菌株接種比例和碳源對大豆皮發(fā)酵的影響

丁立人，李英英，劉淇，朱崇淼，杭蘇琴*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)類國家級實驗動物中心，江蘇 南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇 南京 210095；3. 南京致潤生物科技有限公司，江蘇 南京 211200)

大豆皮是大豆加工過程中的副產(chǎn)物，預(yù)計至2030年全球產(chǎn)量可達(dá)2 970～3 710萬t[1]，我國每年大豆皮的產(chǎn)量約1 200多萬t[2]。大豆皮因產(chǎn)量高，纖維含量高(32%～38%)，含有10%左右的粗蛋白，且價格低廉成為畜禽潛在的飼料資源[2]。但大豆皮過高的纖維水平又限制了在畜禽飼料中的推廣和應(yīng)用，尤其是在單胃動物飼料上應(yīng)用的潛力。目前，提高飼料營養(yǎng)價值、降低飼料抗?fàn)I養(yǎng)成分的常見處理方法有物理法、化學(xué)法，酶制劑處理法和微生物發(fā)酵法[3-4]，其中微生物發(fā)酵因其操作簡單，安全環(huán)保，并且微生物可代謝產(chǎn)生有益物質(zhì)而廣泛應(yīng)用在飼料生產(chǎn)中。

微生物發(fā)酵指利用特定的微生物，在適宜的條件下，將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為動物機(jī)體所需要產(chǎn)物的過程，其發(fā)酵水平與菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件十分有關(guān)[5]。常用于發(fā)酵的菌種有細(xì)菌，如乳酸菌和芽孢桿菌，真菌如酵母菌和霉菌[6]。乳酸菌發(fā)酵可通過產(chǎn)生乳酸降低pH值，抑制病原菌生長，延長飼料保質(zhì)期[7]；芽孢桿菌發(fā)酵主要是分泌酶的能力較強，可分泌纖維素酶等降解纖維素和半纖維素[8]；酵母菌是天然的發(fā)酵劑，能改變原料風(fēng)味，還可將纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體蛋白[9]。并且在微生物發(fā)酵時適當(dāng)補充碳、氮源，可顯著促進(jìn)菌株生長，提高發(fā)酵效果[10-11]。目前，發(fā)酵大豆皮的研究還較少，如適合發(fā)酵的菌種(株)、單菌或復(fù)合菌發(fā)酵、發(fā)酵菌株的接種比例、以及輔料添加等都還尚不清楚。

因此本試驗利用實驗室前期篩選的菌株，研究各純菌株以大豆皮為唯一碳源的生長特性，以及各菌株復(fù)合比例和不同碳源(麩皮、玉米粉)對大豆皮發(fā)酵的影響，以期提高大豆皮的營養(yǎng)價值，改善其品質(zhì)，為提高大豆皮的利用率提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

大豆皮、麩皮、玉米粉均由江蘇省南通市青禾雜糧合作社提供，粉碎后過40目備用。

1.2 試驗菌株的解凍及活化

將實驗室前期-20 ℃保存的植物乳桿菌LY19(LactobacillusplantarumLY19)、納豆芽孢桿菌ND1(BacillusnattoND1)和釀酒酵母菌NJ(SaccharomycescerevisiaeNJ)解凍，分別按1%接種量接種于MRS、LB和YPD培養(yǎng)基中(均購自青島海博生物有限公司)，37 ℃培養(yǎng)24 h，再按照同樣方式進(jìn)行二次活化，獲得植物乳桿菌LY19、納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母NJ的種子液用于后續(xù)試驗，菌株活菌數(shù)為108～109CFU/mL。

1.3 各試驗菌株以大豆皮為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵

將 10 g 大豆皮、20 mL水加入發(fā)酵瓶中混勻、滅菌，將上述活化的3種菌株的菌液分別以1%接種至大豆皮和各菌株培養(yǎng)基中，最終大豆皮與水的比例為1∶2，37 ℃培養(yǎng)48 h，試驗組為各純菌株+大豆皮，對照組為各純菌株+特異培養(yǎng)基，每組3個重復(fù)，發(fā)酵結(jié)束后分析發(fā)酵底物的產(chǎn)氣量、pH值、乳酸濃度和各菌株的活菌數(shù)。

1.4 3株試驗菌株以不同接種比例發(fā)酵大豆皮

試驗分為5組，對照組為無菌水(20 mL)+大豆皮，試驗Ⅰ組為植物乳桿菌LY19∶納豆芽孢桿菌ND1∶釀酒酵母菌NJ=1∶1∶1，試驗Ⅱ組為植物乳桿菌LY19∶納豆芽孢桿菌ND1∶釀酒酵母菌NJ=1∶10∶1，試驗Ⅲ組為植物乳桿菌LY19∶納豆芽孢桿菌ND1∶釀酒酵母菌NJ=1∶1∶10，試驗Ⅳ組為植物乳桿菌LY19∶納豆芽孢桿菌ND1∶釀酒酵母菌NJ=1∶10∶10，每組4個重復(fù)。將 10 g 大豆皮、19.7 mL的無菌水加入發(fā)酵瓶中混勻、滅菌，將上述活化的3株菌液，根據(jù)試驗分組中各菌株的數(shù)量比例接種至大豆皮中，接種菌液量0.3 mL，最終大豆皮與水的比例為1∶2，37 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)束后分析發(fā)酵底物中各菌株的活菌數(shù)，大豆皮殘渣的蛋白及纖維等成分，篩選合適的菌株復(fù)合比例用于后續(xù)試驗。

1.5 3株試驗菌株以不同碳源為輔料發(fā)酵大豆皮

試驗分為5 組，對照組為無菌水(20 mL)+大豆皮，試驗Ⅰ組為1.4中篩選的合適比例的3株復(fù)合菌(M)+大豆皮+10%麩皮，試驗Ⅱ組為M+大豆皮+10%玉米粉，試驗Ⅲ組為M+大豆皮+5%麩皮+5%玉米粉，試驗Ⅳ組為M+大豆皮+2%葡萄糖(陽性對照)，每組4個重復(fù)。將 10 g大豆皮和適量水加入發(fā)酵瓶中，再根據(jù)以上分組分別添加適當(dāng)比例的麩皮和玉米粉，加19.7 mL的無菌水混勻，進(jìn)行滅菌，然后將3株菌按上述篩選的合適比例混合后再按3%的量接種至大豆皮中，最終大豆皮與水的比例為1∶2，37 ℃培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后分析發(fā)酵底物的pH值、乳酸濃度和各菌株的活菌數(shù)，大豆皮殘渣的蛋白及纖維物質(zhì)等成分，篩選出適于復(fù)合菌發(fā)酵大豆皮的碳源。

1.6 測定指標(biāo)及方法

發(fā)酵結(jié)束后，直接用pH值測定儀測定發(fā)酵液的pH值，活菌數(shù)用稀釋涂布平板法檢測；發(fā)酵液的乳酸含量嚴(yán)格按照乳酸試劑盒(南京建成:A019-2-1)測定，大豆皮殘渣的粗蛋白含量用凱氏定氮法測定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量用濾袋法測定[12]。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)模型分析，Tukey’s-b法進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株以大豆皮為唯一碳源的生長特性

從圖1可以看出，植物乳桿菌LY19以大豆皮為唯一碳源生長時，雖然48 h 產(chǎn)氣量只有2.33 mL，但乳酸濃度達(dá)到74.49 mmol/L，顯著高于納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ(P<0.05)；植物乳桿菌LY19組的pH值為5.73，顯著低于釀酒酵母菌NJ和對照組(P<0.05)，說明植物乳桿菌LY19以大豆皮為培養(yǎng)基時，可進(jìn)行生長并產(chǎn)酸。

A．產(chǎn)氣量;B. 活菌數(shù);C. pH值;D. 乳酸濃度；ND表示未能檢測出結(jié)果；柱上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 各菌株以大豆皮為唯一碳源的生長特性

納豆芽孢桿菌ND1以大豆皮為唯一碳源生長時，全程幾乎不產(chǎn)氣，48 h 乳酸濃度只有13.65 mmol/L，pH值為5.91，活菌數(shù)為7.91 lg CFU/g，與對照組相比雖有一定差異(P<0.05)，但仍表明納豆芽孢桿菌ND1不能以大豆皮為唯一碳源很好地生長。釀酒酵母菌NJ以大豆皮為唯一碳源生長時，產(chǎn)氣量是3株菌中最高的，說明酵母菌可在大豆皮中生長發(fā)酵，但釀酒酵母在生長發(fā)酵過程中并產(chǎn)生乳酸，因此底物大豆皮的pH值無變化。

2.2 接種比例對菌株生長和大豆皮主要成分的影響

表1看出，當(dāng)3種菌接種比例為1∶1∶10時，活菌數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05)，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著低于對照組(P<0.05)，粗蛋白含量與其他組之間無顯著差異，但高于對照組，表明3株菌的接種比例為1∶1∶10發(fā)酵對大豆皮的營養(yǎng)價值產(chǎn)生了積極影響，綜合考慮各指標(biāo)，選擇1∶1∶10比例進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 接種比例對菌株生長和大豆皮主要成分的影響

2.3 菌株以不同碳源為輔料對大豆皮發(fā)酵的影響

表2可以看出，葡萄糖是各菌株生長時最容易利用的單糖，因此以該組為陽性對照組，評價麩皮、玉米粉為輔料時混合菌對大豆皮發(fā)酵的影響。各試驗組產(chǎn)氣量、乳酸濃度均顯著低于葡萄糖組(P<0.05)，乳酸桿菌活菌數(shù)各組間差異不顯著(P>0.05)；麩皮組的芽孢桿菌和酵母菌活菌數(shù)顯著高于玉米粉組和麩皮、玉米粉混合組(P<0.05)，與葡萄糖組差異不顯著(P>0.05)；麩皮組的中性洗滌纖維含量顯著低于對照組(P<0.05)，與葡萄糖組、玉米粉組差異不顯著(P>0.05)，但高于麩皮、玉米粉混合組(P<0.05)；麩皮組的酸性洗滌纖維含量顯著低于對照組(P<0.05)，但與其他組差異不顯著(P>0.05)；麩皮組粗蛋白顯著高于對照組，低于其他組(P<0.05)，但玉米粉組和麩皮、玉米粉組發(fā)酵后出現(xiàn)了結(jié)塊現(xiàn)象，發(fā)酵過程中底物出現(xiàn)結(jié)塊易導(dǎo)致雜菌的生成。綜合考慮各指標(biāo)，10%麩皮更適合作為碳源用于復(fù)合菌發(fā)酵大豆皮。

表2 菌株以不同碳源為輔料對大豆皮發(fā)酵的影響

3 討論

3.1 各菌株以大豆皮為唯一碳源的生長特性

發(fā)酵飼料的品質(zhì)好壞與微生物種類、自身特點和發(fā)酵條件密不可分。本試驗所選用3株菌是前期實驗室篩選其各自特異培養(yǎng)基上的生長性能獲得。乳酸桿菌生長良好的表現(xiàn)就是乳酸產(chǎn)量和活菌數(shù)。飼料被微生物發(fā)酵的直觀表現(xiàn)是產(chǎn)氣，本研究所用植物乳桿菌LY19以大豆皮為碳源生長時產(chǎn)氣量僅有2.33 mL，產(chǎn)生的乳酸濃度只有74 mmol/L，其濃度僅為MRS培養(yǎng)基的一半，說明植物乳桿菌LY19在大豆皮中的生長不如在培養(yǎng)基中的生長，其原因可能是大豆皮中菌株生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)較少；芽孢桿菌因分泌酶類和抗菌物質(zhì)而受關(guān)注，發(fā)酵大豆皮時所需芽孢桿菌有較好的分泌纖維素酶的能力，本試驗所用納豆芽孢桿菌ND1產(chǎn)生的纖維素酶活達(dá)24.51 FPU/mL[13]，當(dāng)納豆芽孢桿菌ND1以大豆皮為培養(yǎng)基培養(yǎng)時，產(chǎn)氣量更低，無法檢測出來，這可說明納豆芽孢桿菌ND1不能很好利用大豆皮產(chǎn)生纖維素酶；釀酒酵母菌NJ以大豆皮為碳源生長時，產(chǎn)氣量為23 mL顯著高于其特異培養(yǎng)基。以上結(jié)果說明，這3株純菌株不能以大豆皮為碳源良好地生長，但植物乳桿菌LY19在3株菌中相對生長較好。大豆皮主要由40%～45%的纖維素，30%～35%木聚糖，9%～12%蛋白質(zhì)和1%～4%木質(zhì)素組成[14]，本試驗3株菌的碳源主要是糖類，這可能是3株菌不能以大豆皮為碳源生長良好的主要原因。

3.2 菌株不同接種比例對大豆皮發(fā)酵的影響

菌株接種比例，即發(fā)酵體系中各類有效活菌數(shù)，也是影響發(fā)酵效果的重要因素之一，菌種接種比例過低或過高都會影響底物中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，最終影響發(fā)酵飼料的質(zhì)量[15]。本試驗用植物乳桿菌LY19、納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ單一菌株發(fā)酵大豆皮時，各菌株在大豆皮中的生長性能較差，因此，不能用單一菌來發(fā)酵大豆皮。復(fù)合菌株之間可能存在共生協(xié)同關(guān)系，能幫助微生物更好地適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境系統(tǒng)[16]。還有研究報道，在以乳酸菌等細(xì)菌為發(fā)酵菌株時，發(fā)酵體系中初始活菌數(shù)在1×108～1×109CFU/g時，發(fā)酵效果最好[17-18]。所以本試驗3株菌發(fā)酵初始活菌數(shù)均為1×108CFU/g，最終以植物乳桿菌LY19∶納豆芽孢桿菌ND1∶釀酒酵母菌NJ接種比例為1∶1∶10發(fā)酵效果最好，這可能與3株菌的之間存在協(xié)同作用有關(guān)，納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ發(fā)酵時消耗大量氧氣[19]，可以為植物乳桿菌 LY19生長創(chuàng)造厭氧環(huán)境，納豆芽孢桿菌ND1生長過程中還能產(chǎn)生纖維素酶降解大豆皮中的纖維生成單糖[20]，而釀酒酵母菌NJ則可以利用芽孢桿菌產(chǎn)生的單糖進(jìn)行生長，產(chǎn)生菌體蛋白，從而提高大豆皮中蛋白含量[21]。有研究表明，用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)可以去除豆粕中的蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而提高豆粕的飼用價值[22]。因此，合適比例的3株菌復(fù)合能一定程度地促進(jìn)大豆皮的發(fā)酵。

3.3 不同碳源為輔料對大豆皮發(fā)酵的影響

麩皮和玉米粉常被用作飼料生物發(fā)酵時的補充碳源，麩皮富含20%可溶性纖維，可為微生物的生長提供養(yǎng)分，還可減少底物的成團(tuán)現(xiàn)象，增加發(fā)酵基質(zhì)的透氣性，從而有利于微生物生長[23]。玉米粉含有70%的淀粉，發(fā)酵大豆皮時添加適量的麩皮或玉米粉，可適當(dāng)彌補可消化糖類的不足，有利于發(fā)酵[24]。童鑫等[25]用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗渣時加入碳源、氮源和無機(jī)鹽，顯著地提高了棗渣的蛋白水平。本試驗中，添加10%的麩皮顯著促進(jìn)了3株菌的生長，活菌數(shù)、乳酸產(chǎn)量在所有試驗組中最高，pH值最低；同時，大豆皮的粗蛋白提高了19.98%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別降低了11.43%和14.17%，雖然麩皮、玉米粉組的粗蛋白提高，但其發(fā)酵過后的底物過黏，形成結(jié)塊，不利于微生物的發(fā)酵，容易滋生其他雜菌，這可能與玉米粉淀粉含量過高，發(fā)酵過程淀粉遇水凝結(jié)成塊年在一起[23]，從而影響了發(fā)酵基質(zhì)的疏松性和通氣性有關(guān)。此外，玉米粉過高的淀粉含量易使微生物生長的碳氮比不平衡，直接影響菌體的生長和代謝，當(dāng)碳氮比偏小，會導(dǎo)致菌體生長過剩，易造成菌體提前衰老自溶；碳氮比過大，菌體繁殖數(shù)量少，發(fā)酵活菌數(shù)密度低[26-27]。因此，10%的麩皮作為大豆皮發(fā)酵的輔料可使微生物能在大豆皮中較好的生長，并且提高了大豆皮的粗蛋白含量，降低了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量，使大豆皮的營養(yǎng)價值得到了提升。

4 結(jié)論

植物乳桿菌LY19、納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ純菌株發(fā)酵大豆皮時，各菌株生長較差，當(dāng)3株菌以1∶1∶10接種比例、10%麩皮作為大豆皮發(fā)酵的輔料粗蛋白提高了19.98%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別降低了11.43%和14.17%，使大豆皮的營養(yǎng)價值得到一定改善，可使大豆皮作為飼料添加到畜禽日糧中。