人乳頭狀瘤病毒相關(guān)性口咽鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理學(xué)特征分析

張 巖，陳彤箴，朱曉麗，李小秋

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，復(fù)旦大學(xué)病理研究所，上海 200032

口咽鱗狀細(xì)胞癌（oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC）是指發(fā)生在扁桃體、舌根、軟腭和口咽壁等部位的惡性腫瘤。近30年來，由于吸煙和飲酒人群占比降低，頭頸部（口腔、下咽及喉）鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率開始下降，但是OPSCC的發(fā)病率卻有明顯上升趨勢(shì)［1］。既往研究［2-4］表明，人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）在西方國家OPSCC中的檢出率為40%～80%，提示HPV感染是OPSCC發(fā)生的重要致病因素之一［1，5-6］。OPSCC-HPV現(xiàn)被認(rèn)為是一種獨(dú)立的腫瘤類型，被列入第四版世界衛(wèi)生組織《頭頸部腫瘤分類》［7］中。第8版美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）口腔及口咽癌分期系統(tǒng)［8］新增了OPSCC-HPV TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。為加深對(duì)該腫瘤的認(rèn)識(shí)，我們分析了64例OPSCC-HPV患者的臨床病理學(xué)特征和鑒別診斷，并比較了第7版［9］和第8版AJCC口咽癌臨床TNM分期。

1 資料和方法

1.1 病例來源

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2013年10月—2019年7月診斷的64例OPSCC-HPV患者，其中46例系會(huì)診病例，18例系本院常規(guī)外檢病例。調(diào)閱所有病理學(xué)切片，由2名有經(jīng)驗(yàn)的?？撇±砜漆t(yī)師獨(dú)立復(fù)核診斷。第四版世界衛(wèi)生組織《頭頸部腫瘤分類》推薦口咽癌中的腫瘤細(xì)胞P16免疫組織化學(xué)染色彌漫陽性可以作為高危型HPV感染的替代指標(biāo)，因此本研究的病例納入標(biāo)準(zhǔn)為HPV陽性或P16免疫組織化學(xué)染色彌漫陽性的OPSCC。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋和常規(guī)4 μm切片，分別作H-E染色。免疫組織化學(xué)染色采用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀BenchMark XT（美國Roche公司），所用一抗P16、P63、Ki-67和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）均購自美國Roche公司（克隆號(hào)分別為E6H4、4A4、30-9和5B7），細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）5/6和P40均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（克隆號(hào)為D5/16B4和ZR8），CAM5.2多克隆抗體購自美國Becton Dickinson公司。

1.3 HPV DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)

從石蠟組織中提取基因組DNA，采用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HPV。HPV基因分型檢測(cè)試劑盒購自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司?？蓹z測(cè)23種HPV亞型，包括高危型HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83和低危型HPV-6、11、42、43、81。

1.4 Epstein-Barr病毒早期RNA（Epstein-Barr virus early RNA，EBER）原位雜交檢測(cè)

使用地高辛標(biāo)記的EBER1/2 DNA探針檢測(cè)腫瘤中Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）編碼的EBER。EBV檢測(cè)試劑盒購自福州泰普生物科學(xué)有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料（表1）

表1 64例OPSCC-HPV患者的臨床病理學(xué)特征Tab.1 Clinicopathological features of 64 patients with OPSCC-HPV

64例患者中，男性50例，女性14例。發(fā)病年齡33～76歲，平均年齡55.1歲。44例位于扁桃體，4例位于舌根，9例位于口咽壁，7例同時(shí)累及扁桃體、舌根和口咽壁。36例以進(jìn)行性增大的頸部包塊為首發(fā)癥狀，18例以咽痛、扁桃體痛或異物感為首發(fā)癥狀，2例同時(shí)出現(xiàn)頸部包塊和咽部不適。57例伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中30例影像學(xué)檢查提示伴囊性變（圖1A）。至少23例有口交性行為史，40例有長期吸煙和（或）飲酒史。6例先后或同時(shí)出現(xiàn)第二原發(fā)癌。6例初次就診時(shí)被診斷為原發(fā)不明的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鱗癌，12～56個(gè)月后再次出現(xiàn)頸部包塊增大（圖1B）或原發(fā)灶癥狀，繼而在口咽部位查見原發(fā)灶（圖1C）。33例行放化療，23例行手術(shù)+放化和（或）化療，3例行放療，1例行化療，1例觀察隨訪。隨訪時(shí)間2～77個(gè)月（平均21.6個(gè)月，中位16.0個(gè)月），2例局部復(fù)發(fā)，6例頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1例頸椎轉(zhuǎn)移，3例死亡，其中2例死于腫瘤破裂大咯血。比較第7版和第8版AJCC臨床分期，T分期不變，第8版N2期全部降級(jí)為N1期。第8版臨床總分期明顯降級(jí)，Ⅰ～Ⅱ期患者占比增加85.4%，Ⅲ期降低52.7%，Ⅳ期降低32.7%，新舊兩版臨床總分期一致率僅為3.6%（2/55）（表2）。

表2 第7版和第8版AJCC臨床分期比較Tab.2 Comparison of clinical stage between AJCC-7 and AJCC-8［n (%)］

2.2 病理學(xué)檢查

腫瘤最大徑0.3～4.3 cm，頸部轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)最大徑1.0～7.0 cm。鱗狀細(xì)胞癌63例，腺鱗癌1例。所有鱗狀細(xì)胞癌病例（包括腺鱗癌中的鱗狀細(xì)胞癌成分）主要呈非角化性鱗狀細(xì)胞癌形態(tài)。腫瘤細(xì)胞呈浸潤性生長，排列成大小不等、形態(tài)不規(guī)則的片狀、巢狀、索狀或簇狀（圖1D）。瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞質(zhì)少到中等量、嗜酸性；細(xì)胞核圓形或橢圓形，核膜清晰，染色質(zhì)細(xì)膩或呈空泡狀，核漿比高，核分裂象易見（圖1E）。33例可見腫瘤性壞死。3例表現(xiàn)為基底樣鱗癌形態(tài)（圖1F）。4例灶區(qū)呈乳頭狀形態(tài)。8例癌巢周邊細(xì)胞質(zhì)增多，H-E染色增強(qiáng)，出現(xiàn)反向成熟或驟然角化現(xiàn)象（圖1D）。4例腫瘤累及表面上皮。16例伴促結(jié)締組織增生性間質(zhì)反應(yīng)。45例腫瘤上皮巢內(nèi)見浸潤性淋巴細(xì)胞。1例腺鱗癌中的腺癌成分由分化好的腺腔組成（圖1G）。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)可伴壞死及囊性變（圖1H）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色

60例患者行P16免疫組織化學(xué)染色，其中59例腫瘤細(xì)胞呈細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的彌漫強(qiáng)陽性，表面正常鱗狀上皮及癌巢周邊出現(xiàn)反向成熟或驟然角化現(xiàn)象的腫瘤細(xì)胞均不表達(dá)P16（圖1I）。28例行P63染色，12例行P40染色，21例行CK5/6染色，19例行EGFR染色，腫瘤細(xì)胞均呈彌漫強(qiáng)陽性。在1例腺鱗癌中，鱗癌成分彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)CK5/6和P63，腺癌成分CAM5.2弱陽性，兩種成分P16均呈彌漫強(qiáng)陽性。28例行Ki-67染色，Ki-67增殖指數(shù)范圍30%～90%（平均69%），其中24例Ki-67增殖指數(shù)≥60%。

2.4 HPV DNA檢測(cè)

39例患者行HPV DNA檢測(cè)，均呈陽性結(jié)果，亞型全部為高危型病毒感染，其中HPV-16型36例（圖1J），HPV-18型1例，HPV-31型和HPV-53型同時(shí)陽性1例，HPV-58型1例。在39例HPV陽性患者中，P16陽性者34例，P16陰性者1例，P16未染者4例。余25例只行P16免疫染色，均示腫瘤細(xì)胞彌漫強(qiáng)陽性。

圖1 OPSCC-HPV典型圖像Fig.1 Typical images of OPSCC-HPV

2.5 EBV檢測(cè)

35例患者行EBER檢測(cè)，腫瘤組織中均無EBV檢出。

3 討 論

HPV是一種環(huán)狀雙鏈DNA性傳播病毒，整合到宿主DNA中，表達(dá)E6和E7癌蛋白，后者抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的活性，導(dǎo)致P16蛋白過表達(dá)，根據(jù)其致癌潛能分為高危組和低危組。HPV是OPSCC的1個(gè)重要致病因素。Lam等［10］分析中國香港地區(qū)207例OPSCC患者，發(fā)現(xiàn)P16高表達(dá)與HPV感染密切相關(guān)（P＜0.001），其靈敏度和特異度分別達(dá)到97.7%（42/43）和84.8%（139/164）。Ang等［11］研究認(rèn)為，P16是檢測(cè)口咽癌中HPV感染非?？煽康奶娲笜?biāo)。本組35例患者同時(shí)行P16和HPV檢測(cè)，二者一致率較高，達(dá)到97.1%（34/35）。值得注意的是，非病毒相關(guān)的改變也可以導(dǎo)致P16表達(dá)升高。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P16蛋白水平具有簡便、經(jīng)濟(jì)和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。對(duì)P16免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果的判讀非常重要，要結(jié)合組織學(xué)形態(tài)，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究把腫瘤細(xì)胞P16彌漫的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)著色判讀為陽性。

本研究的男性患者明顯多于女性，T分期較早，至少50%（23/46）的患者有口交性行為。75%（48/64）的腫瘤位于扁桃體和舌根，遠(yuǎn)高于發(fā)生于口咽壁者（14.1%，9/64），該結(jié)果接近Cianchetti等［12］的報(bào)道（85%），提示扁桃體和舌根是OPSCC-HPV較常見的發(fā)病部位。值得注意的是，56.3%（36/64）的患者以頸部包塊增大為首發(fā)癥狀就診，咽部癥狀不明顯，可能與原發(fā)灶腫瘤較小、位置較深及表面黏膜不常受累有關(guān)。此外，52.6%（30/57）的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)在影像學(xué)或組織學(xué)上具有壞死、囊性變的改變。Goldenberg等［13］也提出轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)囊性變是OPSCC-HPV的1個(gè)重要診斷線索。本研究樣本量較小，死亡病例數(shù)少，需通過擴(kuò)大樣本量和延長隨訪時(shí)間，更準(zhǔn)確地評(píng)估預(yù)后相關(guān)危險(xiǎn)因素。

本研究中所有鱗狀細(xì)胞癌（包括腺鱗癌中的鱗狀細(xì)胞癌成分）主要呈非角化性鱗狀細(xì)胞癌形態(tài)，這與已有研究［14-16］數(shù)據(jù)相似，表明非角化性鱗狀細(xì)胞癌是最常見類型。OPSCC-HPV的其他少見組織學(xué)類型包括淋巴上皮瘤樣癌［17］、腺癌［18］和神經(jīng)內(nèi)分泌癌［19］等，文獻(xiàn)報(bào)道的病例數(shù)較少，預(yù)后不一。

頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌，特別是出現(xiàn)分化較差、核呈空泡狀、核仁明顯等特征時(shí)，需與鼻咽癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行鑒別。Maxwell等［20］報(bào)道了1組EBV-/HPV+的鼻咽非角化性癌患者，此外，Polz-Gruszka等［21］報(bào)道了62例波蘭OPSCC患者中有6例（9.7%）共感染HPV/EBV。因此，通過檢測(cè)HPV和EBV有助于提示原發(fā)灶來源，但最終還是要結(jié)合臨床及影像學(xué)檢查綜合分析來判斷腫瘤原發(fā)灶。OPSCC-HPV轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié)時(shí)，常表現(xiàn)為壞死及囊性變，當(dāng)轉(zhuǎn)移灶呈大巢團(tuán)、界限清楚、似有基底膜樣物質(zhì)及癌巢周邊腫瘤細(xì)胞呈柵欄狀，且臨床及影像學(xué)檢查沒有找到原發(fā)灶時(shí)，容易誤診為鰓裂囊腫惡變，檢測(cè)HPV并仔細(xì)尋找被膜和淋巴竇等淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)有助于兩者的鑒別。在活檢標(biāo)本中，當(dāng)癌細(xì)胞核深染、細(xì)胞質(zhì)特別少、核分裂象多時(shí)，形態(tài)學(xué)上可以類似于小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，但后者核染色質(zhì)常呈點(diǎn)彩狀，突觸素和嗜鉻素等神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記陽性，角蛋白也常表現(xiàn)為核旁點(diǎn)狀陽性。對(duì)所有原發(fā)灶不明，以頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌為首發(fā)癥狀的患者，檢測(cè)P16蛋白或HPV有利于準(zhǔn)確的病理學(xué)診斷及腫瘤原發(fā)灶的判斷，對(duì)于患者預(yù)后判斷也具有重要價(jià)值。

雖然OPSCC-HPV患者常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且組織學(xué)形態(tài)常是非角化性鱗狀細(xì)胞癌，但對(duì)治療敏感，預(yù)后較好［6，11，22］。有研究［11，22］表明，HPV是口咽癌獨(dú)立的預(yù)后因素。由于其獨(dú)特的生物學(xué)行為，第7版AJCC頭頸部腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)不足以準(zhǔn)確反映該疾病的自然史，第8版AJCC分期系統(tǒng)新增加了OPSCC-HPV分期，將其與非OPSCC-HPV區(qū)別開來，能夠更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)OPSCC-HPV患者的預(yù)后。在本組患者中，與第7版AJCC分期相比，第8版臨床總分期明顯降級(jí)，Ⅰ～Ⅱ期患者占比增加85.4%，但需通過擴(kuò)大樣本量和延長隨訪時(shí)間來準(zhǔn)確評(píng)估預(yù)后相關(guān)危險(xiǎn)因素。有部分臨床試驗(yàn)關(guān)注于在保證最大化治療效果的同時(shí)，降低治療強(qiáng)度，避免過度治療造成的不良反應(yīng)。然而，仍有部分OPSCC-HPV患者對(duì)治療不敏感，預(yù)后差，其分子機(jī)制及遺傳學(xué)改變有待進(jìn)一步研究。目前，在美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南和中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)頭頸部腫瘤指南［23-24］中，降低治療策略并沒有得到一致認(rèn)可，仍然按照傳統(tǒng)方案進(jìn)行治療。

綜上所述，OPSCC-HPV具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)特征。男性患者多見，與口交性行為有關(guān)，臨床上多以頸部包塊漸進(jìn)性增大為首發(fā)癥狀就診。最常見的組織學(xué)類型是非角化性鱗狀細(xì)胞癌，Ki-67增殖指數(shù)較高。頸部轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)常伴壞死及囊性變，易誤診為鰓裂囊腫惡變或鼻咽癌轉(zhuǎn)移。P16免疫組織化學(xué)染色可以作為評(píng)估HPV感染狀態(tài)的替代標(biāo)志物，其中HPV-16是最常見的亞型。在日常病理學(xué)診斷中，所有原發(fā)性O(shè)PSCC及原發(fā)部位不明的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌（尤其是非角化性鱗狀細(xì)胞癌）均應(yīng)行P16或HPV檢測(cè)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。