筋骨傷噴霧劑HPLC指紋圖譜建立及8種成分測(cè)定

王彬宇， 黃家宇， 陳思憶， 杜秋瑩， 魯婷婷， 張 會(huì)， 李 莉

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

筋骨傷噴霧劑由赤脛散、淫羊藿、赤芍、地龍、制草烏、薄荷腦組成，具有舒筋活絡(luò)、消腫止痛、散瘀止血的功效[1]，臨床用于治療軟組織損傷[2-3]，已收載于2019年版《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄》。但該制劑質(zhì)量控制方法有局限，除了標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別和對(duì)芍藥苷含量測(cè)定外，前期僅有對(duì)幾種成分含量測(cè)定的報(bào)道[4-5]，缺乏全面評(píng)價(jià)。

指紋圖譜技術(shù)可對(duì)已知或未知成分進(jìn)行分析，在有效成分不完全明確的情況下，能較為全面地反映中藥制劑中化學(xué)成分的相對(duì)關(guān)系，其中以HPLC為基礎(chǔ)的指紋圖譜適用性強(qiáng)，是質(zhì)量評(píng)價(jià)和新藥研發(fā)中最常用的方法[6-10]。本實(shí)驗(yàn)建立了筋骨傷噴霧劑HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，以期表征該制劑所含成分的整體特性，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(配置DAD紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；MS105DU電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。筋骨傷噴霧劑共14批(100 mL/瓶，批號(hào)分別為20180901、20181105、20190102、20190302、20190408、20190502、20190801、20191003、20191006、20191101、20191107、20200102、20200401、20200604，編號(hào)S1～S14，貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司)。沒(méi)食子酸乙酯對(duì)照品(批號(hào) 120915，純度≥98%)購(gòu)自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；鞣花酸對(duì)照品(批號(hào) GZDD-0272，純度≥98%)購(gòu)自貴州迪大科技有限責(zé)任公司；沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-201204)、芍藥苷(批號(hào)110736-201337)、淫羊藿苷(批號(hào)110737-200415)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；朝藿定B(批號(hào) wkq20081309)、山柰苷(批號(hào) wkq20081904)、朝藿定C(批號(hào) wkq20042308)對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%。乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACE C18-AR色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～10%A；5～45 min，10%～15%A；45～50 min，15%～17%A；50～55 min，17%～20%A；55～80 min，20%～30%A；80～100 min，30%～100%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230、254、270 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為5.23、5.14、10.32、5.11、0.98、1.07、4.05、1.28 mg/mL的貯備液，分別量取適量，甲醇稀釋，即得(每1 mL分別含沒(méi)食子酸523.00 μg、沒(méi)食子酸乙酯257.00 μg、芍藥苷1 032.00 μg、鞣花酸265.72 μg、山柰苷98.00 μg、朝藿定B 117.70 μg、朝藿定C 405.00 μg、淫羊藿苷128.00 μg)。

2.2.2 供試品溶液 取噴霧劑適量，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 單味藥材溶液 取赤脛散、淫羊藿、赤芍、制草烏、地龍適量，按相關(guān)工藝制備，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例及制備工藝，制備缺赤脛散、缺淫羊藿、缺赤芍、缺赤脛散和赤芍的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取本品(S7)適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，以鞣花酸(15號(hào)峰)為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.85%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.26%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(S7)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以鞣花酸(15號(hào)峰)為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.84%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(S7)適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以鞣花酸(15號(hào)峰)為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.40%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.78%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取14批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)軟件，以S1為參照?qǐng)D譜，選擇中位數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.3 min，生成對(duì)照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰重疊與匹配，共標(biāo)定36個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1。

圖1 14批樣品HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for fourteen batches of samples

2.3.5 共有峰指認(rèn)及歸屬 將對(duì)照指紋圖譜與對(duì)照品保留時(shí)間、紫外吸收光譜進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)了8種成分，分別為4號(hào)峰(沒(méi)食子酸)、12號(hào)峰(沒(méi)食子酸乙酯)、14號(hào)峰(芍藥苷)、15號(hào)峰(鞣花酸)、18號(hào)峰(山柰苷)、25號(hào)峰(朝藿定B)、26號(hào)峰(朝藿定C)、27號(hào)峰(淫羊藿苷)，其中鞣花酸分離度較好，保留時(shí)間適中，峰面積最大，峰型穩(wěn)定，而且在所有樣品中均存在，故選擇其作為參照峰(S)，色譜圖見(jiàn)圖2。將單味藥材圖譜與樣品圖譜進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)14號(hào)峰來(lái)源于赤芍，15號(hào)峰來(lái)源于赤脛散，18、25、26、27號(hào)峰來(lái)源于淫羊藿，4、12號(hào)峰為赤脛散與赤芍共有，色譜圖見(jiàn)圖3。以鞣花酸保留時(shí)間、峰面積為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.73%，表明其出峰時(shí)間較穩(wěn)定；相對(duì)峰面積RSD在0～118.23%之間，表明各批樣品中不同成分含量差異較大。

4.沒(méi)食子酸 12.沒(méi)食子酸乙酯 14.芍藥苷 15.鞣花酸 18.山柰苷 25.朝藿定B 26.朝藿定C 27.淫羊藿苷4.gallic acid 12.ethyl gallate 14.paeoniflorin 15.ellagic acid 18.kaempferin 25.epimedin B 26.epimedin C 27.icariin圖2 對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint

2.3.6 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)軟件測(cè)定14批樣品相似度，結(jié)果見(jiàn)表1，可知相似度均大于0.916，表明各批樣品之間具有較高的相似性。

2.4 各成分含量測(cè)定

2.4.1 系統(tǒng)適用性考察 取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液各5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，陰性無(wú)干擾，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于17 000。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取本品(S7)適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積RSD分別為2.30%、2.30%、2.29%、2.45%、2.70%、2.34%、2.42%、2.43%，表明儀器精密度良好。

4.沒(méi)食子酸 12.沒(méi)食子酸乙酯 14.芍藥苷 15.鞣花酸18.山柰苷 25.朝藿定B 26.朝藿定C 27.淫羊藿苷4.gallic acid 12.ethyl gallate 14.paeoniflorin 15.ellagic acid18.kaempferin 25.epimedin B 26.epimedin C 27.icariin圖4 各成分HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(S7)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積RSD分別為1.42%、2.27%、1.38%、1.21%、2.25%、2.08%、1.79%、1.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(S7)適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積RSD分別為0.24%、2.06%、0.89%、1.63%、0.78%、0.83%、0.54%、0.49%，表明溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的同一批本品(S7)2 mL，共6份，置于5 mL量瓶中，加入對(duì)照品溶液適量，甲醇定容，混勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷平均加樣回收率分別為98.92%、94.02%、99.84%、101.32%、94.15%、106.61%、93.37%、103.74%，RSD分別為1.38%、0.47%、2.83%、0.46%、0.80%、0.73%、1.07%、2.45%。

2.4.7 樣品含量測(cè)定 取14批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸分離度較高，色譜峰較多。再采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，通過(guò)各色譜峰響應(yīng)來(lái)確定波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)間。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/mL，n=3)

3.2 指標(biāo)成分選擇 赤脛散中沒(méi)食子酸、鞣花酸具有抗炎、抗菌活性[11-12]，不良反應(yīng)小，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)療領(lǐng)域；赤芍中沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷具有抗氧化抗菌活性[13-14]；異戊烯基黃酮及其苷類(山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷)是淫羊藿主要活性成分，具有抗骨質(zhì)疏松方面的藥理作用[15-16]。上述8種成分藥理作用均與筋骨傷噴霧劑功能主治相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)選擇它們進(jìn)行含量測(cè)定。

3.3 HPLC指紋圖譜、含量測(cè)定分析 14批樣品HPLC指紋圖譜中標(biāo)定了36個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中8個(gè)；相似度均大于0.9，圖譜形貌基本一致，表明成分組成、出峰時(shí)間均一，但相對(duì)峰面積RSD略大；不同批次樣品中同一成分含量也有所差異，可能與藥材產(chǎn)地、貯藏條件及時(shí)間等因素有關(guān)。因此，在筋骨傷噴霧劑生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)控制藥材來(lái)源，規(guī)范貯藏條件，并關(guān)注各成分含量變化。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了筋骨傷噴霧劑HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯、芍藥苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，這種指紋圖譜定性結(jié)合有效成分定量的方法快速簡(jiǎn)便，分離度良好，化學(xué)成分信息豐富，可對(duì)該制劑進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)并反映其內(nèi)在質(zhì)量，從而為進(jìn)一步質(zhì)量控制提供參考。