阿托伐他汀對肝纖維化的改善作用及其機制

汪 楠，陸 曄，郝風節(jié)，王俊青

上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025

他汀類藥物是肝臟合成膽固醇的限速酶——羥基甲基戊二酰輔酶A （3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑，不僅能有效抑制膽固醇和低密度脂蛋白合成，還能輕度降低三酰甘油和升高高密度脂蛋白含量，是臨床上廣泛使用的調脂藥物［1］。肝纖維化是臨床常見的進展期肝病，常由多種基礎肝病如病毒性肝炎、脂肪性肝病、酒精性肝病、膽汁淤積性肝炎等慢性疾病發(fā)展而來。每年全球有超過100 萬人死于重度肝纖維化，其中約11%的患者來自中國［2］。在臨床工作中，他汀類藥物常用于脂肪肝的治療。然而，近年來多項研究揭示他汀類藥物在肝臟中具有緩解肝內脂肪堆積之外的保護作用［3］。Schierwagen 等［4］證實，他汀類藥物可通過抑制GTP 蛋白酶RhoA 及Ras 蛋白異戊二烯化緩解非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）導致的肝內炎癥。此外，他汀類藥物在多種動物模型中具有緩解纖維化形成、保護肝臟功能的作用。既往研究［5］表明，在嚴重NASH 導致的肝纖維化中，他汀類可抑制肝細胞對星狀細胞的旁分泌，以及星狀細胞的激活。在膽源性肝纖維化中，他汀類藥物可激活孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）及過氧化物酶體增殖物激活受體α （perixisome proliferation-activated receptor α，PPARα）通路，降低肝內膽汁酸濃度［6］。在本研究中，首先通過meta 分析探討他汀類藥物在多種慢性肝病中是否可緩解肝纖維化進展及門脈高壓癥；再通過腹腔注射四氯化碳（CCl4）構建小鼠肝纖維化模型，進一步明確他汀類藥物在肝纖維化這一嚴重肝臟病變中的作用和機制。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

檢索PubMed 上相關文獻，起止時間為2010 年1 月—2020 年6 月。 檢索策略為（statin OR statins OR simvastatin OR pravastatin OR lovastatin OR atorvastatin OR fluindostatin OR rosuvastatin） AND （liver diseases OR hepatitis B OR hepatitis C OR alcoholic liver disease OR fatty liver OR liver cancer OR hepatocellular carcinoma OR HCC）。

1.2 文獻的納入和排除

文獻納入標準：英文語言；存在使用他汀類藥物與不使用他汀類藥物的組間比較；患者存在明確基礎肝病；患者具有明確肝功能失代償及肝纖維化；其他并發(fā)癥如靜脈曲張、腹水、肝性腦病等有明確定義；隊列中患者年齡均>18 周歲。文獻排除標準：基礎研究；病例分析；綜述；實驗設計存在明顯缺陷；臨床數(shù)據(jù)缺失。

所有文獻的納入和排除分別由2 位研究者獨立完成。當兩人意見不一時，則由第三位研究者協(xié)調直至達成一致意見。

1.3 實驗材料

1.3.1 實驗動物 健康的雄性SPF 級C57BL/6 小鼠共16只，周齡8 周，體質量為20～25 g，由上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供。實驗動物生產許可證號為SCXK（滬） 2018-0007，使用許可證號為SYXK（滬） 2018-0027。動物飼養(yǎng)于12 h 循環(huán)光照/黑暗、恒溫、恒濕的環(huán)境下，提供標準飼料及飲水。本研究中動物實驗經上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院動物倫理委員會批準［2020動倫審第（102）號］。

1.3.2 主要試劑與儀器 阿托伐他汀（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，中國），CCl4、TRIzol 試劑（Sigma-Aldrich，美國），反轉錄酶、dNTPs、高保真DNA聚合酶（Invitrogen，美國），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，中國），DEPC 水、甘油醛-3-磷酸脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海翊圣生物科技有限公司，中國），反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，中國），蛋白裂解液（ThermoFisher，美國），collagen Ⅰ抗體、Smad4 抗體（Abcam，英國），辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，美國），ECL 發(fā)光試劑盒（ThermoFisher，美國）。

主要實驗儀器包括高速離心機（Eppendorf，德國）、紫外分光光度計（ThermoFisher，美國）、實時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）、Odyssey 紅外熒光掃描儀（LICOR，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠肝纖維化模型的建立及分組 將16 只小鼠隨機分為對照組、阿托伐他汀組、 CCl4注射組、CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組，每組4只。CCl4注射組小鼠以20%體積分數(shù)的CCl4按1 mL/kg 的劑量，每周行2 次腹腔注射；對照組使用同劑量玉米油進行腹腔注射；阿托伐他汀組小鼠每日以15 mg/kg劑量的阿托伐他汀灌胃1次；CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組聯(lián)合采用上述CCl4和阿托伐他汀的處理方式。

動物每周固定時間稱重。飼養(yǎng)4周后對所有小鼠進行安樂死處理，記錄體質量后開腹游離腹腔大血管和肝臟。從下腔靜脈抽取血液約1.5 mL，12 000×g離心5 min，獲得的血清于-80 ℃冰凍保存。離斷相關韌帶及血管，完整取出小鼠肝臟。將肝臟按肝葉解剖切成小片，分別置于4%多聚甲醛（制備石蠟切片）及凍存管（-80 ℃超低溫冰箱）中，以備后續(xù)使用。檢測小鼠血清谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）濃度。

1.4.2 天狼星紅染色觀察肝組織纖維化 將小鼠肝臟制備石蠟切片，厚度為4 μm，二甲苯脫蠟至水洗；將切片置0.1%天狼星紅染液中1 h 后，蒸餾水洗滌2 次（每次4 min）；將Harris's 蘇木素染料滴于切片上，于37 ℃孵育20 min，蒸餾水洗滌2 次（每次4 min）；使用95%、70%的乙醇脫水，二甲苯通透5 min 后，中性樹膠封片；使用顯微鏡觀察、拍照。

1.4.3 免疫熒光染色觀察collagenⅠA 的表達 取小鼠肝臟切片，磷酸鹽緩沖液洗滌10 min，重復2 次；5%胎牛血清室溫封閉1 h 后，使用0.2%Triton X-100 通透10 min；隨后加入抗collagen ⅠA 的一抗，4 ℃孵育過夜；次日，磷酸鹽緩沖液清洗，重復2次；熒光二抗室溫孵育1 h，使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫染細胞核10 min；于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.4 實時定量PCR TRIzol 法提取小鼠肝組織RNA；將小塊肝組織在1 mL 的TRIzol 中勻漿，隨后加入0.2 mL氯仿使蛋白與RNA分離；待分層后吸取含RNA的水相部分，與0.5 mL 異丙醇充分混勻使RNA 沉淀；以75%乙醇洗滌3 次后干燥，得到肝組織RNA，并利用紫外分光光度計進行濃度和純度測定。

以所獲樣本的RNA 添加反轉錄酶進行反轉錄PCR，得到cDNA。利用Syber Green 試劑盒及目標基因序列引物進行實時定量PCR，檢測肝組織α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ，以及白介素（interleukin，IL）-1b、IL-6、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達。

1.4.5 免疫印跡法檢測肝組織α-SMA 蛋白和磷酸化Smad4 的表達 將小塊肝臟組織在預先配制好的含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液中碾磨，直至云霧狀后于冰上放置30 min；隨后，11 000×g高速離心并吸取上清；最后，采用BCA 法測定小鼠肝臟組織的蛋白濃度。蛋白質加熱變性后進行SDS-PAGE 電泳，隨后以濕轉法將蛋白由凝膠上轉印至PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉1 h后加入稀釋后的抗α-SMA 抗體（1∶1 000）、抗pSmad4 抗體（1∶1000）或抗GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃振蕩孵育過夜；TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再次用TBST 洗膜；最后以ECL 法將膜上蛋白顯色，經顯影處理后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對膠片進行拍照。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用逆方差加權評估入組研究的異質性，若I2>50%則認為不同研究間存在異質性。采用Stata software 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。相對危險度（RR）和各研究的權重均在結果中顯示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)比較應用Studentt檢驗及χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 文獻篩選及數(shù)據(jù)提取

通過初步檢索，篩選了2 705 篇英文文獻。經過閱讀題目及摘要初篩后，排除不達標的2 469 篇文獻，剩余236篇文獻。精讀文獻全文后，根據(jù)設定的納入和排除標準，排除了48篇文獻，剩余188篇文獻。經過2名研究者反復評估，最終選取9篇文獻［7-15］，見圖1、表1。

表1 納入文獻的相關數(shù)據(jù)Tab 1 Associated data of the selected literatures

圖1 文獻篩選流程Fig 1 Flow chart of literature inclusion

2.2 文獻統(tǒng)計結果分析

2.2.1 肝纖維化進展風險 納入4 篇文獻［9-10，12，14］，共106 947例患者，其中試驗組38 770例，對照組68 177例。分析結果顯示RR=0.32，95%CI為0.31～0.33（圖2）。與對照組比較，他汀類藥物組能顯著降低肝纖維化發(fā)生率；但異質性檢驗結果顯示I2=0.989，P<0.01，表明納入的文獻具有較強異質性。

圖2 他汀類藥物對于肝纖維化發(fā)生風險的影響Fig 2 Effect of statins on the risk of hepatic fibrosis

2.2.2 肝功能失代償風險 納入4 篇文獻［7，12-13，15］，共17 374 例患者，其中試驗組7 973 例，對照組9 401 例。分析結果顯示RR=0.53，95%CI為0.46～0.62（圖3）。異質性檢驗結果顯示I2=0.357，P=0.169，表明納入的文獻同質性較好。與對照組比較，他汀類藥物能顯著減緩肝硬化患者肝功能失代償?shù)倪M展。

圖3 他汀類藥物對于肝功能失代償風險的影響Fig 3 Effect of statins on the risk of liver decompensation

2.2.3 總體死亡率 納入5篇文獻［7-8，11，13，15］，共59 329例患者，其中試驗組3 600 例，對照組55 729 例。分析結果顯示RR=0.55，95%CI為0.48～0.63（圖4）。異質性檢驗結果顯示I2=0.156，P=0.311，表明納入的文獻同質性較好。與對照組比較，他汀類藥物組患者總體死亡率顯著降低。

圖4 他汀類藥物對于總體死亡風險的影響Fig 4 Effect of statins on the overall risk of death

2.3 阿托伐他汀對小鼠體質量及肝臟損傷的影響

4周處理后，與對照組比較，CCl4注射組和CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠體質量均顯著下降（均P=0.000）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠體質量與CCl4注射組比較，下降程度較輕，組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.040），見圖5A。與對照組比較，CCl4注射組和CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠GPT、GOT 濃度均顯著上升（均P=0.000）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠與CCl4注射組比較，GPT、GOT 上升程度均較小，組間差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.020），見圖5B、C。

圖5 阿托伐他汀對CCl4注射導致的小鼠肝臟損傷及體質量的影響Fig 5 Effect of atorvastatin on liver injury and weight of mice caused by CCl4 injection

2.4 阿托伐他汀對小鼠肝纖維化的影響

天狼星紅染色結果顯示，CCl4 注射組肝內纖維過度沉積，以小葉中央區(qū)為主（圖6A）；而CCl4 注射聯(lián)合阿托伐他汀組小鼠中肝臟纖維化情況有所緩解。免疫熒光染色結果同樣顯示，collagen ⅠA 在CCl4 注射組高表達（圖6B）。

進一步通過實時熒光定量PCR、免疫印跡法檢測纖維化相關標志物α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達情況，結果顯示：與對照組比較，CCl4注射組中α-SMA蛋白表達升高，α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的mRNA 表達升高（均P<0.05）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組比較，上述指標均有所下調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見圖6C～F。

圖6 阿托伐他汀對CCl4注射導致的小鼠肝纖維化的緩解作用Fig 6 Mitogenic effect of atorvastatin on hepatic fibrosis in the mice after CCl4 injection

2.5 阿托伐他汀對肝內炎癥因子表達及TGF-β 通路的影響

實時熒光定量PCR 檢測結果顯示：與對照組相比，CCl4注射組中IL-1b、IL-6的mRNA 表達輕微上升，TGFβ的mRNA 表達顯著升高（均P<0.05）；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組比較，IL-1b、IL-6的mRNA表達顯著升高，TGF-β的mRNA 表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見圖7A～C。免疫印跡法檢測結果顯示：與對照組相比，CCl4注射組pSmad4 蛋白表達升高；而CCl4注射聯(lián)合阿托伐他汀組與CCl4注射組相比，pSmad4蛋白表達較低（圖7D）。

圖7 阿托伐他汀對肝內炎癥因子表達及TGF-β通路的影響Fig 7 Effect of atorvastatin on expressions of intrahepatic inflammatory factors and TGF-β pathway

3 討論

肝纖維化是肝細胞被反復破壞后再生，膠原、糖蛋白、蛋白多糖等細胞外基質在肝內過度沉積并異常分布形成的病理變化。在肝病慢性病程中，肝纖維化往往由早期病變如脂肪肝、肝炎發(fā)展而來。全球范圍內，肝纖維化發(fā)生率居全球致死疾病第11 位［16］。重度肝纖維化患者因肝功能嚴重受損、生活質量低下，生存率很低。目前，藥物治療雖然可延緩疾病發(fā)展進程，但是對于已形成肝纖維化的肝組織缺乏保護作用；而作為現(xiàn)階段根治性手術方案的肝移植等，也只能滿足少量患者的治療需求。

他汀類藥物的主要作用是減少膽固醇和低密度脂蛋白合成，目前已作為一線治療及預防用藥在心血管疾病中得到大量應用。該類藥物在調整血脂的同時，可有效改善局部脂肪肝癥狀。此外，既往研究［17-18］已經揭示，他汀類具有包括抗炎、抗增殖、抗氧化、抗纖維化在內的多重藥理作用。在本研究的meta 分析中，通過對9 篇入選文獻的研究，同樣發(fā)現(xiàn)他汀類藥物對不同病因導致的肝纖維化均具有保護作用?；趍eta 分析的結果，本研究構建了肝纖維化小鼠模型并予以阿托伐他汀治療。通過組織染色、實時熒光定量PCR、免疫印跡法等方法，檢測肝纖維化標志物α-SMA 及膠原蛋白的分布和表達，驗證了他汀類藥物對肝纖維化的保護作用。

肝纖維化是肝內多種細胞、生物因子和信號通路長期協(xié)同作用形成的復雜的病理性改變。目前認為，多種病因導致的肝內炎癥激活肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的經典機制，其中TGF-β 通路的激活是其中的重要環(huán)節(jié)［19］。本研究通過實時熒光定量PCR、免疫印跡法等方法，檢測IL-1b、IL-6、TGF-β的mRNA 表達以及pSmad4 蛋白的表達量，提示他汀類藥物可能通過調控TGF-β 通路，延緩肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展。有研究者已嘗試利用他汀類藥物的作用機制，使肝臟疾病患者在臨床治療中獲益。Huang等［12］及Simon 等［9］分別證實，使用他汀類藥物可顯著降低乙型和丙型病毒性肝炎患者的肝硬化發(fā)病率，且藥物用量與肝硬化風險之間存在劑量-效應關系；其他不良事件如肝功能失代償、腹水、死亡的發(fā)生率均在使用他汀類藥物后下降。Trebicka 等［20］在動物模型中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過抑制RhoA/Rho 激酶信號，激活一氧化氮合酶，促進一氧化氮的釋放，并最終舒張肝內血管，降低肝硬化導致的門脈高壓。Pollo-Flores 等［21］在臨床研究中證實，使用辛伐他汀后門脈高壓患者肝靜脈壓力梯度平均降低20%以上。肝細胞癌是最常見的終末期肝病。Zhou 等［22］在一項meta 分析中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀及氟伐他汀可顯著降低肝癌發(fā)生風險。Wu 等［23］則發(fā)現(xiàn)，使用他汀類聯(lián)合非手術治療，可提高晚期肝癌患者的總體存活率。

綜上所述，他汀類這一臨床常用藥物具有諸多獨立于調節(jié)脂肪代謝的藥理機制，在肝臟疾病的臨床治療中具有廣闊的應用前景；但需要進一步明確藥物在不同肝臟疾病中的具體作用機制，并在大規(guī)模前瞻性臨床研究中加以證實，為包括肝硬化在內的多種肝臟疾病的治療提供思路。