連翹提取物對(duì)LPS所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

喻 虹， 崔 躍， 劉 濤， 楊梅英， 陳 芬

(1.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430015；2.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430015；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

敗血癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)，為全球范圍內(nèi)主要的死亡原因[1]，其中心血管功能障礙是敗血癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要指標(biāo)之一[2]。線粒體的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡已被證明在敗血癥誘發(fā)的心肌功能障礙中起關(guān)鍵作用[2]，PVT1作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在各種癌癥中均具有顯著的致癌活性[3]，并參與心肌缺血/再灌注損傷[4]、心房纖維化[5]等病理過(guò)程，在LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，與膿毒癥急性肺損傷密切相關(guān)[6]。

連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功，其多種生物活性，尤其是抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌已得到充分認(rèn)可[7]，而且其提取物還被證明在膿毒血癥小鼠模型中通過(guò)降低氧自由基的炎性因子等起保護(hù)作用[8]。在對(duì)抗LPS損傷方面，連翹酯苷A以劑量依賴方式抑制LPS誘發(fā)的急性損傷[9]。但尚未研究PVT1的表達(dá)是否受連翹提取物的影響及其是否參與連翹提取物的心肌保護(hù)活性。因此，本研究假設(shè)在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中，連翹提取物可減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，同時(shí)采用小干擾RNA干擾心肌細(xì)胞中PVT1的表達(dá)，以期為該藥材在心肌損傷治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)L2880；Dulbecco’s modified Eagle(DMEM)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)11668-019；異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京Vazyme生物公司，貨號(hào)A211-02；乳酸脫氫酶(lactate dehydrofenase，LDH，貨號(hào)C0016)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，貨號(hào)S0109)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，貨號(hào)S0131S)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，貨號(hào)S0056)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海Beyotime生物技術(shù)公司；活化的(cleaved)-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)抗體(貨號(hào)ab214430)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(貨號(hào)ab181602)、pro-caspase3抗體(貨號(hào)ab32499)、辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體(貨號(hào)ab205718)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

連翹提取物的制備參照Z(yǔ)hao等[10]報(bào)道的方法，取500 g藥材，以1∶5料液比加入80%乙醇，超聲提取1 h，共3次，合并提取液，減壓(45 ℃)濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀物質(zhì)(62.2 g)，DMEM培養(yǎng)基稀釋成5、20、80 ng/mL。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 心肌細(xì)胞H9c2在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)、飽和濕度、5% CO2、37 ℃條件下生長(zhǎng)，在連翹提取物實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期者隨機(jī)分為對(duì)照組(未加藥物處理)，模型組(1 μg/mL LPS作用24 h[11])及低、中、高劑量連翹提取物組(分別給予5、20、80 ng/mL提取物和1 μg/mL LPS作用24 h)；在PVT1實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期者隨機(jī)分為si-NC組(轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對(duì)照si-NC和1 μg/mL LPS)、si-PVT1組(轉(zhuǎn)染PVT1小干擾RNA si-PVT1和1 μg/mL LPS)、高劑量連翹提取物組+pcDNA組(轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)空載體pcDNA、高劑量80 ng/mL連翹提取物和1 μg/mL LPS)、高劑量連翹提取物組+pcDNA-PVT1組(轉(zhuǎn)染過(guò)表PVT1、高劑量80 ng/mL連翹提取物和1 μg/mL LPS)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將si-NC、si-PVT1、pcDNA-PVT1、pcDNA(上海吉瑪公司)轉(zhuǎn)染匯合至60%左右的H9c2細(xì)胞中，24 h后分組處理，通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 參照FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)指示，將冷磷酸鹽緩沖液洗滌后的心肌細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，分別用膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色，在室溫下避光孵育，15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達(dá) H9c2細(xì)胞在放射免疫沉淀緩沖液裂解以提取蛋白，吸取30 μg樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在5%脫脂牛奶封閉液中封閉膜，室溫下孵育1 h，將聚偏二氟乙烯膜與抗cleaved-caspase3(1∶1 000)、抗pro-caspase3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)抗體孵育過(guò)夜，用HRP標(biāo)記的IgG抗體室溫孵育1 h，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行顯影，Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.5 試劑盒檢測(cè)H9c2細(xì)胞中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性 3 000 r/min離心H9c2細(xì)胞10 min，收集上清液，按照相關(guān)試劑盒操作說(shuō)明，分別采用硫代巴比妥酸顯色法、氮藍(lán)四唑顯色法、基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)、NADPH法檢測(cè)MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)PVT1表達(dá) 采用TRIzol試劑從H9c2細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Green PCR Mix和引物通過(guò)RT-qPCR擴(kuò)增cDNA模板，PVT1正向引物5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，反向引物5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，反向引物5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，再采用2-ΔΔCt法計(jì)算PVT1表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2細(xì)胞損傷的影響 如圖1、表1所示，與對(duì)照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組H9c2細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而低劑量連翹提取物組凋亡率，cleaved-caspase3、pro-caspase3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組細(xì)胞的凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。

2.2 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2細(xì)胞中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，而低劑量連翹提取物組MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性無(wú)明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。

表1 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2損傷的影響

表2 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

2.3 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2細(xì)胞中PVT1表達(dá)的影響 如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組及低、中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，低劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與低劑量連翹提取物組比較，中、高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與中劑量連翹提取物組比較，高劑量連翹提取物組PVT1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。

2.4 干擾PVT1對(duì)LPS處理H9c2細(xì)胞損傷及MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如圖2、表4所示，與si-NC組比較，si-PVT1組H9c2細(xì)胞的PVT1 mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、MDA水平、LDH活性、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性及pro-caspase3蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。

表3 連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2中PVT1 mRNA表達(dá)的影響

圖2 干擾PVT1對(duì)LPS處理H9c2凋亡(B)及caspase3蛋白表達(dá)(B)的影響Fig.2 Effects of PVT1-targeting interference on apoptosis (A) and caspase 3 protein expression (B) of LPS-treated H9c2 cells

表4 干擾PVT1對(duì)LPS處理H9c2損傷及MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

2.5PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2細(xì)胞損傷的影響 如圖3、表5所示，與高劑量連翹提取物+pcDNA組比較，高劑量連翹提取物+pcDNA-PVT1組細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

圖3 過(guò)表達(dá)PVT1對(duì)連翹提取物作用的LPS處理H9c2凋亡(A)及caspase3蛋白表達(dá)(B)的影響Fig.3 Effects of PVT1 overexpression on apoptosis (A) and Caspase3 protein expression (B) of H9c2 cells co-treated with LPS and Forsythia suspensa extract

表5 PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2損傷的影響

2.6PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響 如表6所示，與高劑量連翹提取物+pcDNA組比較，高劑量連翹提取物+pcDNA-PVT1組細(xì)胞中MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)。

表6 PVT1逆轉(zhuǎn)連翹提取物對(duì)LPS處理H9c2中MDA水平及SOD、LDH、GSH-Px活性的影響

3 討論

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是LPS誘導(dǎo)的心肌損傷的重要事件[12]。MDA通常作為氧化損傷的指標(biāo)，用于評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，也可作為細(xì)胞損傷的間接指標(biāo)[12]。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，反映細(xì)胞清除自由基的能力[13]。LDH是原代心肌細(xì)胞死亡的可靠標(biāo)志[14]。在本研究中，20、80 ng/mL連翹提取物降低了LPS處理后心肌細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平和LDH活性，還可以提高細(xì)胞中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，表明連翹提取物具有保護(hù)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的功能，這可能歸因于其抗氧化特性[15]。此前，連翹被證明能夠減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[16]，通過(guò)提升抗氧化防御機(jī)制減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠炎性肝損傷，表現(xiàn)為減弱活性氧和MDA的產(chǎn)生，增加SOD和GSH-Px活性[10]，本研究的結(jié)果與之吻合。細(xì)胞凋亡可以由氧化應(yīng)激觸發(fā)，涉及凋亡相關(guān)蛋白caspase3的裂解[17]，本實(shí)驗(yàn)中20、80 ng/mL連翹提取物降低LPS處理H9c2細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3表達(dá)，提高pro-caspase3表達(dá)，表明連翹提取物具有一定的心肌保護(hù)功能。

在本研究中，連翹提取物可降低LPS誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞中PVT1的表達(dá)。PVT1被證明介導(dǎo)心肌損傷過(guò)程，例如在阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性中，PVT1呈現(xiàn)高表達(dá)，降低PVT1的表達(dá)可減少心肌細(xì)胞的凋亡[18]。在LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷模型中，PVT1促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷?？梢?jiàn)PVT1加劇LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中，干擾PVT1可以抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減輕LDH和MDA的產(chǎn)生，并提高SOD、GSH-Px活性。根據(jù)報(bào)道，姜黃素通過(guò)抑制小鼠腎臟組織中PVT1的表達(dá)，減少LPS誘導(dǎo)的膿毒性急性腎臟損傷[19]。為了進(jìn)一步研究連翹提取物的抗氧化和抗凋亡作用是否與PVT1有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PVT1過(guò)表達(dá)后，連翹提取物對(duì)LPS處理的H9c2細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3表達(dá)、MDA水平、LDH活性的抑制和對(duì)pro-caspase3表達(dá)、SOD及GSH-Px活性的促進(jìn)在很大程度上被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，PVT1參與連翹提取物保護(hù)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過(guò)程，并提示PVT1的下調(diào)可能是治療心肌損傷的可行策略。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了連翹提取物通過(guò)抑制PVT1的表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，連翹提取物可能成為預(yù)防心肌損傷的潛在治療劑，并且針對(duì)PVT1的抗氧化劑治療可以預(yù)防心肌損傷。