發(fā)酵豆渣工藝的優(yōu)化及對營養(yǎng)成分的影響

范陽，齊偉彪，朱崇淼，毛勝勇*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京致潤生物科技有限公司，江蘇 南京 211124)

我國是一個畜牧生產(chǎn)大國，但同時也是一個飼料資源十分短缺的國家。據(jù)國家統(tǒng)計局報告顯示，2020年，我國從國外進(jìn)口玉米和大豆總量近11 163萬t，而國內(nèi)一些非常規(guī)飼料資源如豆渣等并未得到充分應(yīng)用。因此，提高非常規(guī)飼料資源的利用率，對于緩解我國飼料資源短缺的意義重大[1]。豆渣是豆腐、豆?jié){等豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大。據(jù)報道，我國每年約產(chǎn)280萬t濕豆渣[2]。豆渣營養(yǎng)豐富，但由于其含水量大(70%～80%)，處理不當(dāng)極易酸敗變質(zhì)，難以運(yùn)輸和貯存，這不僅限制了豆渣在飼料中的使用，而且造成了環(huán)境污染[3]。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，使用微生物發(fā)酵技術(shù)有助于解決鮮豆渣使用過程中出現(xiàn)的問題[4]。Gupta等[5]研究發(fā)現(xiàn)，利用植物乳桿菌和少孢根霉混合發(fā)酵豆渣，可提高豆渣中單糖、短鏈脂肪酸等的小分子化合物的含量。Mok等[6]研究發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌WX-17發(fā)酵豆渣，總氨基酸含量由發(fā)酵前的3.04 mg/g增加到了5.41 mg/g，且抗氧化物含量提高了6.4倍。Vong等[7]利用解脂耶氏酵母發(fā)酵新鮮豆渣，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸的含量較發(fā)酵前增加了254%，且可溶性膳食纖維增加了176%，有效改善了豆渣適口性，同時還產(chǎn)生了發(fā)酵香氣。因此，為提高豆渣的飼用價值，解決其存在的難長期貯存等問題。本試驗(yàn)擬利用基于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的混合菌發(fā)酵主要含豆渣的混合飼料，研究豆渣發(fā)酵飼料制作過程中的相關(guān)參數(shù)，同時比較豆渣飼料發(fā)酵前后的營養(yǎng)價值，從而為發(fā)酵豆渣飼料的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與菌種

發(fā)酵底物為豆渣和麩皮的混合物，二者的干物質(zhì)比例為8∶2。為保證不同發(fā)酵批次之間所用的豆渣的營養(yǎng)價值穩(wěn)定，本試驗(yàn)采用的豆渣為干豆渣，但在發(fā)酵過程中，根據(jù)發(fā)酵要求將其水分按實(shí)驗(yàn)設(shè)計做出相應(yīng)調(diào)整，以模仿生產(chǎn)中的濕豆渣。植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母皆來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院消化道微生物實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)用培養(yǎng)基購自奧博星公司(北京)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵種子液的制備

將凍存的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母分別接種于各菌種對應(yīng)的液體種子培養(yǎng)基中，其中植物乳桿菌活化采用MRS培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌活化采用LB培養(yǎng)基，釀酒酵母活化采用YPD培養(yǎng)基，將植物乳桿菌置于37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，枯草芽孢桿菌置于37 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h，釀酒酵母置于30 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h。按1%的接種量將上述培養(yǎng)好的菌液接種到滅菌后的各菌種液體種子培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液(植物乳桿菌的活菌數(shù)為8.96 lg CFU/mL；枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為8.21 lg CFU/mL；釀酒酵母的活菌數(shù)為7.70 lg CFU/mL)。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵方法

將上述混合好后的豆渣和麩皮分裝至帶有單向透氣閥的聚乙烯袋(規(guī)格為 300 mm×200 mm)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液按一定的接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后封口，每袋500 g，37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.3 混菌發(fā)酵豆渣菌種比例優(yōu)化

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，將各菌種按3個接種量進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，每個水平4個重復(fù)。按10%的接種量，在37 ℃、含水量為55%的固體發(fā)酵培養(yǎng)基(自然pH值)上發(fā)酵48 h，以發(fā)酵產(chǎn)物的pH值、活菌數(shù)(乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌)、乳酸(lactic acid, LA)、揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)、還原糖(reducing sugar, RC)和總氮中氨態(tài)氮(NH3-N)的占比含量為指標(biāo)，確定發(fā)酵豆渣飼料時各菌種的最佳接種比例(表1)。

表1 接種菌種的最適比例的正交試驗(yàn)設(shè)計

1.4 發(fā)酵豆渣飼料的工藝條件優(yōu)化

在確定3個菌種最佳接種配比之后，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，將接種量(A)、發(fā)酵時間(B)、固體發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量(C)、發(fā)酵溫度(D)4個因素進(jìn)行優(yōu)化，每個因素設(shè)3個水平，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)(表2)。

表2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 發(fā)酵指標(biāo)的測定

開袋后混勻各處理組的發(fā)酵產(chǎn)物，取發(fā)酵產(chǎn)物10 g，加入90 mL蒸餾水，攪拌混勻，置于4 ℃冰箱保存，樣品浸泡24 h后過濾，得到的濾液即為樣品的浸提液。浸提液一部分用來測定pH值，一部分置于-20 ℃下保存，用于測定LA、VFA、RC和NH3-N含量。采用HI-9024C便攜式pH計(HANNA Instruments,美國)測定pH值，采用乳酸試劑盒(南京建成生物科技有限公司，南京)測定LA含量，采用氣相色譜(GC-14B，島津，日本)測定VFA的含量[8]，采用苯酚—次氯酸鈉法測定NH3-N含量[9]，采用DNS法測定RC含量[10]。

1.5.2 活菌數(shù)的測定

在無菌條件下，取各處理組的發(fā)酵產(chǎn)物0.5 g，置于滅菌后的離心管中，加入4.5 mL生理鹽水，混勻后進(jìn)行梯度稀釋，涂布法測定乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌的數(shù)量。使用MRS 培養(yǎng)基測定乳酸菌數(shù)量、LB 培養(yǎng)基測定芽孢桿菌數(shù)量、YPD 培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)量。具體操作參照張永根等[11]的方法。

1.5.3 營養(yǎng)成分含量的測定

取發(fā)酵樣品200 g，105 ℃烘箱中烘至恒重，用于飼料常規(guī)養(yǎng)分的測定，具體方法參照李龍的報道[12]。酸溶蛋白含量的測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉》(GB/T 22492—2008)中的方法進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel (2019) 進(jìn)行初步整理，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用一般線性模型單變量進(jìn)行方差分析，其他采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。采用DPS 9.01軟件中的TOPSIS法，根據(jù)各指標(biāo)對發(fā)酵品質(zhì)影響大小，給予不同的權(quán)重系數(shù)，即對發(fā)酵后的pH值、乳酸、活菌數(shù)(乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌之和)、還原糖、氨態(tài)氮與總氮的比值、乙酸、丙酸、丁酸分別賦予-2、2、1、1、-1、1、1、-1，再進(jìn)行加權(quán)求和。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆渣最佳菌種組合研究

2.1.1 接種不同比例菌種組合對發(fā)酵指標(biāo)的影響及其TOPSIS評分結(jié)果

由表3可知，9個試驗(yàn)組的pH值均小于4.50，其中第8組pH值最低為4.30。第3組的活菌數(shù)和還原糖含量均為最高。第8組的乳酸含量最高為68.75 μmol/g。第6組的乙酸和丙酸含量最高。第5組的丁酸含量最低為0.28 μmol/g。第9組的氨態(tài)氮/總氮最低為8.57%。用TOPSIS對上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)分析，結(jié)果表明第8組得分最高為0.646 3。

表3 接種不同比例菌種組合對發(fā)酵指標(biāo)的影響及TOPSIS評分結(jié)果

2.1.2 接種不同比例菌種組合的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4中正交試驗(yàn)結(jié)果的R值分析可以看出，3個因素對TOPSIS評分的影響程度為B>A>C，即枯草芽孢桿菌對TOPSIS評分的影響最大，其次是植物乳桿菌，釀酒酵母對TOPSIS評分的影響最小。結(jié)合K值大小分析可得，此次試驗(yàn)中植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵豆渣的最佳接種組合為A3B2C1,即植物乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母=3∶2∶1。

表4 不同菌種比例組合正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 發(fā)酵豆渣工藝條件優(yōu)化

2.2.1 不同發(fā)酵工藝條件對發(fā)酵指標(biāo)的影響及其TOPSIS評分結(jié)果

由5可知，第3組pH值最低為3.92。第2組活菌數(shù)最高為24.39 lg CFU/g。第8組的乳酸含量最高為90.53 μmol/g。第2組和第7組的乙酸含量最高。第9組的丙酸和還原糖含量最高。第6組的丁酸含量最低為0.28 μmol/g。第7組的氨態(tài)氮/總氮最低為1.95%。用TOPSIS對上述結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)分析，結(jié)果表明第6組得分最高為0.878 8。

2.2.2 不同發(fā)酵工藝條件組合的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6中正交試驗(yàn)結(jié)果的R值分析可以看出，4個因素對TOPSIS評分的影響程度為D>B>A>C，即溫度對TOPSIS評分的影響最大，其次是發(fā)酵時間和接種量，含水量對TOPSIS評分的影響最小。結(jié)合K值大小分析可得，3個菌種混合發(fā)酵豆渣工藝條件的最佳組合為A2B3C1D2，即在接種量為10%、發(fā)酵時間為72 h、含水量為50%、發(fā)酵溫度為35 ℃的條件下，可以獲得最優(yōu)的發(fā)酵效果。

表5 不同發(fā)酵工藝條件對發(fā)酵指標(biāo)的影響及其TOPSIS評分結(jié)果

表6 不同發(fā)酵工藝組合正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表6

2.3 豆渣飼料發(fā)酵前后營養(yǎng)成分及pH值的變化

如表7所示，豆渣飼料經(jīng)優(yōu)化后的最佳發(fā)酵工藝發(fā)酵后，顯著提高了豆渣飼料的粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白、粗灰分含量(P<0.05)，顯著降低了pH值(P<0.05)。發(fā)酵前后豆渣飼料的粗脂肪、粗纖維和酸性洗滌纖維含量無顯著差異(P>0.05)。

表7 豆渣飼料發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量(DM)及pH值的變化

3 討論

乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌是常見的微生物添加劑，生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，添加這些微生物制劑可促進(jìn)動物生長，從而有利于維持動物腸道微生態(tài)平衡[13]。因此本試驗(yàn)采用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母發(fā)酵豆渣。發(fā)酵后飼料的pH值是評定發(fā)酵是否成功的重要指標(biāo)[14]，一般來說，優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵飼料的pH值3.8～4.2[15]。本試驗(yàn)中，各發(fā)酵組的pH值均有不同程度的下降，其中最佳發(fā)酵組的pH值為4.06，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)發(fā)酵飼料標(biāo)準(zhǔn)。本研究中所用的植物乳桿菌在發(fā)酵的過程中可利用大量發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸[16]，而相關(guān)研究表明，高濃度的乳酸含量可以有效抑制飼料中病原菌的增殖，有助于腸道微生態(tài)的平衡[17]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)各組的乳酸濃度高于70 μmol/g，說明發(fā)酵豆渣飼料中含在大量的乳酸，不僅有利用于發(fā)酵豆渣飼料的保質(zhì)，并有助于采食此類飼料的動物的消化道健康。丁酸是一種具有刺激性氣味的揮發(fā)性脂肪酸，發(fā)酵飼料如果含有大量的丁酸，會導(dǎo)致其感官品質(zhì)和動物的適口性下降[19]。本試驗(yàn)中，不同發(fā)酵組的丁酸濃度存在差異，說明丁酸的生成受到接種微生物數(shù)量和其他接種條件的影響。本試驗(yàn)以還原糖的含量來衡量復(fù)雜碳水化合物降解程度，發(fā)現(xiàn)不同組合和不同發(fā)酵條件下，各組中的還原糖的濃度存在顯著差異，原因可能與各條件下芽孢孢桿菌的數(shù)量有關(guān)，一些報道顯示，芽孢桿菌具有產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶的功能[20]。因此，接種不同劑量的芽孢桿菌對底物中碳水化合物降解程度不一樣，由此導(dǎo)致還原糖的數(shù)量不一樣。NH3-N主要由微生物發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)生，其含量高低可反映原料在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)被分解的程度。本試驗(yàn)中，各組發(fā)酵飼料中的NH3-N/TN均小于10%，表明各組發(fā)酵效果較好[21]。

TOPSIS法是一種常用的綜合評價指標(biāo)的方法，能夠在系統(tǒng)工程中有限方案中進(jìn)行多目標(biāo)決策分析，其特點(diǎn)是對指標(biāo)進(jìn)行賦權(quán)，對參評對象做出評價[22]。本試驗(yàn)測定了pH值、活菌數(shù)、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、NH3/TN和還原糖的含量，在篩選最優(yōu)組方過程中，不是某一組方的8個指標(biāo)均為最優(yōu)，但是通過TOPSIS綜合評價法，分析得出9個組方中8個指標(biāo)的最優(yōu)方案，然后計算9個組方的各指標(biāo)分別與最優(yōu)方案的距離，以計算后的距離作為TOPSIS評分。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵豆渣飼料的最佳工藝條件為：3株試驗(yàn)菌的接種比例為：植物乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母=3∶2∶1、接種量為10%、固態(tài)培養(yǎng)基含水量為50%、溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為48 h。

乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌在發(fā)酵的過程中，可充分利用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源和碳源進(jìn)行繁殖，進(jìn)而產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物有助于提高了發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價值。豆渣經(jīng)混菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量由發(fā)酵前的19.16%提高到了19.50%。這部分增加的蛋白質(zhì)一方面可能是微生物在發(fā)酵的過程中大量繁殖消耗了部分的有機(jī)物，使得產(chǎn)物總量減少，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”[23]。酸溶蛋白是指由2～20個氨基酸殘基所組成的小肽。豆渣飼料經(jīng)混菌發(fā)酵后，酸溶蛋白含量為19.98%，較未發(fā)酵組提高了7.35%。本試驗(yàn)中酸溶蛋白含量的升高可能是由于接種的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶將豆渣飼料中的蛋白質(zhì)水解為游離氨基酸。發(fā)酵后粗灰分和中性洗滌纖維的含量較發(fā)酵前顯著提高，可能原因在于發(fā)酵的過程中，豆渣飼料中部分有機(jī)物被微生物利用，導(dǎo)致其干物質(zhì)損失，使得它們的比例有所提高。Rashad等[24]研究發(fā)現(xiàn)，利用白假絲酵母NRRLY-12發(fā)酵新鮮豆渣，發(fā)酵產(chǎn)物較發(fā)酵前相比粗纖維含量下降了45.5%，粗脂肪含量下降了8.6%，而本試驗(yàn)中豆渣飼料經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵后，粗纖維含量沒有顯著變化，但粗脂肪含量顯著降低，這可能是由于菌種不同導(dǎo)致對粗纖維的降解能力不同的結(jié)果。

4 結(jié)論

綜上所述，植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵豆渣飼料的最優(yōu)工藝條件為植物乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母的配比=3∶2∶1、接種量為10%、固態(tài)培養(yǎng)基含水量為50%、溫度為35 ℃、發(fā)酵時間為48 h。且豆渣經(jīng)過微生物發(fā)酵后，pH值顯著下降，酸溶蛋白含量顯著上升，營養(yǎng)價值得到改善。