波形蛋白、骨橋蛋白在三陰性乳腺癌>組織中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系▲

郭彬彬 郭 滿 張子杰 張 浩

(河南省南陽市中心醫(yī)院1 乳腺外科，2 甲狀腺外科，3 病理科，南陽市 473000，電子郵箱：2550767113@qq.com)

乳腺癌是發(fā)展中國家女性發(fā)病率最高的癌癥，也是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1],其發(fā)病率逐年增長且發(fā)病人群趨于年輕化[2]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)約占所有乳腺癌的10.0%～17.0%。與非三陰性乳腺癌相比，TNBC的發(fā)病人群更趨于年輕化[3]，且更具侵襲性，易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，因雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體-2的表達(dá)缺失，對內(nèi)分泌治療及特異性靶向治療不敏感[4]，預(yù)后較差。波形蛋白是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，是中間纖維蛋白家族中最重要的一員[5]，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[6]。骨橋蛋白是一種多功能分泌型磷酸糖蛋白，在轉(zhuǎn)移癌和具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤中呈高表達(dá)[7-8]。截至目前，國內(nèi)外對波形蛋白、骨橋蛋白的共同研究較少，兩者在TNBC的發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究檢測波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC中的表達(dá)情況，分析兩者與TNBC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，探討兩者在TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2015年12月南陽市中心醫(yī)院收治的120例TNBC患者為研究對象(TNBC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理確診為TNBC，既往未接受過抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè)乳癌，合并臟器功能障礙，炎性乳腺癌，其他部位惡性腫瘤，生存資料不完善的病例。120例TNBC患者年齡 28～76(51.86±9.07)歲；腫瘤直徑：T0～T1期 49 例，T2期 70例，T3期1例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例；原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期：Ⅰ期31 例，Ⅱ期65例，Ⅲ期24例。另選取同期收治的30例乳腺良性疾病患者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后經(jīng)病理確診為乳腺良性疾病，包括乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。30例乳腺良性疾病患者年齡 30～67(48.70±9.50)歲，其中乳腺增生癥11例，乳腺纖維腺瘤19例。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)南陽市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測波形蛋白、骨橋蛋白的表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC腫瘤組織及乳腺良性疾病組織中的表達(dá)情況。將石蠟包埋的TNBC組織及乳腺良性疾病組織連續(xù)切成3 μm切片，將切片放入60℃恒溫箱中烘烤2 h，然后使用二甲苯浸泡15 min，更換新鮮二甲苯后再浸泡15 min，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水)脫去二甲苯并水化，枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復(fù)，滴加體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液室溫孵育20 min；磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)沖洗，滴加即用型一抗(兔抗人骨橋蛋白單克隆抗體工作液100 μL、兔抗人波形蛋白多克隆抗體工作液100 μL)，置于濕盒中室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，3 s/次，室溫下滴加二抗(酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物)，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蒸餾水沖洗3次，3 s/次，蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗返藍(lán)，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水)脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察著色情況。以PBS代替一抗進(jìn)行上述步驟作為TNBC組與對照組的陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。按半定量積分法判斷波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占比例計分：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細(xì)胞所占比例<15%計0分，陽性細(xì)胞所占比例為15%～25%計1分，陽性細(xì)胞所占比例為 26%～50%計2分，陽性細(xì)胞所占比例為51%～75%計3分，陽性細(xì)胞所占比例>75%計4分。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例評分相加，總分<4分為陰性表達(dá)，≥4分為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪方法 隨訪方式采用電話隨訪和門診復(fù)診，隨訪截至2019年3月，或患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡則隨訪終止，平均隨訪時間55個月，無失訪病例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用 Spearman秩相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線；生存情況的比較采用log-rank檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TNBC組患者與對照組患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況的比較 鏡下觀察可見波形蛋白在TNBC組織中大量表達(dá)，而在乳腺良性疾病組織中少量表達(dá)，見圖1。TNBC組波形蛋白的陽性表達(dá)率為25.00%(30/120)，高于對照組的陽性表達(dá)率6.67%(2/30)(χ2=4.807，P=0.028)。鏡下觀察可見骨橋蛋白在TNBC組織中大量表達(dá)，而在乳腺良性疾病組織中少量表達(dá)，見圖2。TNBC組骨橋蛋白的陽性表達(dá)率為26.67%(32/120)，高于對照組的陽性表達(dá)率3.33%(1/30)(χ2=7.615，P=0.006)。

圖1 波形蛋白的表達(dá)情況(免疫組化，×200)

圖2 骨橋蛋白的表達(dá)情況(免疫組化，×200)

(A：TNBC組；B：對照組)

2.2 波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)陽性和表達(dá)陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較 波形蛋白陽性表達(dá)患者腫瘤直徑為T2或T3期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2或N3，臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05)；不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)在波形蛋白陽性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者之間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。骨橋蛋白陽性表達(dá)患者腫瘤直徑為T2期，臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05)；不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、絕經(jīng)狀態(tài)在骨橋蛋白陽性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者之間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)陽性和表達(dá)陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較[n(%)]

2.3 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，TNBC患者波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá)情況呈正相關(guān)性(rs=0.392，P<0.001)。

2.4 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系 120例TNBC患者隨訪11～74個月，中位隨訪時間為62.8個月，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移10例，死亡25例。截至隨訪終止時間，波形蛋白陽性表達(dá)TNBC患者的無病生存率為 40.0%，低于波形蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的81.1%(χ2=18.407，P<0.001)，見圖3。骨橋蛋白陽性表達(dá)TNBC患者的無病生存率為 59.4%，低于骨橋蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的 75.0%(χ2=4.492，P=0.042)，見圖4。

圖3 波形蛋白陽性表達(dá)TNBC患者和波形蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的生存曲線

圖4 骨橋蛋白陽性表達(dá)TNBC患者和骨橋蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的生存曲線

3 討 論

乳腺癌已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[9]。相比較于其他類型乳腺癌，TNBC的組織學(xué)分級和侵襲性更高，TNBC內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率多于骨轉(zhuǎn)移，易發(fā)生脊髄、腦膜、腦、肝和肺轉(zhuǎn)移，5年生存率遠(yuǎn)低于其他類型乳腺癌[10]。因不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體-2，TNBC缺乏有效的內(nèi)分泌治療及精準(zhǔn)的靶向治療，僅僅依賴細(xì)胞毒性化療藥物來延緩復(fù)發(fā)與進(jìn)展[11]，TNBC是目前治療最棘手的乳腺癌亞型之一，尋找更有效的靶向治療位點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測分子也是亟須攻克的難題。

波形蛋白是中間纖維蛋白，作為間葉分化的標(biāo)志物，是細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的重要標(biāo)志物，EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。波形蛋白在宮頸癌、肺癌，結(jié)直腸癌等多種上皮源性腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高[12]。本研究結(jié)果顯示，TNBC組波形蛋白的陽性表達(dá)率高于對照組(P<0.05)，與趙俊軍[13]等的研究結(jié)果一致。波形蛋白陽性表達(dá)患者腫瘤直徑為T2或T3期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2或N3，臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05)，表明波形蛋白的表達(dá)可能與TNBC腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期有關(guān)，波形蛋白可能在TNBC發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要作用，參與TNBC的增殖、轉(zhuǎn)移，與TNBC的不良生物學(xué)行為密切相關(guān)。長期隨訪發(fā)現(xiàn)，波形蛋白陽性表達(dá)TNBC患者的無病生存率遠(yuǎn)低于波形蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)，這提示波形蛋白陽性表達(dá)TNBC患者的預(yù)后較差，在臨床工作中可通過檢測波形蛋白的表達(dá)，對患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，為輔助化療方案的選擇及其他臨床決策提供參考。

目前發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白對腫瘤的增殖、侵襲、自噬、凋亡及血管新生等都具有重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。郭滿等[16]分別觀察不同乳腺組織中骨橋蛋白表達(dá)的差異，結(jié)果表明在TNBC組織中骨橋蛋白的陽性表達(dá)率遠(yuǎn)高于乳腺增生組織和正常乳腺組織。抑制骨橋蛋白表達(dá)可促進(jìn)TNBC細(xì)胞自噬和凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[16-17]。本研究結(jié)果顯示，骨橋蛋白在TNBC組織中高表達(dá)且骨橋蛋白陽性表達(dá)患者腫瘤直徑為T2期，臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05)，這表明骨橋蛋白可能與TNBC腫瘤直徑和臨床分期有關(guān)(均P<0.05)，提示骨橋蛋白可能參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，這表明波形蛋白與骨橋蛋白或許在TNBC的發(fā)生和發(fā)展中存在調(diào)控關(guān)系，或許可通過調(diào)控例如p38蛋白激酶信號通路表達(dá)[17]，進(jìn)而調(diào)控波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。經(jīng)長期隨訪發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白與TNBC預(yù)后密切相關(guān)，骨橋蛋白陽性表達(dá)TNBC患者無病生存率低于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)。在臨床工作中可檢測TNBC患者的骨橋蛋白表達(dá)情況，對于骨橋蛋白表達(dá)較高的患者，應(yīng)給予相應(yīng)的臨床重視。

綜上所述，波形蛋白與骨橋蛋白在TNBC組織中陽性表達(dá)率高，且兩者表達(dá)情況呈正相關(guān)，其在TNBC的發(fā)生、發(fā)展中可能起協(xié)同作用，二者的高表達(dá)提示TNBC患者預(yù)后不良，在臨床上檢測二者的表達(dá)水平或可評估患者預(yù)后，為TNBC的治療提供臨床指導(dǎo)。