玉泉丸對糖尿病腎病大鼠GSK-3β/Nrf2通路及YKL-40表達的影響

陳 燁， 賈崇高， 唐英騫， 王 昱

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，約50%的患者會被最終確診[1]，它也是導致終末期腎衰竭的主要原因[2]。玉泉丸是由葛根、天花粉、地黃、麥冬、五味子、甘草組成的中成藥，具有養(yǎng)陰生津、止渴除煩、益氣和中等功效，能降低2型糖尿病患者血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平，減輕炎癥反應[3]。

腎小球內(nèi)皮損傷是引起炎癥反應及糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要特征[4]，幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1(chtinase-3-like protein-1，YKL-40)在多種炎癥疾病中高表達，被公認為早期診斷糖尿病腎病的潛在生物標志物[5]。細胞核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是內(nèi)源性抗氧化反應的主要調(diào)節(jié)因子[6]，鋅可通過上調(diào)Nrf2及其下游因子蛋白表達和糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)磷酸化水平延緩糖尿病腎病的發(fā)展[7]。目前，玉泉丸對大鼠GSK-3β/Nrf2通路及腎小球內(nèi)皮損傷標志物YKL-40表達的影響尚無報道，故本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)結(jié)合一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備大鼠糖尿病腎病模型，研究該制劑對GSK-3β/Nrf2通路及腎小球內(nèi)皮損傷標志物YKL-40表達的影響，為其臨床相關治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康SPF級SD大鼠(雄性，體質(zhì)量200～220 g，6～8周齡)購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黔)2018-0001，符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規(guī)定，按照3R原則給予人道的關懷照顧。實驗前于12 h/12 h光暗循環(huán)、溫度20～25 ℃、相對濕度60%～70%條件下，單籠、普通飼料適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物 玉泉丸購自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司(0.15 g/丸，國藥準字Z51021085，批號20191209)，與生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2 g/mL的混懸液。鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(0.5 g/片，國藥準字H20023370，批號20200327)，與生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的混懸液。

1.3 試劑和儀器 大鼠YKL-40、內(nèi)皮素(endothelin，ET)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，批號分別為2396-40、256353-34；TNF-α、IL-6、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為ml821037、ml005039-C、ml510373、ml148201、ml053049-J；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司，批號分別為BC4705、BC4913；STZ(純度>98%)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司，批號分別為L2817、L2910、L3015；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為ZA-0211、ZA-0614；磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、GSK-3β、Nrf2鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司，批號分別為ab50163、ab50227、ab30549、ab1003。CL-7000型全自動生化分析儀購自日本島津公司；尼康SMZ745型光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；Fax-2100型酶標儀購自美國INStat公司；ChemiDoc-MP型凝膠成像分析系統(tǒng)購自山東三瑞科技有限公司；1704150型轉(zhuǎn)膜儀、CHEF Mapper XA型電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后，選取健康、狀態(tài)良好、血糖正常者，采用Zhao等[8]報道的方法制備糖尿病腎病模型，隨機分為造模組(54只)和正常組(10只)，造模組大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg，STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液中)，繼續(xù)使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)；正常組大鼠普通飼料喂養(yǎng)8周后，注射等體積檸檬酸鹽緩沖液，繼續(xù)使用普通飼料喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)4周后，檢測大鼠尿量及尿蛋白排泄率，糖尿病造模成功標準為腹腔注射STZ 72 h后，靜脈血糖高于16.7 mmol/L；糖尿病腎病造模成功標準為尿量>原尿量150%，尿蛋白排泄率>30 mg/24 h[9]。54只造模組大鼠中死亡1只，未造模成功3只，將造模成功的50只再隨機分為模型組，玉泉丸低、中、高(4、8、12 g/kg)劑量組[10]和二甲雙胍(50 mg/kg)組[11](陽性對照)，各組灌胃給予對應劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予生理鹽水，灌胃容量均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)21 d。

2.2 大鼠生化指標檢測 末次給藥結(jié)束后收集大鼠24 h尿液，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)深度麻醉以實施安樂死，采集靜脈血約10 mL，其中5 mL于3 000 r/min離心5 min后取血清(剩余5 mL置于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA檢測)，采用免疫透射比濁法，通過全自動生化分析儀檢測血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平。

2.3 HE染色觀察大鼠腎組織病理學變化 大鼠實施安樂死后摘取雙腎，迅速將右側(cè)腎組織置于4%多聚甲醛中固定，而左側(cè)腎組織置于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)ELISA和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測，組織脫水，石蠟包埋，切片機切成5 μm薄片，按照HE染色試劑盒說明書進行染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化。根據(jù)發(fā)生病變腎小管和腎小球(腎小球萎縮，腎小管出現(xiàn)胞漿脫落及管腔擴張，間質(zhì)區(qū)出現(xiàn)炎性細胞浸潤)所占總腎小管和腎小球的比例進行評分[12]，未發(fā)生病變計為0分，病變面積<25%計為1分，病變面積≥25%但<50%計為2分；病變面積≥50%但<75%計為3分；病變面積≥75%計為4分。

2.4 ELISA檢測大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平 取“2.2”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠血液，低溫融化，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，嚴格按照相關試劑盒說明書操作方法檢測YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平，平行6次。

2.5 ELISA檢測大鼠腎組織SOD、CAT活性和MDA水平 取“2.3”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠腎組織，于冰臺上用生理鹽水制成組織勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心15 min后取組織上清液，嚴格按照相關試劑盒說明書操作方法，采用酶標儀檢測SOD、CAT活性和MDA水平。

2.6 免疫組織化學法檢測大鼠腎組織YKL-40表達 將“2.3”項下大鼠腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)高溫修復抗原，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，加入YKL-40鼠抗(1∶150)，37 ℃孵育30 min后4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶100)，ECL試劑盒顯色5～20 min后在光學顯微鏡下觀察，隨機選取5個腎小球視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析棕黃色顆粒部分面積占視野總面積的比值，即為YKL-40陽性表達指數(shù)值(positive index，PI)。

2.7 Western blot法檢測大鼠腎組織GSK-3β、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達 取“2.3”項下-80 ℃冰箱保存的大鼠腎組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量，取50 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，抗體封閉，1∶2 000稀釋后的GSK-3β、p-GSK-3β、Nrf2、β-actin鼠抗4 ℃過夜孵育，添加含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參檢測蛋白表達，平行3次。

3 結(jié)果

3.1 玉泉丸對大鼠生化指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素、24 h尿微量白蛋白水平降低(P<0.01)，見表1。

3.2 玉泉丸對大鼠腎組織病理學變化的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎小球直徑縮小，系膜區(qū)基質(zhì)增多，腎小管出現(xiàn)不同程度的空泡樣變性和胞漿脫落，部分可見腎小管管腔，間質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，腎組織病理學評分升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎小球直徑增大，系膜基質(zhì)增生減輕，腎小管損傷趨于修復，炎性細胞浸潤減少，腎組織病理學評分降低(P<0.01)，見圖1、表2。

表1 各組大鼠生化指標

注：藍色箭頭表示腎小球萎縮，黑色箭頭表示腎小管胞漿脫落及管腔擴張，黃色箭頭表示間質(zhì)炎性細胞浸潤。圖1 各組大鼠腎組織病理變化(×400)Fig.1 Renal tissue histopathological changes of rats in various groups (×400)

表2 各組大鼠腎組織病理評分(分，

3.3 玉泉丸對大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平降低(P<0.01)，見表3。

3.4 玉泉丸對大鼠腎組織SOD、CAT活性及MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織SOD、CAT活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織SOD、CAT活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見表4。

表3 各組大鼠血清YKL-40、TNF-α、IL-6、ET水平

3.5 玉泉丸對大鼠腎組織YKL-40表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織YKL-40陽性表達指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織YKL-40陽性表達指數(shù)降低(P<0.01)，見圖2、表5。

表4 各組大鼠腎組織SOD、CAT活性及MDA水平

圖2 各組大鼠腎組織YKL-40表達(×400)Fig.2 Renal tissue YKL-40 expressions in rats in various groups (×400)

表5 各組大鼠腎組織YKL-40表達陽性指數(shù)

3.6 玉泉丸對大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，玉泉丸低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達升高(P<0.01)，見圖3、表6。

注：A為正常組，B為模型組，C為玉泉丸低劑量組，D為玉泉丸中劑量組，E為玉泉丸高劑量組，F(xiàn)為二甲雙胍組。圖3 各組大鼠腎組織GSK-3β、Nrf2蛋白表達Fig.3 Renal tissue protein expressions of GSK-3β and Nrf2 in rats in various groups

4 討論

玉泉丸在臨床上適用于治療因胰島素功能減退而引起的物質(zhì)代謝、碳水化合物代謝紊亂，消渴癥、肺胃腎陰虧虛、熱病后期等病癥[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，玉泉丸降低糖尿病腎病大鼠TNF-α、IL-6、MDA水平，繼而減少腎組織間質(zhì)區(qū)炎性細胞浸潤，并呈劑量依賴性地降低糖尿病腎病大鼠血糖和血脂水平，提高腎組織SOD和CAT活性，這些變化伴隨著糖尿病腎病大鼠24 h尿微量白蛋白的減少、腎功能的改善以及腎組織損傷的緩解，與彭聰?shù)萚14]報道在2型糖尿病腎病患者中玉泉丸所發(fā)揮的腎臟保護機制一致，表明玉泉丸可通過降低血糖血脂、炎性因子浸潤及氧化應激反應，從而減少腎組織損傷，改善腎功能。

表6 各組大鼠腎組織p-GSK-3β/GSK-3β、Nrf2蛋白表達

長期高糖會產(chǎn)生血管病變，進而引起血管損傷，YKL-40在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用[15]。在本研究中，糖尿病腎病大鼠模型YKL-40和ET水平升高，伴隨著腎小球直徑縮小、系膜區(qū)基質(zhì)增多，腎小管出現(xiàn)不同程度的空泡樣變性和胞漿脫落，使腎組織病理學評分升高。隨著玉泉丸劑量的升高，YKL-40和ET水平依次降低；腎組織損傷逐漸減輕，腎組織病理學評分逐漸降低，推測玉泉丸減少腎組織損傷，改善腎功能可能與糖尿病腎病大鼠腎小球內(nèi)皮損傷標志物YKL-40水平緊密相關。

糖尿病腎病由多種因素相互作用引起，包括炎癥介質(zhì)、致纖因子、氧化應激和細胞凋亡等[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達降低，提示GSK-3β/Nrf2通路在糖尿病腎病大鼠模型中處于抑制狀態(tài)，與Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導的心肌細胞中，p-GSK-3β和Nrf2蛋白表達下調(diào)，心肌細胞受損的研究結(jié)果具有一致性。激活GSK-3β/Nrf2抗氧化途徑可減輕糖尿病腎病引起的腎損傷[18]，Nrf2的上調(diào)參與非諾貝特對1型糖尿病腎病小鼠的腎臟保護作用[19]。Feng等[20]研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可通過激活GSK-3β/Nrf2信號通路抑制炎癥和氧化應激，改善脂多糖誘導的大鼠急性腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)玉泉丸能提高p-GSK-3β/GSK-3β和Nrf2蛋白表達，且呈劑量依賴性，與上述研究結(jié)果一致，因此推測玉泉丸可能通過激活GSK-3β/Nrf2通路，降低腎小球內(nèi)皮損傷標志物YKL-40水平，減輕氧化應激和炎癥反應。

綜上所述，在STZ誘導的糖尿病腎病大鼠模型中，玉泉丸可有效降低腎小球內(nèi)皮損傷標志物YKL-40表達，降低血糖和血脂，減輕氧化應激和炎癥反應，改善腎功能，可能與激活GSK-3β/Nrf2通路有關，可為相關臨床治療提供參考。