測(cè)序

利用FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，SantaAna，CA，USA) 試劑盒，參照說明書提取微生物的DNA。提取好的DNA 樣品測(cè)定濃度和純度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，細(xì)菌擴(kuò)增V3—V4區(qū)，引物是338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')、806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系。真菌擴(kuò)增ITS1 區(qū)，引物是ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')、ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')。采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件是：預(yù)變性3 min (95 ℃)，變性30 s(95 ℃)，退火30 s (55 ℃)，延伸45 s (72 ℃)，終延伸10 min (72 ℃)，細(xì)菌循環(huán)數(shù)為27，真菌為35。PCR 產(chǎn)物通過膠回收純化后在Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。本部分的DNA 提取、測(cè)序和生物信息服務(wù)在上海美吉生物科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本的物種數(shù)目和Shannon 指數(shù)，反映其微生物的豐富度和多樣性。統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)勢(shì)微生物屬(平均相對(duì)豐度前10)在各個(gè)樣品中的相對(duì)豐度。基于屬水平對(duì)對(duì)微生物（細(xì)菌和真菌）樣品進(jìn)行PCA 分析（主成分分析，Principal Component Analysis），判斷不同樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。

另外，為了分析大曲、環(huán)境及發(fā)酵酒醅微生物群落的相互關(guān)系，我們首先計(jì)算了各個(gè)樣本之間的Spearman 相關(guān)性（OTU 水平），選擇有顯著相關(guān)（P＜0.05）的數(shù)據(jù)，用Gephi 軟件(Web Atlas，Paris，F(xiàn)rance)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖制作以此反映樣本之間的相互關(guān)系。此外，利用SourceTracker 分析(version 0.9.8)來預(yù)測(cè)酒醅中微生物的來源，將發(fā)酵0 d 和15 d 酒醅作為sink，大曲（清茬去、后火曲、紅心曲）及環(huán)境樣本（地面、墻面、工具、土壤、地缸表面）作為source。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析（圖1）

計(jì)算分析微生物的多樣性可以發(fā)現(xiàn)，真菌群落的Shannon 指數(shù)為后火曲＞紅心曲＞清茬曲，而且清茬曲的真菌群落Shannon 指數(shù)遠(yuǎn)小于其他兩種大曲。細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)大小順序恰恰相反，后火曲＜紅心曲＜清茬曲，且清茬曲的細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)遠(yuǎn)大于其他兩種大曲（圖1a）。在物種數(shù)方面，清茬曲的真菌物種數(shù)最多，紅心曲和后火曲差異不大。這與Wang 等在2014 年用DGGE 方法檢測(cè)大曲微生物得到的結(jié)論一致，認(rèn)為是清茬曲制曲溫度較低導(dǎo)致。細(xì)菌物種數(shù)紅心曲＞清茬曲＞后火曲（圖1b）。細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度一般為37 ℃，真菌的最適生長(zhǎng)溫度一般為25～28 ℃，紅心曲的制曲溫度較高，清茬曲的制曲溫度較低，加上微生物的相互作用，導(dǎo)致了這種細(xì)菌和真菌多樣性的差異。

圖1 大曲、環(huán)境、發(fā)酵材料中的微生物多樣性

在環(huán)境中，地缸表面的真菌群落Shannon 指數(shù)最高，其次是地面和墻面。地面、墻面和土壤中的細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)最高（圖1a）。地面和地缸表面的真菌物種數(shù)最多，地面、墻面、土壤中的細(xì)菌物種數(shù)較多（圖1b）?？傮w來說，地面的微生物多樣性最高，地面微生物一部分來自空氣，一部分來自工人勞動(dòng)。

分析發(fā)酵酒醅中的微生物多樣性得出，發(fā)酵15 d 的材料其真菌Shannon 指數(shù)和物種數(shù)最多，發(fā)酵0 d 的材料其細(xì)菌Shannon 指數(shù)和物種數(shù)最多，且15 d和出缸酒醅的細(xì)菌多樣性極低（圖1a，1b）。比較大曲、環(huán)境、發(fā)酵材料中的微生物多樣性可以發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的微生物多樣性高于大曲和發(fā)酵材料。

2.2 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的細(xì)菌群落分析（圖2）

圖2 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖2 可看出，紅心曲和后火曲中的最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是芽孢桿菌屬，而在清茬曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是乳桿菌屬。紅心曲和后火曲的制曲溫度更高，而芽孢桿菌產(chǎn)內(nèi)生孢子，對(duì)溫度耐受性強(qiáng)，所以在紅心曲和后火曲中占優(yōu)勢(shì)。在以前的研究中也發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬在曲心占優(yōu)勢(shì)，而乳桿菌屬在曲皮更多，也是因?yàn)榍臏囟雀?，曲皮溫度相?duì)較低的原因。在環(huán)境樣品中，地缸表面的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳桿菌屬，占到80%以上。乳桿菌屬產(chǎn)乳酸，乳酸會(huì)抑制酒精的產(chǎn)生。工具表面和地面的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌也為乳桿菌屬，其次是葡萄球菌屬。墻面葡萄球菌屬占優(yōu)勢(shì)，其次是假單胞菌屬（）。土壤中的微生物有很大不同，絕大多數(shù)都是其他細(xì)菌。在發(fā)酵材料中，發(fā)酵0 d 的乳桿菌屬約占50 %，為主要微生物，其次是魏斯氏菌屬，還有醋桿菌屬（），但是發(fā)酵到15 d 和出缸，酒醅中的細(xì)菌幾乎全是乳桿菌屬。在其他清香型白酒的研究中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵到第8 天時(shí)，酒醅中乳桿菌屬的豐度已經(jīng)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

比較大曲、環(huán)境和發(fā)酵材料中的細(xì)菌群落可以發(fā)現(xiàn)（圖2），發(fā)酵材料中的假單胞菌屬等在大曲中幾乎沒有，但是在環(huán)境中存在。從PCA 分析可以發(fā)現(xiàn)（圖3），紅心曲和后火曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，清茬曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與二者相差較遠(yuǎn)。清茬曲和工具表面及發(fā)酵0 d 的材料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相近。發(fā)酵15 d、出缸酒醅與地缸表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。說明地缸表面微生物對(duì)發(fā)酵中后期微生物的群落結(jié)構(gòu)影響較大。

圖3 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的細(xì)菌群落PCA分析

2.3 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的真菌群落分析

分析大曲優(yōu)勢(shì)真菌群落結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)（圖4），后火曲中的優(yōu)勢(shì)真菌為伊薩酵母菌屬（），其次是復(fù)膜孢酵母菌屬。紅心曲中的優(yōu)勢(shì)真菌為，其次是復(fù)膜孢酵母菌屬。清茬曲中的復(fù)膜孢酵母菌屬占大多數(shù)。檢測(cè)到的復(fù)膜孢酵母菌屬主要是扣囊復(fù)膜酵母菌（），它具有α-淀粉酶和糖化酶活性，使其能夠利用淀粉。伊薩酵母主要是產(chǎn)乙醇。在環(huán)境樣品中，地缸表面、工具和地面上最多的真菌均為伊薩酵母菌屬，其次是曲霉屬（）。后火曲和紅心曲中雖然也有曲霉屬，但是不占優(yōu)勢(shì)。曲霉屬相對(duì)豐度最大的是墻面。土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣品差異較大，其中有部分假絲酵母屬（）。在發(fā)酵材料中，發(fā)酵0 d 材料中的真菌絕大多數(shù)都是伊薩酵母，到了15 d 時(shí)復(fù)膜孢酵母菌屬開始占據(jù)優(yōu)勢(shì)，且嗜熱子囊菌屬（）和曲霉屬的相對(duì)豐度也變大。出缸時(shí)嗜熱子囊菌屬占優(yōu)勢(shì)。

圖4 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的真菌群落結(jié)構(gòu)

比較大曲、環(huán)境和發(fā)酵材料中的真菌群落可以發(fā)現(xiàn)（圖4），發(fā)酵材料中的嗜熱子囊菌屬在大曲中基本沒有，可能在未檢測(cè)的一些環(huán)境中，比如水。發(fā)酵材料中的曲霉屬在大曲中很少，在環(huán)境中卻大量存在。

從PCA 分析可以發(fā)現(xiàn)，地缸表面、工具、地面、紅心曲、后火曲、發(fā)酵15 d 材料及出缸酒醅之間的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。

圖5 大曲、釀造環(huán)境及酒醅中的真菌群落PCA分析

2.4 酒醅中微生物的來源分析

發(fā)酵0 d 的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受3 種大曲細(xì)菌的影響，但是發(fā)酵15 d 和出缸酒醅的細(xì)菌群落主要與環(huán)境微生物的關(guān)聯(lián)性較大，尤其受地面、地缸表面和工具表面附著的微生物影響較大（圖6a）。

發(fā)酵0 d 的真菌群落結(jié)構(gòu)受后火曲影響最大，也受地面和地缸表面微生物的影響。發(fā)酵15 d 真菌群落與清茬曲和后火曲、地面、工具、地缸表面真菌群落相關(guān)性較大。出缸酒醅中的真菌群落與后火曲和清茬曲中的真菌群落關(guān)聯(lián)性較大（圖6b）。

圖6 網(wǎng)絡(luò)圖分析大曲、環(huán)境和發(fā)酵材料微生物群落之間的聯(lián)系

Source Tracker 分析結(jié)果顯示（圖7a），清茬曲對(duì)0 d 發(fā)酵材料中的細(xì)菌群落貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)率達(dá)56.7%，且還受一部分工具表面和未知環(huán)境中細(xì)菌的影響。地缸表面微生物對(duì)15 d 發(fā)酵材料中的細(xì)菌群落貢獻(xiàn)最大，達(dá)93%，還受一部分工具表面細(xì)菌的影響。

圖7 用Source Tracker分析發(fā)酵材料中微生物的來源

對(duì)于發(fā)酵材料中的真菌群落（圖7b），發(fā)酵0 d真菌主要受后火曲影響最大，貢獻(xiàn)率高達(dá)96.3 %。工具表面微生物對(duì)其15 d 真菌貢獻(xiàn)最大，達(dá)43.9%。其次是清茬曲，貢獻(xiàn)32.6%。此外，地面、地缸表面、后火曲及未知環(huán)境中的真菌也是15 d 真菌的重要來源。

前人的研究發(fā)現(xiàn)，大曲對(duì)發(fā)酵0 d 的酒醅細(xì)菌的貢獻(xiàn)率有9.10 %～27.39 %，對(duì)真菌的貢獻(xiàn)率有61.06 %～80.00 %。環(huán)境對(duì)細(xì)菌的貢獻(xiàn)率有62.61 %～90.90 %，對(duì)真菌的貢獻(xiàn)率有20.00 %～38.94 %。而本研究中，發(fā)酵0 d 的真菌和細(xì)菌群落均受大曲影響較大，這可能是釀酒地區(qū)不同導(dǎo)致。白酒釀造具有地域性特點(diǎn)，不同地域之間環(huán)境、氣候、水源、微生物菌群及工藝差異，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵微生物結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的規(guī)律。15 d 是酒醅發(fā)酵的中后期，是發(fā)酵關(guān)鍵階段，許多香味物質(zhì)開始大量生成，控制15 d 微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)提升發(fā)酵品質(zhì)有重要意義。從結(jié)果可以看出，要優(yōu)化15 d 微生物群落，控制釀酒車間環(huán)境很重要，要尤為重視現(xiàn)場(chǎng)管理。

3 結(jié)論

分析比較大曲、環(huán)境、發(fā)酵材料中的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的微生物多樣性高于大曲和發(fā)酵材料。而且發(fā)酵材料中的假單胞菌屬、嗜熱子囊菌屬在大曲中幾乎沒有，但在環(huán)境中存在。發(fā)酵材料中的曲霉屬在大曲中很少，在環(huán)境中卻大量存在。

此外，比較大曲、環(huán)境和發(fā)酵材料的微生物群落結(jié)構(gòu)及分析發(fā)酵微生物來源發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵剛開始，發(fā)酵微生物受大曲影響較大，但是到了中后期，主要受環(huán)境微生物的影響。其中細(xì)菌群落主要受地缸表面微生物影響。中后期發(fā)酵細(xì)菌主要是乳桿菌屬，乳桿菌是酒醅酸化的主要因素，要控制乳桿菌屬，就要注意入缸時(shí)地缸表面的清潔。