張靈敏, 李靜波, 蔡紀(jì)堂, 鄭琳靖
(河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002)
甘露子為唇形科水蘇屬植物甘露子StachyssieboldiiMiq.的全草,又稱地牯牛、草石蠶、旱螺螄、地環(huán)兒等[1],主要分布于山西、河北、河南、山東、山西等地,其藥性甘平,具有潤肺補(bǔ)腎、活血散瘀、清熱利濕的功效,用于肺炎、肺結(jié)核、風(fēng)熱感冒、氣喘、黃疸、小便短澀[2],主要化學(xué)成分包括黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類、甾體類[3],具有抗氧化、抗菌、抗疲勞、抗腫瘤等作用[4]。郭淑云等[5]報道,甘露子對創(chuàng)傷黏膜組織具有顯著的修復(fù)作用。本研究對甘露子90%乙醇提取物進(jìn)行分離、純化,得到15個化合物,均為首次從甘露子中分離得到,其中化合物1、5可提高鼻黏膜上皮細(xì)胞的相對存活率。
PT2025型超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Metrolab公司);Daltonics1300型質(zhì)譜儀(德國Bruker Daltonics公司);60~100、300~400目柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司);UV-3000型暗箱式紫外分析儀(上海昶鉦電子科技有限公司);UHT87Y型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);NYJ96型超聲波清洗器(山東新瑪自動化科技有限公司);XY-2C型分析天平(常州德普紡織科技有限公司);BSA116S型全自動離心機(jī)(濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司)。SephadeX LH-20凝膠(瑞典Pharmacia公司)。苯環(huán)喹溴銨(上海閃譜生物科技公司);二甲基亞砜(DMSO,山東瑞港化工有限公司);噻唑藍(lán)(MTT,廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)。所用試劑均為分析純。
甘露子采自河南省鄭州市,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院李靜波教授鑒定為甘露子StachyssieboldiiMiq.的全草。
取干燥的甘露子21.4 kg,粉碎后加入90%乙醇加熱回流提取3次,每次2 h,合并上述提取液,減壓濃縮得甘露子總浸膏2.6 kg,超聲分散在水中,采用石油醚、二氯甲烷、丙酮和正丁醇依次萃取,減壓回收溶劑,得石油醚部分浸膏(Fr.A)173.6 g、二氯甲烷部分浸膏(Fr.B)186.2 g、丙酮部分浸膏(Fr.C)217.3 g、正丁醇部分浸膏(Fr.D)251.4 g。取Fr.B,經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (50∶50∶0~30∶70∶0~10∶80∶10)梯度洗脫,得到7個流分Fr.B1~Fr.B7,F(xiàn)r.B2 (7.8 g) 經(jīng)硅膠柱,以石油醚-二氯甲烷-丙酮 (40∶60∶0~20∶80∶0~10∶80∶10)梯度洗脫,得到8個組分Fr.B2-1~Fr.B2-8,F(xiàn)r.B2-2 (843 mg) 經(jīng)硅膠柱,以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (30∶60∶10) 洗脫,得化合物3(27 mg)、6(21 mg);Fr.B2-4 (649 mg) 經(jīng)硅膠柱,以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (20∶70∶10)洗脫,得化合物8(16 mg)、10(25 mg);Fr.B2-5 (437 g) 經(jīng)硅膠柱,以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (10∶80∶10)洗脫,得化合物1(22 mg)、7(19 mg);Fr.B2-7 (624 mg) 經(jīng)Sephadex LH-20柱,以甲醇洗脫,得化合物11(21 mg)。取Fr.C,經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (80∶20∶0~30∶70∶0~20∶70∶10) 梯度洗脫,得到5個流分Fr.C1~Fr.5,F(xiàn)r.C3 (9.3 g) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (80∶20∶0~30∶70∶0~20∶70∶10)梯度洗脫,得到7個組分Fr.C3-1~Fr.C3-7,F(xiàn)r.C3-2 (763 mg) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (10∶80∶10)洗脫,得化合物2(18 mg)、5(34 mg);Fr.C3-4 (591 mg) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (30∶60∶10)洗脫,得化合物4(19 mg);Fr.C3-6 (341 mg) 經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶,得化合物15(26 mg),F(xiàn)r.C4 (11.5 g) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (70∶30∶0~20∶80∶0~10∶80∶10) 梯度洗脫,得到6個組分Fr.C4-1~Fr.C4-6,F(xiàn)r.C4-2 (473 mg) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (10∶80∶10)洗脫,得化合物13(19 mg);Fr.C4-4 (316 mg) 經(jīng)Sephadex LH-20色譜柱,以甲醇洗脫,得化合物12(23 mg)。取Fr.D,經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-丙酮-甲醇(20∶80∶0~10∶80∶10~0∶60∶40)梯度洗脫,得到6個流分Fr.D1~Fr.D6,F(xiàn)r.D3 (815 g) 經(jīng)硅膠柱分離,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(10∶90∶0~10∶80∶10~0∶50∶50) 梯度洗脫,得到6個組分Fr.D3-1~Fr.D3-6,F(xiàn)r.D3-2 (514 mg) 經(jīng)硅膠柱,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (10∶80∶10)洗脫,得化合物14(23 mg);Fr.D3-4 (613 mg) 經(jīng)Sephadex LH-20色譜柱,以甲醇洗脫,得化合物9(23 mg)。
化合物1:黃色膠狀,ESI-MSm/z:266.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.92 (1H,d,J=7.6 Hz,H-5),6.71 (1H,d,J=7.6,1.6 Hz,H-6),6.58 (1H,d,J=7.6 Hz,H-8),6.39 (1H,d,J=7.6 Hz,H-1),6.26 (1H,d,J=7.6 Hz,H-3),3.81 (3H,s,4-OCH3),2.63 (4H,s,H-9,10);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:108.2 (C-1),157.3 (C-2),99.6 (C-3),161.2 (C-4),130.2 (C-5),115.0 (C-6),156.3 (C-7),113.7 (C-8),31.2 (C-9),31.3 (C-10),140.1 (C-1a),116.5 (C-4a),126.3 (C-5a),146.1 (C-8a),55.4 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致,故鑒定為coelonin。
化合物2:白色膠狀,ESI-MSm/z:201.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.69 (1H,d,J=9.6 Hz,H-6),7.03 (1H,s,H-3),6.72 (1H,d,J=9.6 Hz,H-5),2.52 (3H,s,H-10),2.38 (3H,s,4-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:113.1 (C-1),164.5 (C-2),120.1 (C-3),150.4 (C-4),119.2 (C-5),1322.4 (C-6),195.7 (C-8),199.6 (C-9),28.1 (C-10),22.4 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致,故鑒定為1-(2-hydroxy-4-methylphe-nyl)propan-1,2-dione。
化合物3:白色粉末,ESI-MSm/z:174.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:9.68 (1H,s,H-7),7.38 (2H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-2,6),6.92 (1H,d,J=9.6 Hz,H-5),3.81 (3H,s,4-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:129.2 (C-1),130.4 (C-2),150.1 (C-3),160.3 (C-4),111.4 (C-5),117.2 (C-6),56.1 (4-OCH3),192.8 (7-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致,故鑒定為3-羥基對甲氧基苯甲醛。
化合物4:白色粉末,ESI-MSm/z:272.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:6.46 (1H,d,J=9.6 Hz,H-13a),5.48 (1H,d,J=7.6 Hz,H-13b),4.25 (1H,m,H-8),4.05 (1H,t,J=9.6 Hz,H-4),0.97 (3H,d,J=9.6 Hz,H-14),0.81 (3H,s,H-15);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:45.1 (C-1),26.4 (C-2),30.4 (C-3),83.7 (C-4),44.3 (C-5),36.5 (C-6),47.4 (C-7),83.4 (C-8),44.7 (C-9),31.7 (C-10),139.1 (C-11),170.4 (C-12),119.3 (C-13),20.5 (C-14),19.3 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致,故鑒定為2-desoxy-4-epi-pulchellin。
化合物5:白色膠狀,ESI-MSm/z:176.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:6.58 (1H,d,J=9.6 Hz,H-4),6.15 (1H,m,H-5),5.76 (1H,s,H-2),5.41 (1H,ddd,J=9.6,7.6,1.6 Hz,H-8),5.03 (1H,m,H-6),3.25 (1H,m,H-7b),1.72 (1H,m,H-7a);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:175.4 (C-1),114.0 (C-2),164.2 (C-3),121.7 (C-4),140.3 (C-5),64.8 (C-6),39.2 (C-7),79.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致,故鑒定為aquilegiolide。
化合物6:白色粉末,ESI-MSm/z:190.8[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.63 (1H,d,J=9.6 Hz,H-5),7.35 (1H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-6),6.85 (1H,d,J=7.6 Hz, H-2),3.72 (3H,s,7-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ: 119.5 (C-1),116.2 (C-2),148.4 (C-3),145.1 (C-4),122.6 (C-5),114.3 (C-6),167.2 (C-7),53.6 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯甲酸甲酯。
化合物7:白色粉末,ESI-MSm/z:599.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:5.43 (1H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-6),5.02 (1H,d,J=9.6 Hz,1-Glc),1.22 (3H,d,J=9.6 Hz,21-CH3),1.14 (3H,s,19-CH3),0.85 (3H,s,18-CH3),0.69 (3H,d,J=7.6 Hz,27-CH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:32.8 (C-1),28.1 (C-2),75.2 (C-3),40.1 (C-4),139.2 (C-5),122.4 (C-6), 33.1 (C-7),32.4 (C-8),47.6 (C-9),38.2 (C-10),22.4 (C-11),39.4 (C-12),40.8 (C-13),58.1 (C-14),31.7 (C-15),82.6(C-16),62.5 (C-17),17.1 (C-18),20.4 (C-19),43.1 (C-20),16.1 (C-21),111.2 (C-22),34.1 (C-23),30.1 (C-24),33.5 (C-25),68.1 (C-26),18.2 (C-27)及1個葡萄糖 (δ:101.1,76.2,80.6,73.1,81.2,64.3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,故鑒定為3-epi-diosgenin-3-β-D-glucopyranoside。
化合物8:白色粉末,ESI-MSm/z:351.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.86 (2H,d,J=9.6 Hz,H-2′,6′),7.69 (1H,d,J=9.6 Hz,H-7),7.22 (1H,dd,J=7.6 Hz,H-6),7.18 (2H,d,J=7.6 Hz,H-2),6.92 (2H,d,J=9.6 Hz,H-3′,5′),6.75 (1H,d,J=7.6 Hz,H-5),6.43 (1H,d,J=9.6 Hz,H-8),5.79 (2H,s,H-8′),3.76 (3H,s,10-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:126.3 (C-1),111.7 (C-2),149.5 (C-3),151.6 (C-4),117.4 (C-5),124.1 (C-6),146.3 (C-7),117.2 (C-8),167.4 (C-9),129.1 (C-1′),130.2 (C-2′),114.2 (C-3′),164.3 (C-4′),114.2 (C-5′),130.2 (C-6′),191.5 (C-7′),66.2 (C-8′),56.3 (10-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致,故鑒定為4′,8′-二羥基苯乙酮-8-O-阿魏酸酯。
化合物9:黃色油狀,ESI-MSm/z:207.3[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:6.73 (1H,s,H-2),6.57 (1H,s,H-5),6.46 (1H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-6),3.37 (2H,s,H-7),3.12 (3H,s,9-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:127.4 (C-1),116.8 (C-2),146.8 (C-3),143.1 (C-4),115.1 (C-5),122.5 (C-6),40.9 (C-7),76.2 (C-8),54.2 (9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙酸甲酯。
化合物10:白色結(jié)晶,ESI-MSm/z:509.2[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.93 (1H,d,J=9.6 Hz,H-2),6.72 (1H,d,J=7.6 Hz,H-8),6.37 (1H,d,J=7.6 Hz,H-6),6.19 (1H,d,J=7.6 Hz,H-3),5.31 (1H,d,J=7.6 Hz,H-1″),5.08 (1H,d,J=9.6 Hz,H-1′),3.93 (1H,dd,J=7.6,1.6 Hz,H-2″),3.79 (2H,m,H-6′),3.71 (1H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-2′),3.51 (1H,t,J=7.6 Hz,H-3′),3.42(1H,m,H-5′),3.27 (1H,dd,J=7.6,1.6 Hz,H-4′),1.18(1H,d,J=7.6 Hz,H-6″);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:131.2 (C-1),162.4 (C-2),113.5 (C-3),183.7 (C-4),164.1 (C-5),102.3 (C-6),165.1 (C-7),97.4 (C-8),160.2(C-9),107.3 (C-10),99.2 (C-1′),80.4 (C-2′),83.6 (C-3′),72.3 (C-4′),79.1 (C-5′),63.5 (C-6′),102.8 (C-1″),73.1 (C-2″),74.5(C-3″),72.6 (C-4″),69.3 (C-5″),19.2 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致,故鑒定為5,7-dihydroxychromone-7-O-neohesperidoside。
化合物11:黃色粉末,ESI-MSm/z:278.6[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.38 (2H,t,J=9.6 Hz,H-3,5),7.24 (2H,t,J=9.6 Hz,H-2,6),7.06 (1H,t,J=9.6 Hz,H-4),4.85 (1H,d,J=9.6 Hz,H-glc-1),3.92 (1H, dd,J=9.6,7.6 Hz,H-glc-6a),3.24~3.81 (5H,m,H-glc-2,3,4,5,6b);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:161.4 (C-1),16.2 (C-2),127.4 (C-3),120.8 (C-4),127.4 (C-5),116.2 (C-6),99.7 (C-glc-1),72.8 (C-glc-2),75.6 (C-glc-3),70.2 (C-glc-4),77.1 (C-glc-5),61.2 (C-glc-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致,故鑒定為phenyl β-D-glucopyranoside。
化合物12:黃色針晶,ESI-MSm/z:339.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:8.17 (2H,d,J=7.6 Hz,H-2′,6′),6.93 (2H,d,J=7.6 Hz,H-3′,5′),6.28 (1H,s,H-6),3.41(3H,8-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:115.4 (C-1),147.1(C-2),135.8 (C-3),175.3 (C-4),156.4 (C-5),100.2(C-6), 156.3 (C-7),129.1(C-8),150.2(C-9),103.8 (C-10),124.1 (C-1′),129.6 (C-2′),115.3 (C-3′),159.3 (C-4′),115.3 (C-5′),129.6 (C-6′),62.1 (8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致,故鑒定為8-甲氧基山萘酚。
化合物13:黃色片晶,ESI-MSm/z:351.3[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:13.17 (1H,s,5-OH),7.93 (2H,d,J=7.6 Hz,H-2′,6′),7.18 (2H,d,J=7.6 Hz,H-3′,5′),6.39 (1H,d,J=1.6 Hz,H-8),6.28 (1H,d,J=1.6 Hz,H-6),3.82 (3H,s,4′-OCH3),3.79 (3H,s,7-OCH3),3.71 (3H,s,3-OCH3);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:179.1 (C-1),163.2 (C-2),161.6 (C-3),162.4 (C-4),155.1 (C-5),156.2 (C-6),139.4 (C-7),129.7 (C-8),121.4 (C-9),113.6 (C-10),105.4 (C-11),96.3 (C-12),93.4 (C-13),56.2 (3-OCH3),55.7 (7-OCH3),60.8 (4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致,故鑒定為5-羥基-3,7,4′-三甲氧基黃酮。
化合物14:黃色粉末(甲醇),ESI-MSm/z:363.1[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:7.91 (1H,d,J=7.6 Hz,H-2),6.72 (1H,d,J=7.6 Hz,H-6),6.47 (1H,d,J=7.6 Hz,H-8),6.17 (1H,d,J=7.6 Hz,H-3),4.96 (1H,d,J=7.6 Hz,H-glc-1),3.72 (1H,dd,J=9.6,7.6 Hz,H-glc-6a), 3.21-3.64 (5H,m,H-glc-2,3,4,5,6b);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:121.3 (C-1),157.4 (C-2),111.2 (C-3),183.5 (C-4),162.3 (C-5),100.4 (C-6), 164.2 (C-7),95.1 (C-8),156.4 (C-9),107.2 (C-10),99.8 (C-glc-1),72.1 (C-glc-2), 76.3 (C-glc-3),70.2 (C-glc-4),75.1 (C-glc-5),59.4 (C-glc-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致,故鑒定為7-β-D-glucosyloxy-5-hydroxy-chromone。
化合物15:白色粉末,ESI-MSm/z:342.7[M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ:5.41 (1H,t,J=9.6 Hz,H-14),4.91 (1H,brs,H-17a),4.63 (1H,brs,H-17b),4.08 (2H,d,J=5.5 Hz,H-15),1.72 (3H,s,H-16),1.18 (3H,s,H-20),0.62 (3H,s,H-18);13C-NMR (CD3OD,150 MHz)δ:40.1 (C-1),19.7 (C-2),39.2 (C-3),45.1 (C-4),57.4 (C-5),27.5 (C-6),39.1 (C-7),149.5 (C-8),57.2 (C-9),41.3 (C-10),21.8 (C-11),39.2 (C-12),139.6 (C-13),123.1 (C-14),60.2 (C-15),17.1 (C-16),107.2 (C-17),30.4 (C-18),183.2 (C-19),13.4 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致,故鑒定為isocupressic acid。
選取2021年1月至2月在河南省中醫(yī)院耳鼻喉科行鼻內(nèi)鏡術(shù)患者5例,經(jīng)知情同意后取其下鼻甲黏膜,生理鹽水沖洗,除去表層血及組織黏液后進(jìn)行粉碎,加入膠原酶,在36.8 ℃下培養(yǎng)4 h,5 ℃、3 000 r/min離心 5 min,吸棄上層清液,加入DMEM培養(yǎng)基,在36.8 ℃下培養(yǎng)4 h,去除成纖維組織,將懸浮細(xì)胞置于96孔板中,在36.8 ℃下培養(yǎng)36 h,再用含生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d。取鼻黏膜上皮細(xì)胞,隨機(jī)分為化合物組(80 mg/L LPS+1、5、10 mg/L化合物)、對照組(80 mg/L LPS+等體積生理鹽水)、陽性組(80 mg/L LPS +1 mg/mL苯環(huán)喹溴銨),采用 MTT法[20]測定化合物1、5、12、15對鼻黏膜上皮細(xì)胞的影響,將其置于96孔板中,在36.8 ℃下培養(yǎng)36 h后加入LPS+化合物1、5、12、15,80 mg/L LPS+等體積生理鹽水,80 mg/L LPS +1 mg/mL苯環(huán)喹溴銨,孵育36 h后,加入15 μL含6 mg/mL MTT的PBS溶液,繼續(xù)孵育4.0 h,移棄上層培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,輕輕搖勻,在510 nm波長處檢測光密度,計算細(xì)胞相對存活率,公式為細(xì)胞相對存活率=(化合物組光密度/對照組光密度)×100%。結(jié)果,5、10 mg/L化合物1及1、5、10 mg/L 化合物5可提高鼻黏膜上皮細(xì)胞的相對存活率,見表1。
表1 各化合物對鼻黏膜上皮細(xì)胞的相對存活率的影響
本研究從甘露子中分離得到15個化合物,均為首次從該植物中分離得到,其中化合物1、4~5、10~11、14~15為首次從該屬植物中分離得到。另外,5、10 mg/L化合物1及1、5、10 mg/L化合物5對鼻黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究豐富了甘露子化學(xué)成分的資料庫,為修復(fù)鼻黏膜新藥的開發(fā)提供了參考。