復(fù)合乳酸菌發(fā)酵米發(fā)糕風(fēng)味物質(zhì)及儲(chǔ)存特性

劉冬梅 鄺嘉華 黃燕燕 胡金雙 周欽育 余佳佳

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

米發(fā)糕是我國(guó)極具代表性的大米發(fā)酵食品，因其獨(dú)特的柔軟質(zhì)地、清新的米香而受到人們的喜愛[1]。傳統(tǒng)米發(fā)糕使用“老漿法”，即保留天然發(fā)酵的米漿作為下一次制作米發(fā)糕的發(fā)酵劑。但由于發(fā)酵體系中微生物菌群易受環(huán)境的變化影響，因此米發(fā)糕品質(zhì)較難維持穩(wěn)定[2]。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌與乳酸菌對(duì)淀粉食品協(xié)同發(fā)酵能改善發(fā)酵產(chǎn)品，如增加比容[3]、改善質(zhì)構(gòu)[4]、延緩淀粉老化[5]等。但其添加量過多會(huì)導(dǎo)致酸度過大，產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)變差、滋味過酸[6]。多數(shù)研究關(guān)注米發(fā)糕的菌種篩選以及菌種復(fù)配的比例[7- 8]，而關(guān)于其添加量的研究較少。乳酸菌發(fā)酵劑的添加量與米發(fā)糕的口感品質(zhì)息息相關(guān)，適量的添加可豐富其風(fēng)味、增加其抗形變能力[9]，而添加過量會(huì)導(dǎo)致蛋白過度降解，影響米發(fā)糕比容[10]。此外，儲(chǔ)藏過程中淀粉的老化、變質(zhì)現(xiàn)象對(duì)米發(fā)糕的品質(zhì)影響較大，從而限制了米發(fā)糕的商業(yè)性和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，而合適的溫度和包裝方法能有效提高米發(fā)糕的食用品質(zhì)和貨架期[11- 12]。

鑒于此，本研究對(duì)傳統(tǒng)米發(fā)糕發(fā)酵劑進(jìn)行優(yōu)化，使用復(fù)合乳酸菌(植物乳桿菌與德氏乳桿菌質(zhì)量比1：1)與酵母菌協(xié)同發(fā)酵，以感官評(píng)價(jià)和質(zhì)構(gòu)指標(biāo)(硬度、彈性、膠著性、咀嚼性和回復(fù)性)對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑添加量進(jìn)行探究，并對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，分別采用氣調(diào)包裝(50%CO2+50%N2)、真空包裝和密封袋裝3種包裝方式，并設(shè)定4 ℃冷藏、28 ℃室溫和37 ℃高溫3種情況儲(chǔ)藏米發(fā)糕，對(duì)米發(fā)糕儲(chǔ)藏期間的感官評(píng)價(jià)、質(zhì)構(gòu)特性(硬度、咀嚼性)進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈米粉、糯米粉、白砂糖，購自廣東省廣州市正豐超市；植物乳桿菌DMDL9010(LactobacillusplantarumDMDL9010)分離于中國(guó)傳統(tǒng)泡菜中，德氏乳桿菌保加利亞亞種DMDL- H1(L.delbrueckiisubsp.bulgaricusDMDL- H1)分離于內(nèi)蒙古奶酪中，保藏于華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；MRS培養(yǎng)基、密封袋，購自廣州卯林試劑有限公司；聚酯光面真空袋(PET+PE，13 cm18 cm)，網(wǎng)購；傳統(tǒng)米發(fā)糕，市售。

TA- XT plus Texture Analyzer型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司生產(chǎn)；7890B/5799A型頂空-固相微萃取氣相色譜儀，Agilent科技公司生產(chǎn)；ZB-WAX(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)型毛細(xì)管柱，Agilent科技公司生產(chǎn)；SCIENTZ- 18N型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；5804R型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司生產(chǎn)；MAP- H350型復(fù)合氣調(diào)保鮮包裝機(jī)，蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司生產(chǎn)；DT- DZQ400ID型單式內(nèi)抽真空包裝機(jī)，深圳市稻田包裝機(jī)械有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵菌粉的制備

將保存于甘油管的兩種乳酸菌分別接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下活化培養(yǎng)16 h，然后將100 mL種子液轉(zhuǎn)接到2 L MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。收集兩種乳酸桿菌液后離心(8 000 r/min，10 min)，得到菌泥。添加凍干保護(hù)劑制成菌懸液后，真空冷凍干燥(-50 ℃、真空度10 Pa)38 h，得到乳酸菌凍干粉(菌體含量為107～108CFU/g)。

1.2.2 復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的制作

復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的制作流程為原料粉—過篩—原輔料混合—攪拌—發(fā)酵—蒸煮—冷卻—成品。其配方以米粉100 g為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算：米粉100 g(秈米粉97 g、糯米粉3 g)；白砂糖10 g；水20 g；安琪酵母2 g；復(fù)合乳酸菌2、4、6、8、10 g(LactobacillusplantarumDMDL9010和L.delbrueckiisubsp.bulgaricusDMDL- H1菌粉質(zhì)量比1：1)。

秈米粉和糯米粉過80目篩，加水混合，備用；用30 ℃水分別將安琪酵母粉和復(fù)合乳酸菌粉活化，接入上述面糊中，混合均勻，于28 ℃發(fā)酵14 h；白砂糖用少量水溶解，待發(fā)酵結(jié)束后加入進(jìn)行調(diào)味，得到發(fā)酵面團(tuán)；在蒸鍋中蒸煮20 min，便可得到復(fù)合菌米發(fā)糕。

1.2.3 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[13]。感官評(píng)定小組由10名來自華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生組成。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

通過TA- XT plus質(zhì)構(gòu)儀對(duì)復(fù)合菌米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。樣品切片大小為40 mm×40 mm×20 mm，壓縮試驗(yàn)進(jìn)行2個(gè)周期和3次重復(fù)。直徑為36 mm的圓柱探針以2 mm/s的速度運(yùn)作，樣品被壓縮高度為50%，兩個(gè)周期之間的時(shí)間為15 s。從力-時(shí)間圖中計(jì)算得出硬度、彈性、膠著性、咀嚼性和回復(fù)性[14]。其中，硬度、膠著性及咀嚼性以力的單位N表示。

1.2.5 米發(fā)糕中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

通過頂空固相微萃取法(HS- SPME)提取揮發(fā)性成分[10]。稱取米發(fā)糕樣品5 g，移入20 mL的頂空瓶中，用聚四氟乙烯-硅橡膠墊密封壓緊，于60 ℃磁力攪拌器上加熱平衡15 min后，使用提前在240 ℃下預(yù)熱20 min的SPME纖維萃取頭(2 cm，50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS)吸附30 min(保持60 ℃水浴)，然后將萃取頭插入質(zhì)譜儀進(jìn)樣口，解析5 min，平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。

GC- MS分析參考文獻(xiàn)[15]并適當(dāng)修改。色譜柱：ZB- WAX毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣，純度≥99.999%；柱流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；進(jìn)樣方式：萃取頭在進(jìn)樣口解析5 min，脈沖無分流進(jìn)樣；柱溫程序：50 ℃(5 min)，以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

色譜-質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；離子化方式：電子電離源(EI)；電子能量：70 eV；質(zhì)量范圍：35～350 amu。

各組分質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NIST.11譜庫進(jìn)行檢索，根據(jù)相似度≥80確認(rèn)其香氣成分，采用面積歸一化法計(jì)算樣品各組分的相對(duì)含量。

1.2.6 復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕儲(chǔ)存特性的探究

將冷卻至室溫的復(fù)合菌米發(fā)糕分別用密封袋裝、真空包裝和氣調(diào)包裝(50%CO2+50%N2)3種方式進(jìn)行包裝(每種方式包裝15份)，分別置于4、28、37 ℃下進(jìn)行儲(chǔ)存。在儲(chǔ)存第0、10、20、30、40天時(shí)，取出樣品放入蒸鍋中進(jìn)行復(fù)蒸 5 min。按1.2.3和1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及質(zhì)構(gòu)測(cè)定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.1作圖，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)用于兩組樣本之間的分析，當(dāng)差異分析P<0.05時(shí)，認(rèn)為其具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合乳酸菌添加量對(duì)米發(fā)糕感官品質(zhì)的影響

6組不同復(fù)合乳酸菌添加量發(fā)酵所得的米發(fā)糕的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見圖1。在滋味、香味和口感方面，乳酸菌發(fā)酵劑添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)為6%的米發(fā)糕感官評(píng)分較高，該樣品具有甘醇的米香和柔和的發(fā)酵風(fēng)味，而且酸甜適中；在形態(tài)與色澤方面，6組米發(fā)糕的感官評(píng)分差異不明顯。研究表明，乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵面團(tuán)的過程中，會(huì)產(chǎn)生乳酸，其可以提高米發(fā)糕中淀粉的凝膠度，降低米發(fā)糕的硬度[9]。但乳酸菌添加量過多會(huì)引起過度酸化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度降解，降低蛋糕的比容[16]。復(fù)配菌會(huì)影響酵母菌的產(chǎn)氣能力，引起米發(fā)糕內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；接菌量過大時(shí)，酵母產(chǎn)氣量與淀粉降解量均會(huì)超過臨界值，導(dǎo)致米發(fā)糕結(jié)構(gòu)坍塌。另外，微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)大米淀粉、蛋白質(zhì)等成分產(chǎn)生作用，呈味氨基酸比例增大，且以鮮味氨基酸比例增加最多，從而改變米發(fā)糕的香味、滋味[17]。綜合5項(xiàng)感官評(píng)價(jià)指標(biāo)可以得到：復(fù)合菌添加量為6%的米發(fā)糕感官得分最高。

圖1 不同復(fù)合乳酸菌添加量發(fā)酵米發(fā)糕的感官評(píng)價(jià)單項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分Fig.1 Single index score of fermented rice cake with different additions of lactic acid bacteria

2.2 復(fù)合乳酸菌添加量對(duì)米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表2可知，6組不同復(fù)合乳酸菌添加量發(fā)酵所得的米發(fā)糕在彈性和回復(fù)性上無顯著性差異(P>0.05)，復(fù)合乳酸菌添加量對(duì)米發(fā)糕膠著性的影響較小，僅在添加量為4%和6%間有顯著性差異(P<0.05)。硬度是評(píng)價(jià)糕點(diǎn)類食品最重要的指標(biāo)之一[18]，米發(fā)糕的硬度和咀嚼性與米發(fā)糕的品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[19]，口感柔軟的米發(fā)糕更受消費(fèi)者的喜愛。米發(fā)糕的蓬松結(jié)構(gòu)受酵母產(chǎn)氣量影響，而且淀粉被乳酸菌與酵母菌水解，其凝膠結(jié)構(gòu)的致密程度下降，引起硬度下降。隨著復(fù)合乳酸菌添加量的增加，米發(fā)糕的硬度和咀嚼性逐漸降低，質(zhì)構(gòu)發(fā)生明顯改變。但復(fù)合乳酸菌添加量過多會(huì)導(dǎo)致口感酸化、淀粉凝膠結(jié)構(gòu)松散，米發(fā)糕整體結(jié)構(gòu)坍塌，因此可認(rèn)為6%為米發(fā)糕較優(yōu)的復(fù)合乳酸菌添加量。

表2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑添加量對(duì)米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性的影響1)

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將采用6%的復(fù)合乳酸菌進(jìn)行米發(fā)糕發(fā)酵，并對(duì)其進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定及儲(chǔ)存特性分析。

2.3 復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定分析

采用HS- SPME- GC- MS分別對(duì)市售傳統(tǒng)米發(fā)糕和復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。米發(fā)糕風(fēng)味的形成由多種類型的化合物(如醇類、酯類和醛類)共同決定。由表3和圖2可知，共34種主要的揮發(fā)性成分被檢出，其中包括10種醇類、6種醛類、3種酯類和15種其他化合物。傳統(tǒng)米發(fā)糕與復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕均檢出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。傳統(tǒng)米發(fā)糕檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括：醇類8種、醛類4種、烷烴類1種、芳香烴類2種、其他類7種；復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)包括：醇類4種、醛類5種、酯類3種、烷烴類2種、酸類1種、芳香烴類1種、其他類6種。在兩組樣品中，相對(duì)含量最高的揮發(fā)性成分分別是醇類(傳統(tǒng)米發(fā)糕中相對(duì)含量為63.92%)和酯類(復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕中相對(duì)含量為40.37%)。

表3 傳統(tǒng)米發(fā)糕與復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕揮發(fā)性成分組成及相對(duì)含量

圖2 傳統(tǒng)米發(fā)糕與復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較Fig.2 Comparison of aroma compounds between traditional fermented rice cake and the lactic acid bacteria fermented rice cake

醇類物質(zhì)能賦予米發(fā)糕獨(dú)特的米香和水果醇香[20]，在兩組樣品中，2-甲基- 1-丁醇和苯甲醇是共有的醇類揮發(fā)性成分。苯甲醇是一種重要的香味成分，能使米發(fā)糕和饅頭等呈現(xiàn)新鮮的面包香味和玫瑰香[21]。酯類物質(zhì)，如乙酸乙酯，具有獨(dú)特的水果香味和花香味[22]，是中國(guó)米酒[23]和面包[24]的呈香物質(zhì)，但僅在復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕中被檢出。這可能是因?yàn)槿樗峋c酵母菌協(xié)同發(fā)酵，促進(jìn)了酯類物質(zhì)的生成。就醛類物質(zhì)而言，壬醛是兩組樣品共有的醛類物質(zhì)，其具有令人愉悅的柑橘香和花香[25]。在其他化合物中，丁基羥基甲苯是米漿中常見的化合物[26]，它在兩種樣品中均被檢出，但不呈現(xiàn)出特殊香氣[27]。乳酸菌發(fā)酵劑豐富了米發(fā)糕中的酸類和烷烴類揮發(fā)性成分，已有研究表明，乳酸菌是中國(guó)發(fā)酵食品中合成風(fēng)味的重要微生物[23]。

以上結(jié)果表明，傳統(tǒng)米發(fā)糕與復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面具有顯著性的差異，而發(fā)酵劑中的乳酸菌是引起該差異的主要原因。傳統(tǒng)的米發(fā)糕發(fā)酵劑中菌種優(yōu)勢(shì)菌為酵母菌[28- 29]，其發(fā)酵產(chǎn)生酒精，從而使傳統(tǒng)米發(fā)糕具有相對(duì)含量較高的醇類揮發(fā)性物質(zhì)。而在復(fù)合乳酸菌發(fā)酵過程中，乳酸菌與酵母菌具有協(xié)同作用，產(chǎn)生酯類等風(fēng)味物質(zhì)，因此改變了米發(fā)糕的風(fēng)味成分組成。

2.4 不同溫度及包裝方式對(duì)復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的影響

質(zhì)構(gòu)特性是衡量米發(fā)糕品質(zhì)和保質(zhì)期的一種重要指標(biāo)[30]。不同溫度及包裝方式對(duì)復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的影響情況如圖3所示。隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，3種包裝方式樣品的感官評(píng)分均持續(xù)下降。在第40天時(shí)，氣調(diào)包裝樣品的感官評(píng)分顯著高于其他兩組樣品(P<0.05)。在硬度和咀嚼性方面，隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，3組樣品的硬度和咀嚼性均逐漸增加。密封袋與真空組樣品咀嚼性分別達(dá)到88.37 N和59.03 N，而氣調(diào)組僅為36.79 N。該結(jié)果與Meng等[12]的研究一致，這可能是由于氣調(diào)包裝樣品內(nèi)部具有更多疏松的小孔結(jié)構(gòu)，而真空組樣品及密封袋裝樣品的孔洞不均勻，蓬松度下降且已失去彈性，咀嚼使其可吞咽所需的功更大。在相同的儲(chǔ)存溫度下，氣調(diào)包裝樣品表面具有更高的水分含量。氣調(diào)包裝有利于保持米發(fā)糕原有氣孔數(shù)量、大小、密度及淀粉等高分子鏈的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。淀粉老化是造成米發(fā)糕硬度增加的主要原因，因此，選擇合適的包裝方式可以有效減緩淀粉老化的速度。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

儲(chǔ)存溫度是影響米發(fā)糕硬度的重要因素之一[31]。在儲(chǔ)存時(shí)間為40 d時(shí)，感官評(píng)價(jià)僅在4 ℃和28 ℃兩組樣品之間存在顯著性差異(P<0.05)，感官評(píng)價(jià)分別為77分和86分。然而，儲(chǔ)存溫度顯著影響樣品的硬度和咀嚼性。4 ℃儲(chǔ)存的樣品在第40天的硬度和咀嚼性最高，分別達(dá)到53.97 N和46.90 N。28 ℃和37 ℃兩組樣品硬度分別為40.48 N和46.90 N，而在咀嚼性方面無顯著差異。這是因?yàn)榈矸劾匣瘷C(jī)制的主要因素是溫度[32]。淀粉的老化往往會(huì)導(dǎo)致米發(fā)糕品質(zhì)下降以及貨架期縮短[33]，淀粉凝膠在4 ℃下儲(chǔ)存比在 30 ℃時(shí)結(jié)晶更快[34]。如圖3(e)、3(f)所示，4 ℃組樣品的硬度和咀嚼性增加幅度比其他兩組更大。米發(fā)糕內(nèi)部分子分散相的凝聚、沉淀以及支鏈淀粉形成凝膠結(jié)構(gòu)體，都影響米發(fā)糕的松軟口感，增加硬度及咀嚼性。綜合考慮兩種情況，可以認(rèn)為：以氣調(diào)包裝(50%CO2+50%N2)，并儲(chǔ)存于28 ℃有利于保持復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

文中實(shí)驗(yàn)添加兩種乳酸菌作為發(fā)酵劑，與安琪酵母協(xié)同發(fā)酵米發(fā)糕，并對(duì)發(fā)酵菌添加量進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合乳酸菌添加量為6%時(shí)，米發(fā)糕的感官品質(zhì)較優(yōu)、口感松軟，在硬度和咀嚼性上有顯著改善。此外，由HS- SPME- GC- MS檢測(cè)出，復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕與傳統(tǒng)米發(fā)糕共有34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，兩組風(fēng)味物質(zhì)組成有明顯差異。復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的揮發(fā)性成分中具有更豐富的酯類化合物，因此，在米發(fā)糕發(fā)酵過程中，選擇乳酸菌作為復(fù)合發(fā)酵劑能有效提升米發(fā)糕的感官品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)復(fù)合乳酸菌米發(fā)糕的儲(chǔ)存特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，以氣調(diào)包裝并儲(chǔ)存于28 ℃可以減緩淀粉老化速度，保持米發(fā)糕較優(yōu)的口感和品質(zhì)，有利于米發(fā)糕的保存。但是本文在關(guān)于乳酸菌對(duì)米發(fā)糕淀粉老化方面的研究還不夠深入，今后可通過流變、食品物性分析、差示掃描量熱分析、低場(chǎng)核磁共振呈像分析等技術(shù)進(jìn)行下一步研究。