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    黃精多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

    2022-01-27 01:19:00王瑩李鋒濤黃美子陳毓盧軍鋒楊雨欣錢建中
    畜牧與獸醫(yī) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:超氧黃精液料

    王瑩,李鋒濤,黃美子,陳毓,盧軍鋒,楊雨欣,錢建中

    (江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

    黃精為百合科黃精屬植物,其干燥根莖為臨床常用大宗中藥材,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰,健脾,潤肺,益腎的功效。黃精是傳統(tǒng)的藥食同源類中藥,現(xiàn)代研究表明,黃精除用于治療脾胃虛弱、干咳少痰、精血不足等癥,還具有降血壓、防止動脈粥樣硬化、延緩衰老等作用[1-2]。黃精的主要成分有多糖、生物堿、氨基酸等。黃精多糖作為黃精的主要活性成分之一,具有增強(qiáng)免疫功能、抑菌抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂等藥理作用。目前,國內(nèi)對黃精多糖的研究主要集中在降血糖藥物和畜禽免疫增強(qiáng)劑方面[3-5]。Xie等[5]研究發(fā)現(xiàn),黃精多糖對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用,降糖效果好。趙謹(jǐn)?shù)萚6]研究表明,黃精多糖能通過提高雛雞的抗氧化能力,提高血清中免疫球蛋白含量,提高胸腺、法氏囊和脾臟的免疫功能等途徑來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。

    近年來,國內(nèi)多采用水提醇沉法[7]、微波輔助法[8]、超聲波輔助法[9]、酶輔助提取法[10]等提取多糖。且已有學(xué)者研究了黃精多糖的提取工藝,但普遍存在著多糖得率較低的問題[11]。李志濤等[8]采用微波輔助法提取黃精多糖,通過單因素試驗對影響黃精多糖得率的物料粒度、料液比、微波輻照功率、輻照時間進(jìn)行探討,確定最佳工藝參數(shù)下黃精多糖的得率僅為10.57%;林志鑾等[9]采用超聲波輔助法提取粗多糖,黃精多糖含量為108.57 mg/g;張梓原等[12]比較了水提醇沉法和復(fù)合酶法兩種不同提取工藝對黃精多糖得率的影響,研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合酶法得到的多糖得率遠(yuǎn)高于水提醇沉法的多糖得率。為了進(jìn)一步提高黃精多糖得率,本文擬采用超聲輔助復(fù)合酶法提取黃精多糖,考察液料比、加酶量、超聲功率以及酶解pH值對黃精多糖得率的影響,通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化其工藝參數(shù);同時研究黃精多糖的體外抗氧化活性,為黃精多糖的開發(fā)和利用提供了參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑

    黃精,購自安徽亳州千草藥業(yè)有限公司,60 ℃下真空干燥,經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎,過80目篩,所得黃精粉末密封貯藏,備用;葡萄糖對照品購自中國食品藥品檢定研究院;維生素C(VC)購自上海生工生物工程有限公司,纖維素酶(1.1×105U/g)購自和氏璧生物科技有限公司;果膠酶(5×104U/g)購自和氏璧生物科技有限公司;其余均為市售分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以無水葡萄糖為對照品,采用苯酚-硫酸顯色法測定多糖濃度,以吸光度(y)為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

    1.3 黃精多糖的提取及測定

    稱取10 g黃精粉末于500 mL具塞錐形瓶中,按照一定的液料比加入一定pH值的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液,混勻,加入適量的纖維素酶與果膠酶,50 ℃酶解,放入超聲清洗器中以一定的功率處理30 min,熱水浸提,抽濾,收集濾液,旋轉(zhuǎn)濃縮,加入足量乙醇溶液,4 ℃醇沉過夜,4 000 r/min離心15 min得沉淀,干燥后即得黃精粗多糖樣品。

    將黃精粗多糖用蒸餾水溶解,定容至250 mL,精密量取1 mL 黃精多糖溶液于250 mL 容量瓶中,加入5%苯酚水溶液1 mL、搖勻后加入5 mL濃硫酸,定容,搖勻,靜置30 min,在490 nm 處測定吸光度,根據(jù)下列公式計算黃精多糖得率。

    式中:m為黃精粉末的質(zhì)量(mg);A490為稀釋后的多糖溶液的吸光度;前一個250為稀釋倍數(shù);后一個250為黃精多糖溶液體積(mL)。

    1.4 單因素試驗

    在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1),超聲功率320 W,酶解pH值 5.0條件下,考察不同液料比(mL/g)5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1對黃精多糖得率的影響;在液料比20∶1,超聲功率320 W,酶解pH值5.0條件下,考察酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對黃精多糖得率的影響;在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1),液料比20∶1,酶解pH值 5.0條件下,考察超聲功率(240、280、320、360、400 W)對黃精多糖得率的影響;在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1),液料比20∶1,超聲功率320 W條件下,考察酶解pH值(3、4、5、6、7)對黃精多糖得率的影響。以上每個試驗均平行測定3次。

    1.5 響應(yīng)面優(yōu)化黃精多糖提取工藝

    根據(jù)單因素分析結(jié)果,以液料比(A)、加酶量(B)、超聲功率(C)、酶解pH值(D)為自變量,以黃精多糖得率為響應(yīng)值(Y),采用Box-benhnken試驗設(shè)計法進(jìn)一步優(yōu)化黃精多糖提取工藝。分析因素及水平編碼表見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗分析因素與水平

    1.6 黃精多糖抗氧化作用試驗

    1.6.1 DPPH自由基清除能力測定

    參照Shimada等[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn),配制 0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL 黃精多糖水溶液,準(zhǔn)確移取0.20 mL 不同濃度的黃精多糖水溶液于比色管中,加入預(yù)先配置好0.15 mmol/L DPPH 甲醇溶2 mL液,搖勻后暗處放置30 min,以樣品溶劑為空白,測定其上清液515 nm波長處吸光度 A,同時測定樣品溶液在 515 nm 處的吸光度 A0及 DPPH 甲醇溶液在 515 nm 處的吸光度A1[7],VC作為陽性對照,平行測定3次,求平均值。按下式計算黃精多糖DPPH自由基清除率。

    1.6.2 超氧自由基清除率測定

    參照龔霞等[14]的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn),配制0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL黃精多糖水溶液,準(zhǔn)確移取0.20 mL 不同濃度的黃精多糖提取液于比色管中,加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH值 8.2)和4 mL 20 mmol/L的鄰苯三酚溶液,搖勻后,25 ℃水浴反應(yīng)10 min,加入1% HCl溶液4 mL,于325 nm處測定吸光度(Ax),以相同體積蒸餾水作為空白對照,測定空白對照組吸光度A0,VC作為陽性對照,平行測定3次,求平均值。按下式計算黃精多糖超氧自由基清除率。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    采用Design-Expert 10.0.3、Excel 2016等軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行線性回歸,得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.014 2x-0.006 9,R2=0.996 5,表明在10.56~52.80 μg/mL濃度范圍內(nèi),葡萄糖濃度與其吸光度具有良好的線性關(guān)系。

    2.2 單因素試驗

    液料比:由圖1A可知,隨著液料比的增加,多糖得率先升高再降低,當(dāng)液料比為20∶1時,多糖得率最高,故選擇15∶1、20∶1和25∶1進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

    加酶量:由圖1B可知,隨著加酶量的增多,多糖得率逐步提高,后趨于穩(wěn)定,當(dāng)加酶量超過1.5%后,多糖得率變化不大。故選擇1.0%、1.5%和2.0%進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

    超聲功率:由圖1C可知,隨著超聲功率的增加,黃精多糖得率逐步提高,當(dāng)超聲功率大于360 W時,黃精多糖得率幾乎不變。故選擇320 、360和400 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

    酶解pH值:由圖1D可知,隨著酶解pH的增加,多糖得率先增大后減小,當(dāng)酶解pH值在4.0~6.0范圍內(nèi),黃精多糖得率較高。故選擇4.0、5.0和6.0水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

    A. 液料比(mL/g);B. 加酶量;C. 超聲功率;D. 酶解pH值圖1 各因素對黃精多糖得率的影響

    2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

    2.3.1 黃精多糖得率的數(shù)學(xué)模型建立

    根據(jù)單因素分析結(jié)果,以液料比(A)、加酶量(B)、超聲功率(C)、酶解pH值(D)為自變量,以黃精多糖得率為響應(yīng)值(Y),采用Box-Benhnken試驗設(shè)計法進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

    通過Design-Expert 10.0.3軟件將模型進(jìn)行分析,擬合得到影響黃精多糖得率的回歸方程: 得率Y=27.67+0.46A+0.75B+0.34C+0.55D+0.13AB-0.29AC-0.095AD+0.14BC-0.26BD-0.058CD-0.85A2-3.37B2-2.36C2-4.07D2。

    表3 回歸模型方差分析

    2.3.2 黃精多糖得率的響應(yīng)面分析

    響應(yīng)面的陡峭程度反映了不同因素對黃精多糖得率的影響程度,響應(yīng)面越陡,說明該因素對結(jié)果的影響越大[15]。圖2A~圖2F表示各影響因素兩兩作用對黃精多糖得率的交互影響,其中加酶量對黃精多糖得率影響最大,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面最陡,之后影響因素依次為酶解pH值、液料比、超聲功率,與上述方差分析結(jié)果一致。

    A. 超聲功率360 W,酶解pH值5.0;B. 加酶量1.5%,酶解pH值5.0;C. 加酶量1.5%,超聲功率360 W;D. 液料比20∶1,酶解pH值5.0;E. 液料比20∶1,超聲功率360 W;F. 液料比20∶1,加酶量1.5%圖2 各因素交互影響多糖得率的曲面圖

    2.3.3 模型驗證

    通過建立的模型預(yù)測黃精多糖最佳提取工藝為:液料比為21.322∶1(mL/g),加酶量1.558%,超聲功率362.32 W,酶解pH值5.061,其得率為27.81%,考慮試驗操作的可控性,對上述最優(yōu)提取工藝進(jìn)行修正:液料比為21∶1(mL/g),加酶量1.6%,超聲功率360 W,酶解pH值5.0。在此條件下進(jìn)行驗證試驗,平行測定3次,黃精多糖平均得率為27.02%,與預(yù)測值27.81%較為接近,表明該模型能夠預(yù)測黃精多糖的提取工藝,模型可靠。

    2.4 黃精多糖抗氧化作用分析

    2.4.1 清除DPPH自由基能力

    由圖3可知,VC對DPPH的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黃精多糖。黃精多糖的清除能力與其濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,即隨著黃精多糖濃度的增加,其清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng),且趨于平緩,當(dāng)黃精多糖濃度達(dá)到2.00 mg/mL時,黃精多糖對DPPH的清除能力達(dá)到78.56%。對試驗結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出方程:Y=35.571X+11.619,R2=0.967 6,根據(jù)方程計算出黃精多糖對DPPH半清除率IC50為1.08 mg/mL。

    圖3 黃精多糖和VC對DPPH自由基的清除作用

    2.4.2 清除超氧自由基能力

    黃精多糖和VC對超氧自由基的清除作用如圖4所示,在0.40~2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi),黃精多糖對超氧自由基有一定的清除能力,且隨著濃度的增加而增強(qiáng),清除率由34.25%增加至74.78%,而同濃度的VC對超氧自由基的保持較高的清除率,由88.25%增加至94.38%,且趨于平緩。對試驗結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出方程:Y=27.089X+24.924,R2=0.951 7,根據(jù)方程計算出黃精多糖對超氧自由基半清除率IC50為0.93 mg/mL。

    圖4 黃精多糖和VC對的清除作用

    3 討論

    水提醇沉法是多糖傳統(tǒng)的提取方法,但提取效率較低,耗時較長,不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。近年來,隨著生物科技的迅猛發(fā)展,新的多糖提取方法也逐步完善。酶解輔助提取法具有反應(yīng)條件溫和,提取效率高等優(yōu)點,該法常用的酶主要有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶以及相關(guān)復(fù)合酶等;超聲提取法能夠縮短提取時間,加速多糖的溶出速度,但超聲時間不宜過長,否則會引起多糖的降解,影響多糖得率。為了提高黃精多糖的得率,本試驗利用超聲輔助復(fù)合酶法提取黃精多糖,針對影響黃精多糖得率的液料比、加酶量、超聲功率和酶解pH值4個因素進(jìn)行單因素試驗,采用響應(yīng)曲面法確定最佳工藝參數(shù)為:10 g黃精粉末,液料比為21∶1(mL/g),加酶量1.6%,超聲功率360 W,酶解pH值5.0,黃精多糖得率可達(dá)27.02%,是普通水提法的3.75倍[16],與苑璐等[10]采用纖維素酶和木瓜蛋白酶提取黃精多糖相比,多糖得率提高了6.47%,這可能是由于超聲輔助提取黃精多糖,更有利于加快多糖的溶出速度,在一定程度上提高黃精多糖的得率;與巫永華[17]采用超聲微波協(xié)同單一酶法提取黃精多糖相比,多糖得率提高了9.59%,這可能是由于不同酶的作用位點不同,選擇合適的復(fù)合酶,較單一的酶,更有利于多糖的溶出。目前,低共熔溶劑法被廣泛應(yīng)用于多糖提取,該法具有性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點,適用于工業(yè)化生產(chǎn),汪濤等[18]采用尿素-氯化膽堿低共熔溶劑提取黃精多糖,采用響應(yīng)面法確定最佳工藝參數(shù),在此條件下黃精多糖得率為18.55%,但較本試驗黃精多糖得率低8.47%。

    在響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃精多糖工藝中,加酶量對多糖得率影響最大,這可能是由于加入的纖維素酶和果膠酶越多,酶與多糖的結(jié)合點越多,加速細(xì)胞壁溶解,有利于多糖的溶出[19];之后影響因素依次是酶解pH值、液料比和超聲功率, pH 值過高或過低,均會降低酶的活性,細(xì)胞破壁程度降低,影響胞內(nèi)多糖的滲出[20];液料比越大,黃精細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差越大,傳質(zhì)推動力越大,黃精多糖就越容易浸出[7],但當(dāng)料液比過高時,減少了樣品與酶的接觸,影響了多糖得率;超聲功率越大,超聲產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”破壞細(xì)胞壁,降低傳質(zhì)阻力,提高多糖的溶出速度[21],但當(dāng)功率過大時,可能會導(dǎo)致溫度升高,影響酶的活性。然而在復(fù)合酶法提取多糖的過程中,由于不同水解酶的pH值和溫度不一樣,故復(fù)合酶中水解酶的選擇和用量配比還需進(jìn)一步研究。

    黃精多糖對DPPH自由基和超氧自由基的半清除率(IC50)分別為1.08 mg/mL、0.93 mg/mL,且其對DPPH自由基和超氧自由基清除率隨著濃度增加而增強(qiáng),表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系,當(dāng)黃精多糖濃度達(dá)到2.00 mg/mL時,其清除率達(dá)到78.56%和74.78%。綜上所述,黃精多糖具有良好的抗氧化活性,后續(xù)試驗將對黃精多糖的結(jié)構(gòu)和功效進(jìn)行探究,有助于加快黃精多糖制劑的開發(fā),為研制新獸藥奠定基礎(chǔ)。

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