芒果苷標準樣品的定值與不確定度測定

陽辛鳳， 龐朝海， 田 海， 郭曉杰， 王 盼

[1.中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心, 海南 ?？?571101；2.農業(yè)農村部熱作產品質量安全風險評估實驗室(?？?, 海南 ?？?571101；3.海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室, 海南 ?？?571101；5.海南大學熱帶農林學院, 海南 ?？?570208]

芒果苷是漆樹科植物芒果樹葉片、百合科植物知母根莖、龍膽科植物藏茵陳等中藥材的主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳、殺菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂等藥理活性[1-4]。芒果苷為2015年版《中國藥典》規(guī)定的知母等中藥材鑒別和質量控制的重要檢測指標[5]，因此，準確測定芒果苷含量對相關產品的質量控制有重要意義。然而目前尚無芒果苷標準樣品，與芒果苷檢測相關的研究都是基于芒果苷對照品而開展的。國內外公司出售的芒果苷對照品，均未按照國家標準進行均勻性、穩(wěn)定性和定值試驗，純度沒有進行不確定度評價，不具有溯源性，難以作為標準樣品使用。

定值與不確定度評價是標準樣品制備的重要環(huán)節(jié)，質量平衡法可直接溯源到國際單位制(SI)中的質量(kg)，是一種潛在的基準方法[6]，也是GB/T 15000.3 標準樣品工作導則中推薦的方法[7]，它主要由主成分測定及雜質測定兩部分構成，主成分測定常用方法是液相色譜法或氣相色譜法，以面積歸一化法計算主成分純度；雜質則主要是指水分、灰分和揮發(fā)性成分，其操作簡單、可重復性好，在標準樣品定值中應用廣泛。天然產物類標準樣品在農產品、食品、中草藥等領域需求很大，近年來天然產物標準樣品的研制以及對其特性量值的檢驗、定值及不確定度評價得到了廣泛關注，有證標準樣品數量逐漸增多。王尉等報道了表沒食子兒茶素沒食子酸酯、異補骨脂素、橙皮素、辛弗林、天麻素、黃芩素、芝麻素和水蘇糖等天然產物標準樣品的研制，并采用質量平衡法法對制備的標準樣品進行了定值[8-15]。

為了滿足以芒果苷為活性成分的農產品及相關產品的分析檢測、質量控制工作的需求，保證檢測結果的準確性、可比性和溯源性，急需制備芒果苷標準樣品。本文參照GB/T 15000.3 標準樣品工作導則，對研制的芒果苷標準樣品進行均勻性與穩(wěn)定性檢驗，以及采用質量平衡法進行定值和對不確定度進行評價。

1 材料與方法

1.1 試劑 芒果苷標準樣品為自制，步驟為將新鮮芒果葉片切碎、粉碎后提取，分離純化，重結晶，即得到淡黃色針狀結晶，70%甲醇超聲溶解及定容，制成質量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國賽默飛公司)；水為Milli-Q系統(tǒng)超純水(美國Millipore公司)。

1.2 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀，配置紫外檢測器(美國Waters公司)；Triple TOF 5600+超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 7890A氣相色譜儀，配置FID檢測器與頂空裝置[安捷倫科技(中國)有限公司]；SKF-1自動卡爾費休水分測定儀(瑞士Mettler-Toledo公司)；BT25S型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；JP-180ST超聲波清洗機(900 W，40 kHz，深圳市潔盟清洗設備有限公司)。

1.3 純度分析 采用HPLC法，條件為Waters Xbridge BEH C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)(85∶15)；體積流量1 mL/min；波長258 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

1.4 結構分析 條件為電噴霧離子化源(ESI)，負離子模式；質量掃描范圍m/z100～900；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣40 L/min；霧化氣、輔助氣體積流量55 L/min；去簇電壓-100 V。采用TOF-MS-IDA-MS/MS方法采集數據，一級預掃描和觸發(fā)的二級掃描離子累積時間分別為200、100 ms；碰撞能量-35 eV；碰撞能量疊加(CES)(-35±15)eV；觸發(fā)二級的方法為IDA，多重質量虧損(MMDF)和動態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級的條件，滿足該條件的優(yōu)先進行二級掃描。

1.5 均勻性檢驗 均勻性檢驗包括瓶間、瓶內均勻性檢驗，其中瓶間均勻性檢驗方法為隨機抽取分裝好的標準樣品15瓶，采用3種抽樣程序，第1組標準樣品瓶序號為5-60-23-51-19-2-72-33-80-69-26-93-43-85-17，第2組標準樣品瓶序號為17-85-43-93-26-69-80-33-72-2-19-51-23-60-5，第3組標準樣品瓶序號為5-23-19-72-80-26-43-17-60-51-2-33-69-93-85；瓶內均勻性檢驗方法為隨機抽取分裝好的標準樣品1瓶，重復測定10次。采用峰面積歸一化法計算純度，再根據GB/T 15000-2008工作導則要求，通過方差分析處理均勻性測量數據，并進行均勻性評估。

1.6 穩(wěn)定性檢驗 穩(wěn)定性檢驗包括短期、長期穩(wěn)定性檢驗，其中短期穩(wěn)定性檢驗是將9組標準樣品(每組3瓶)保存在恒溫(40±1)℃烘箱中，第1～7天各取出3瓶，第10、15天各取出3瓶，放于4 ℃下，共15 d，每瓶取3個子樣，配制成溶液，按“1.3”項下方法分析，檢測在規(guī)定條件下純度隨時間的變化；長期穩(wěn)定性檢驗是將16組標準樣品(每組6瓶)在4 ℃下保存19個月，第1～13個月各取出6瓶，第15、17、19個月各取出6瓶，按“1.3”項下方法分析。采用峰面積歸一化法計算純度，再根據GB/T 15000-2008工作導則要求，通過方差分析處理穩(wěn)定性檢驗數據，并進行穩(wěn)定性評估。

1.7 雜質分析

1.7.1 水分 采用卡爾費休庫倫滴定法[16]測定。

1.7.2 灰分 參照《有機化工產品灼燒殘渣的測定》(GB/T 7531-2008)，采用灼燒法[17]，在650 ℃下灼燒至恒重，電子分析天平稱定質量。

1.7.3 有機溶劑殘留 采用靜態(tài)頂空進樣-氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法(HS-GC-FID)。條件為DB-624色譜柱(30 m×0.25 mm，1.4 μm)；初始溫度45 ℃，恒溫5 min，以7 ℃/min升至60 ℃，15 ℃/min升至80 ℃，50 ℃/min升至235 ℃，恒定0.5 min；體積流量1.0 mL/min；分流比5∶1；進樣量1 mL；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度260 ℃。取0.100 0 g標準樣品，加DMSO至2 mL，90 ℃頂空30 min，取1 mL頂空氣體進行GC測定。

1.8 定值 采用實驗室協(xié)作試驗定值法，參加的實驗室數目為8家，隨機抽取24瓶標準樣品，每個定值實驗室送3瓶，每瓶平行測定2次。定值實驗室將標準樣品制成100 μg/mL溶液，采用峰面積歸一化法計算純度，將所得數據根據實驗室規(guī)定和測定方法進行匯總，從技術上剔除查明原因的可疑值后，通過格拉布斯(Grubbs)檢驗法從統(tǒng)計上剔除可疑值。

GB/T 15000-2008規(guī)定，定值結果由標準值和不確定度組成，標準樣品特性標準值的測量不確定度uCRM由標準值定值試驗的不確定度、均勻性檢驗的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度ults、水分測量引入的不確定度umoisture、灰分測量引入的不確定度uash、溶劑殘留測量引入的不確定度usolvent組成。根據上述測定結果，計算芒果苷標準樣品的純度標準值和不確定度。

2 結果

2.1 純度分析 圖1顯示，主成分色譜峰只有1個，保留時間5.757 min，響應值高，并且僅在7.599 min處有1個響應微弱的雜質峰，純度高于99.5%。

1.芒果苷圖1 芒果苷色譜圖

2.2 結構確證 芒果苷為雙苯吡酮類黃酮類化合物，在負離子模式下容易解離，因此離子源選擇ESI-，通過針泵進樣方式獲得一級(TOF-MS)、二級(TOF-MS/MS)質譜圖，見圖2。由此可知，在芒果苷一級質譜中,其[M-H]-峰為m/z421.079 8，響應最強，為芒果苷脫氫后的母離子，與芒果苷分子(422.084 9)脫氫產物的m/z理論值基本一致；二級質譜的主要碎片峰有m/z301.038 3、331.052 6、271.026 9、259.028 8，均有很強的響應值，為芒果苷結構斷裂產物。以上結果與理論預測及文獻[18-19]報道一致，因此所檢測標準樣品為芒果苷。

圖2 芒果苷高分辨質譜圖

2.3 均勻性檢驗

2.3.1 瓶間均勻性 結果見表1，方差分析見表2。

表1 瓶間均勻性檢驗結果(n=3)

表2 瓶間均勻性方差分析

2.3.2 瓶內均勻性 結果見表3，方差分析見表4。

表3 瓶內均勻性檢驗結果(n=3)

表4 瓶內均勻性方差分析

2.4 穩(wěn)定性試驗

2.4.1 長期穩(wěn)定性 將標準樣品在4 ℃下進行19個月試驗，采用優(yōu)化HPLC法測定標準樣品純度作為特性量參數，測得其范圍為99.45%～99.97%。再根據GB/T 15000-2008工作導則要求，采用方差分析計算穩(wěn)定性監(jiān)測數據，并進行穩(wěn)定性評估。

圖3 芒果苷長期穩(wěn)定性試驗結果

2.4.1.2 回歸分析法 以時間為自變量，純度為因變量，采用回歸分析對長期穩(wěn)定性數據進行評估。結果，P=0.082，表示回歸不顯著(對于95%置信水平而言，P<0.05為顯著)，即未發(fā)現不穩(wěn)定性，標準樣品長期穩(wěn)定性穩(wěn)定性良好。

2.4.2 短期穩(wěn)定性 在夏季長途運輸時標準樣品時，可能會達到40 ℃的高溫，故本實驗考察芒果苷在40 ℃、15 d內的短期穩(wěn)定性，測得其純度范圍為99.81%～99.84%。再根據GB/T 15000-2008工作導則要求，采用方差分析計算穩(wěn)定性監(jiān)測數據，并進行穩(wěn)定性評估。

圖4 芒果苷短期穩(wěn)定性試驗結果

直線上各點的標準偏差s2=0.000 250 0，取其平方根s=0.015 81，與斜率相關的不確定度為s(b1)=0.001 165，自由度n-2=1、P=0.95的t因子為12.706，t0.95，n-2×s(b1)=0.014 81，由于|b1|

2.4.2.2 回歸分析法 以時間為自變量，純度為因變量，采用回歸分析對短期穩(wěn)定性數據進行評估。結果，P=0.22，表示回歸不顯著，即未發(fā)現不穩(wěn)定性，標準樣品短期穩(wěn)定性良好。

2.5 雜質分析

2.5.1 水分 采用自動卡爾費休庫倫滴定法測定3次，結果分別為0.17%、0.15%、0.19%，再進行Grubbs檢驗，發(fā)現在0.05水平、檢測次數3次時，G95(3)=1.153，水分測量值均為Gi

2.5.2 灰分 3次測定結果分別為0.174%、0.165%、0.139%，再進行Grubbs檢驗，發(fā)現在0.05水平、檢測次數5次時，Gi

2.5.3 有機溶劑殘留值 芒果苷提取分離與重結晶過程僅使用了甲醇、石油醚、乙酸乙酯，故本實驗對三者殘留值進行檢測，結果見表5，再進行Grubbs檢驗，發(fā)現在0.05水平、檢測次數5次時，G95(5)=1.672，Gi

表5 有機溶劑殘留測定結果

2.6 定值分析 對8家實驗室的數據采用格拉布斯檢驗法進行檢驗，測得G95(48)(Xij)均小于G95(48)(2.94)，未發(fā)現異常值，呈正態(tài)分布，符合GB/T 15000-2008工作導則要求，同法對每家實驗室的平均值進行檢驗，將其看成1組測定值進行異常值檢驗，也未發(fā)現異常值，故將上述數據視為無偏估計值，計算其平均值及標準偏差，見表6，方差分析見表7。

表6 定值測定結果(n=6)

表7 定值方差分析

取包含因子k=2，則標準樣品的擴展不確定度uCRM(擴展)=2×uCRM(合成)=0.20%，純度定值為99.82%，雜質包括水分0.17%、灰分0.159%、有機溶劑殘留0.026%，總計0.35%，扣除雜質后，標準值為(100%-0.35%)×99.82%=99.47%。綜上所述，標準樣的特性值為99.47%，擴展不確定度為0.20%(P=0.95，k=2)。

3 結論

本研究制備的芒果苷標準樣品瓶間與瓶內均勻性良好，在40、4 ℃下的短期和長期穩(wěn)定性分別不少于15 d、19個月，標準樣品的純度標準值為99.47%，擴展不確定度為0.20%。所制備的芒果苷標準樣品滿足GB/T 15000-2008工作導則要求，可用于芒果苷檢測方法校正，以及芒果樹葉、知母等中藥材、提取物與藥品等相關產品的檢測和質量控制。