精子形態(tài)畸形相關(guān)指數(shù)與夫精人工授精結(jié)局的關(guān)系

楊 岳 洪 洋 胡慧敏 丁彩飛

人工授精是臨床上用于治療不孕癥的常用手段，影響其受孕率的因素有很多。研究表明，精子形態(tài)畸形可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良、胚胎種植率和懷孕率低以及反復(fù)流產(chǎn)[1-2]。精子存在多個(gè)部位同時(shí)畸形的情況，即多重精子缺陷，相關(guān)的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有多重異常指數(shù)（MAI）、畸形精子指數(shù)（TZI）和精子畸形指數(shù)（SDI），其中研究者發(fā)現(xiàn)MAI 和TZI 與體內(nèi)生育能力相關(guān)[3]，而SDI 與體外受精聯(lián)系緊密[4]。目前關(guān)于這三個(gè)精子形態(tài)多重畸形相關(guān)指標(biāo)與人工授精臨床結(jié)局之間的相關(guān)性的研究仍較為缺乏。本研究擬探索男性精子形態(tài)畸形相關(guān)指數(shù)與夫精人工授精結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)選取2020 年2 月—2021 年5月在浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行夫人工授精的夫婦192 對(duì)，其中女性年齡（32.16±4.69）歲，男性年齡（34.57±5.19）歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，倫理批號(hào)：【2021】快審（26）號(hào)，研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者按照相關(guān)規(guī)定行常規(guī)術(shù)前檢查，夫妻雙方年齡≤45 歲，雙方均無(wú)全身性疾病及傳染病；（2）女性經(jīng)子宮輸卵管碘油造影檢查顯示至少一側(cè)輸卵管通暢，且通暢輸卵管側(cè)有優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，子宮內(nèi)膜情況良好；（3）正常性生活未避孕至少1 年及以上仍未受孕，雙方生殖系統(tǒng)相關(guān)檢查結(jié)果均顯示正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞45 歲或在此年齡階段無(wú)生育要求；（2）生殖器官存在畸形或者先天性性腺發(fā)育不全；（3）合并其他器官嚴(yán)重原發(fā)病及精神病患者；（4）夫妻任何一方存在未得到充分治療并轉(zhuǎn)陰的生殖系統(tǒng)感染或性傳播疾??；（5）患者人工授精手術(shù)后失聯(lián)，無(wú)法追蹤妊娠情況。

1.3主要試劑及儀器 試劑與耗材：精子形態(tài)快速染液（Diff-Quik 染液）（深圳市博銳德生物科技有限公司，批號(hào)20201001），40%與80%密度梯度分離液（SAGE，批號(hào)20471648），精子培養(yǎng)液（SAGE，批號(hào)20471639），取精杯（BD Falcon 公司，批號(hào)9320028），離心管（BD Falcon 公司，批號(hào)21220023），玻片；儀器：普通光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，CX31），生物安全柜（Thermo，1300 SERIES A2）。

1.4精子形態(tài)分析 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書制片，使用Diff-Quik 染液進(jìn)行快速染色。晾干后使用普通光學(xué)顯微鏡的油鏡（放大1000 倍）讀片，計(jì)數(shù)至少200 個(gè)精子，嚴(yán)格遵循《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[5]的相關(guān)要求和規(guī)定判斷并統(tǒng)計(jì)精子形態(tài)情況，計(jì)算精子形態(tài)正常率、MAI、TZI 和SDI。精子形態(tài)示例具體見(jiàn)圖1：正常精子B；僅頭部畸形精子A、G、F、H；僅尾部畸形精子D；頭部與中段畸形精子C、J；頭部與尾端畸形精子L、K；中段及尾部畸形E；頭部、中段及尾部同時(shí)畸形I、O、P、M、N；過(guò)量殘留胞漿精子N。精子形態(tài)正常率=正常精子數(shù)/精子總數(shù)，MAI=缺陷總數(shù)/缺陷精子數(shù)（統(tǒng)計(jì)所有頭、中、尾部畸形，多部位畸形可重復(fù)計(jì)數(shù)），TZI=缺陷總數(shù)/缺陷精子數(shù)（頭、中、尾部畸形各記為1，過(guò)量殘留胞漿也記為1），SDI=缺陷總數(shù)/精子總數(shù)（頭部幾種缺陷合并記為1，中部尾部各記為1，過(guò)量殘留胞漿也記為1）。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，精子形態(tài)正常率分為四組，具體為≥6%、4%～＜6%、2%～＜4%、＜2%；MAI 分為≥2.00、1.50～＜2.00、1.00～＜1.50 三組；TZI 分為兩組，1.50～2.00 和1.00～＜1.50；SDI 分為三組，分別是1.50～2.00、1.00～＜1.50 和0.50～＜1.00。

圖1 不同形態(tài)精子（Diff-Quik 快速染色法）

1.5行夫精人工授精手術(shù) 男方禁欲3～7 天，使用手淫法取精液于取精杯中，將精液置于37℃培養(yǎng)箱中直至完全液化，梯度液平衡至室溫，精子培養(yǎng)液放置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；吸取1mL 80%的密度梯度液小心加到1mL 40%密度梯度液下方；充分混合液化后的精液，加到40%密度梯度液上方；400g 離心20min，優(yōu)質(zhì)精子將集中于試管底部；棄去上層精漿和分離液，用3～4mL 培養(yǎng)液重懸精子沉淀團(tuán)；再300g 離心5min，棄上清，加入0.4～0.5mL 精子洗液重懸精子沉淀團(tuán)，獲得濃縮的精子懸液，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱備用。根據(jù)女方具體情況選擇自然周期或促排后進(jìn)行人工授精術(shù)，B 超監(jiān)測(cè)到優(yōu)勢(shì)卵泡，LH出現(xiàn)峰值，在優(yōu)勢(shì)卵泡排出前后將精子懸液注入宮腔，并抬高臀部平躺1h。

1.6判定妊娠 術(shù)后10～18 天尿或血β-絨毛膜促性腺激素（β-HCG）值出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，35 天左右B 超檢測(cè)到孕囊、卵黃囊及胎兒心跳搏動(dòng)確定為臨床妊娠，統(tǒng)計(jì)各組妊娠率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 分析相關(guān)數(shù)據(jù)，妊娠率作為描述性計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同精子形態(tài)正常率各組臨床妊娠率比較 不同形態(tài)正常率各組的妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.31，P=0.961），見(jiàn)表1。

表1 不同精子形態(tài)正常率各組臨床妊娠率比較（例，%）

2.2不同精子MAI 各組妊娠率比較 各組間妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.86，P=0.402），見(jiàn)表2。

表2 不同精子MAI 各組妊娠率比較（例，%）

2.3不同TZI 各組妊娠率比較 不同TZI 組間妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.139，P=0.712），見(jiàn)表3。

表3 不同TZI 各組妊娠率比較（例，%）

2.4不同SDI 各組妊娠率比較 不同SDI 各組妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.12，P=0.022），其中1.50～2.00 組和1.00～＜1.50 組之間無(wú)差異，但0.50～＜1.00組與前兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 SDI 各組妊娠率比較（例，%）

3 討論

對(duì)于有生育要求的不孕不育癥夫婦，臨床上常用的輔助生殖技術(shù)是人工授精手術(shù)，但人工授精受孕成功率一般在8%～22%之間[6]。造成人工授精成功率較低的因素有很多，其中男性因素主要是精液情況和精子質(zhì)量，精子形態(tài)學(xué)是評(píng)估男性精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，精子的形態(tài)畸形會(huì)從多方面影響受孕，例如影響精子識(shí)別、結(jié)合卵子透明帶的能力和頂體反應(yīng)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，精子畸形率程度與胚胎發(fā)育潛能呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與受孕后發(fā)生早期自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，因此會(huì)影響體外授精的成功率[7-8]。有報(bào)道顯示，MAI、TZI、SDI 在特發(fā)性少弱畸形精子癥患者的檢測(cè)中均與其精子中段、尾部異常百分率呈正相關(guān)[9]，也有研究表明，SDI 與精子密度、活力與前向運(yùn)動(dòng)率之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與體外授精成功率也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[4，10]，而對(duì)于三者與人工授精臨床結(jié)局之間的相關(guān)性，目前還未有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，精子形態(tài)正常率≥6%組的妊娠率較其他組略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同MAI 和TZI 各組間也無(wú)顯著性差異；但SDI 值0.50～＜1.00 組的妊娠率明顯增高（P＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明暫未發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)正常率、MAI、TZI 對(duì)不孕患者人工授精術(shù)后妊娠率具有預(yù)測(cè)作用，但SDI 對(duì)預(yù)測(cè)人工授精術(shù)后妊娠率具有一定指導(dǎo)意義。這一方面可能由于樣本量有限，MAI、TZI 相關(guān)分組的樣本數(shù)存在不足；另一方面也可能由于精子形態(tài)正常率只關(guān)注正常精子所占總數(shù)比例，而MAI、TZI 反映的是畸形精子的缺陷程度，SDI 則可以反映各種缺陷精子占精子總數(shù)比例，可代表樣本總體的多重缺陷情況，并且SDI 的缺陷精子計(jì)數(shù)包含對(duì)過(guò)量殘留胞漿的計(jì)數(shù)，已有研究者發(fā)現(xiàn)過(guò)量殘留胞漿會(huì)造成精子功能缺陷進(jìn)而影響受孕[11]。

綜上所述，我們認(rèn)為SDI 對(duì)人工授精術(shù)后的妊娠率具有一定的預(yù)測(cè)作用，鑒于本研究樣本量的局限，后期可繼續(xù)增加樣本量，進(jìn)一步探索精子多重畸形相關(guān)指標(biāo)與人工授精妊娠率的關(guān)系，能夠有助于臨床更好把握適應(yīng)證，提高人工授精的成功率。