ETV5基因敲除對小鼠肌肉基因表達譜的影響

萬偉粲，張仙玉，趙 鑫，李 彬，蔡更元，楊化強，徐 錚

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，并且轉(zhuǎn)錄因子的突變和許多疾病的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系[1]。E26轉(zhuǎn)錄因子(E26 transcription-specific，ETS)家族是轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它們在細胞的增殖、分化、遷移以及細胞的互作過程中起著重要的作用，而根據(jù)序列的相似性，又將ETS家族分成幾個亞家族，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了將近20多個亞家族，其中包括ETS、ELG、TEL、PEA3等[2]。PEA3亞家族由3個成員組成：ETV1、ETV4和ETV5[3]。ETV5也稱ETS相關(guān)分子(ETS related molecule，ERM)，在成年哺乳動物的組織中有著廣泛的表達，尤其在睪丸[4]和卵巢[5]中表達量較高。

精原干細胞是雄性動物產(chǎn)生精子的基礎(chǔ)，精原干細胞的研究對解決雄性不育癥以及畜禽育種有著重要的推動作用，精原干細胞移植是近年來比較難以攻克的研究問題，其中如何制備內(nèi)源性精原細胞消融的受體就是一個棘手的問題，傳統(tǒng)方法常將白消安注射到雄性受體的睪丸中使其內(nèi)源性的精原細胞消融[6]，但是此方法對動物的傷害很大，并且雄性受體睪丸的精原細胞也無法做到完全消融，不可避免地會有一定程度的恢復(fù)，對后續(xù)試驗的影響很大。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者常利用基因修飾的手段敲除或失活某種在雄性哺乳動物睪丸精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的基因，進而獲得雄性睪丸內(nèi)源性精原細胞消融理想的移植受體。Chen等[7]利用Cre-LoxP技術(shù)靶向敲除了小鼠的ETV5基因，制備了ETV5純合敲除（ETV5-/-）小鼠，并發(fā)現(xiàn)敲除小鼠內(nèi)源性精原細胞發(fā)生了消融且呈現(xiàn)出“唯支持細胞綜合征”的表型，成功地制備了內(nèi)源性精原細胞消融的移植受體。同時研究發(fā)現(xiàn)，ETV5-/-雄性小鼠對雌性小鼠失去了性欲，精子也沒有受精能力，無論是自然交配、人工授精還是體外受精都不能使野生型(WT)的雌性小鼠受孕。而且，有報道稱ETV5-/-雌性小鼠也是不孕的[8]，這是因為它們的卵巢出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上的缺陷，完全無法排卵，和野生型公鼠交配后不能形成陰道栓。ETV5敲除小鼠的成功制備實現(xiàn)了內(nèi)源性精原細胞完全消融的雄性受體，為精原干細胞的研究提供了重要的材料。

然而，ETV5敲除小鼠不僅生殖系統(tǒng)的發(fā)育受到阻礙，在其他身體發(fā)育機能上也有缺陷。Schlesser等[9]靶向干擾小鼠的ETV5基因，和野生型相比ETV5純合突變小鼠的體質(zhì)量減少12%～31%。Jamsai等[10]利用ENU誘變將小鼠的ETV5基因產(chǎn)生錯義突變，純合ETV5突變的小鼠除了出現(xiàn)“唯支持細胞綜合征”外，還產(chǎn)生了腎臟不對稱、多趾以及發(fā)育不良等癥狀。Zhang等[11]為研究精原干細胞的移植，利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了ETV5敲除小鼠，試驗結(jié)果和Schlesser等[9]以及Jamsai等[10]的研究結(jié)果相似，敲除ETV5基因的小鼠除了出現(xiàn)內(nèi)源性精原細胞的消融，也出現(xiàn)了生長發(fā)育緩慢以及多趾的現(xiàn)象。

為了探究ETV5敲除小鼠生長發(fā)育緩慢的分子機制，我們通過對ETV5純合敲除公鼠和野生型公鼠的肌肉組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了2組小鼠肌肉組織的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，并且通過生物信息學(xué)分析篩選了ETV5-/-公鼠和野生型公鼠肌肉組織的差異表達基因，以及敲除ETV5影響了小鼠其他哪些功能基因及信號通路。

1 材料與方法

1.1 ETV5敲除小鼠的制備及基因型的檢測

ETV5敲除小鼠的制備是通過CRISPR/Cas9技術(shù)對C57BL/6小鼠的ETV5基因(GenBank accession number:NM_023794.2；Ensembl:ENSMUSG000000 13089) 進行靶向敲除得到的(由蘇州賽業(yè)生物科技有限公司完成)。設(shè)計了ETV5敲除小鼠的sgRNA，包括 sgRNA1（GAACGGCCATTGTCGGTGGCAGG）和 sgRNA2（CTTCTATGCTAATAACGGGTGGG）共獲得49只F0代小鼠，1周齡時剪小鼠腳趾抽提DNA，通過PCR檢測篩選出3只F0代ETV5基因雜合敲除小鼠(2公1母)。將雜合子公鼠和母鼠進行合籠繁殖，留下它們的公鼠后代，采集這些公鼠的尾巴，抽提組織DNA，并進行基因型的PCR鑒定，鑒定小鼠基因型的PCR引物包括上游引物（Primer-F:5′-CAACTGGTGCCCTTCCCAGTCT-3′）、中間引物（Primer-M:5′-TTAGACATTAGGCAGAGCCAGTGATG-3′）、下游引物（Primer-R:5′-GCCGCTCTTAAACCTGTTCATTCG-3′）。

1.2 小鼠的體質(zhì)量測量

留下基因型檢測結(jié)果為野生型(WT)的公鼠(C57BL/6小鼠)和純合敲除(ETV5-/-)的公鼠，待小鼠6周齡時，選擇WT公鼠和ETV5-/-公鼠各3只，依次放在電子秤上稱量6只小鼠的體質(zhì)量并記錄。

1.3 樣品收集和準(zhǔn)備

1.3.1 肌肉樣本的采集 稱量過體質(zhì)量的6只小鼠，分別進行頸椎脫臼法處死，將小鼠解剖采取小鼠后腿部位的肌肉，分別放入標(biāo)記好的凍存管中，立即置于液氮中。

1.3.2 RNA 提取與檢測 采用 Trizol法提取小鼠肌肉組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測分析樣品RNA的完整性，用Nanodrop 2000檢測RNA濃度和純度，用 Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測 RNA 完整性。

1.4 文庫的構(gòu)建及測序

轉(zhuǎn)錄組測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，將2組小鼠肌肉的總RNA分別構(gòu)建測序文庫。首先通過磁珠法Oligo(dT)對帶有PolyA尾的mRNA進行富集，隨后將其分割成短片段mRNA，用隨機引物進行擴增，逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA 鏈，隨后采用 RNaseH、DNA Polymerase I、dNTPs為原料降解RNA并且合成第2條cDNA鏈。使用AMPure XP beads 純化雙鏈產(chǎn)物，最后將DNA末端修復(fù)成平末端，加PolyA尾、接頭，最終獲得文庫。文庫質(zhì)量合格后進行Illumina測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 將測序片段的圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(Reads)，對原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除帶接頭的、無法確定堿基信息的、低質(zhì)量的Reads。同時，對Clean data進行Q20、Q30和GC含量計算，供后續(xù)分析。

1.5.2 RNA比對及基因表達水平的測定 獲得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后，直接從基因組網(wǎng)站下載參考基因組和基因模型注釋文件，使用HISAT2構(gòu)建參考基因組的索引，并將Clean data與參照基因組進行比對，HISAT2可以基于基因模型注釋文件生成拼接連接的數(shù)據(jù)庫。利用featureCounts軟件計算映射到每個基因的讀數(shù)，再根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM(FPKM指每百萬堿基對測序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預(yù)期數(shù)量)，并計算映射到該基因的讀數(shù)。

1.5.3 差異表達分析 使用 DESeq2 軟件進行 2 個組合之間差異表達分析[12](每個組3個生物學(xué)重復(fù))。差異表達基因 (Differentially expressed gene,DEG)是通過 DESeq2 選擇閾值為Padj＜0.05，|log2(差異倍數(shù))|≥0篩選出來的基因(Padj是Benjamini和Hochberg法矯正后的P值)。通過clusterProfiler軟件使用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO富集分析。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫找出差異表達基因顯著富集的信號通路[13]，用于分析分子水平的信息，使用clusterProfiler軟件分析KEGG 通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集。

1.5.4 實時熒光定量PCR驗證 從差異表達基因中挑選了一部分進行了實時熒光定量PCR(qPCR)驗證。反應(yīng)體系為 10 μL：5 μL 的 2×SYBR Green MasterMix，1 μL cDNA 模板，0.3 μL 上、下游引物和 3.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃10 s，共 40 個循環(huán)；72 ℃10 min。每個基因做3個重復(fù)，以β-actin作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的基因型鑒定

如圖1所示，如果小鼠是野生型小鼠，經(jīng)過PCR能根據(jù)引物Primer-M和Primer-R得到460 bp長度的片段，如果小鼠是ETV5純合敲除的小鼠，則擴增出Primer-F到Primer-R之間的1段710 bp的序列，同理，如果是雜合敲除的小鼠，則2種片段都有。因此，可以根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小判斷小鼠的基因型。

圖1 ETV5敲除小鼠基因型鑒定原理圖Fig.1 Identification principle of ETV5 knockout mouse genotype

選取部分后代小鼠中的公鼠，提取組織DNA后，用PCR法檢測基因型，結(jié)果如圖2所示，泳道2、3、4 只擴增到 1 個條帶 (460 bp)，說明所代表的這3只小鼠是野生型，泳道5、6、7只擴增到1個條帶(710 bp)，說明所代表的這3只小鼠是純合敲除，泳道 8、9、10擴增到 2個條帶 (710和 460 bp)，說明所代表的這3只小鼠是雜合敲除。

圖2 ETV5基因敲除小鼠基因型鑒定Fig.2 Genotype identification of ETV5 knockout mice

ETV5純合敲除小鼠的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果如圖3所示，將測序結(jié)果和NCBI上的小鼠ETV5基因序列進行比對，結(jié)果顯示，從 22 253 855～22 259 641缺失了5 607個堿基。

圖3 ETV5純合敲除小鼠測序結(jié)果和NCBI序列的比對Fig.3 Comparison of sequencing results of ETV5 homozygous knockout mice and NCBI sequence

2.2 2組小鼠的體質(zhì)量比較

在2組公鼠42日齡時，對它們的體質(zhì)量進行測量，得到結(jié)果如圖4所示，WT組的體質(zhì)量顯著高于ETV5-/-組的體質(zhì)量。

圖4 ETV5基因敲除與野生型小鼠在42日齡時的體質(zhì)量Fig.4 The body weight of the ETV5 knockout mice and wild type mice at 42 days of age

2.3 參考基因組比對結(jié)果

根據(jù)比對結(jié)果，分別統(tǒng)計Reads在基因組外顯子區(qū)域(Exon)、內(nèi)含子區(qū)域(Intron)以及基因間區(qū)(Intergenic)所占的比例。WT和ETV5-/-組的比對結(jié)果基本一致，大約95%的Reads比對到外顯子區(qū)域。

2.4 差異表達基因

我們篩選出了574個差異表達基因，其中上調(diào)基因292個，下調(diào)基因282個。對這574個差異表達基因進行染色體定位，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)差異表達基因在11號染色體最多，其次是5號染色體。圖6的熱圖顯示篩選出的差異表達基因的上、下調(diào)水平。部分差異表達基因見表1。

圖5 差異表達基因在各染色體上的分布Fig.5 Distribution of DEGs on each chromosome

圖6 小鼠肌肉組織中的差異表達基因聚類熱圖Fig.6 Clustering heat map of DEGs in mouse muscle tissue

表1 部分差異表達基因Table 1 Partial DEGs

2.5 GO富集分析

為了進一步解析篩選出來的差異表達基因的功能，我們進行了GO富集分析，結(jié)果如圖7所示。富集在生物學(xué)過程的最多，其中在生物過程中富集程度前5的都與脂肪代謝相關(guān)，包括：脂肪酸代謝、脂質(zhì)氧化、脂質(zhì)分解代謝、脂肪細胞分化、脂肪酸氧化。顯著富集的細胞組成相對較少，只有5個，分別是：線粒體內(nèi)膜、細胞器內(nèi)膜、脂滴、細胞外基質(zhì)、受體復(fù)合體。前5個顯著富集的分子功能分別是：輔酶結(jié)合、生長因子結(jié)合、硫化合物結(jié)合、脂肪-?；?輔酶A結(jié)合、胰島素樣生長因子結(jié)合。

圖7 ETV5基因敲除與野生型小鼠肌肉組織差異表達基因GO富集分析Fig.7 Enrichment analysis of DEGs between ETV5 knockout mice and wild type mice muscle

2.6 KEGG富集分析

我們還對差異表達基因進行了KEGG富集分析，圖8結(jié)果表明有20條KEGG通路得到顯著富集，其中差異表達基因主要富集到代謝通路中，例如：脂肪酸代謝、cAMP信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解和丙酮酸代謝等。

圖8 ETV5基因敲除與野生型小鼠肌肉組織差異表達基因的KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of DEGs between ETV5 knockout mice and wild type mice muscle

2.7 qPCR驗證分析

將分析得到的部分差異表達基因進行了qPCR驗證，結(jié)果顯示與測序結(jié)果一致(圖9)，敲除ETV5基因影響了部分其他基因的表達，其中腺苷甲硫氨酸脫羧酶 1(Adenosylmethionine decarboxylase 1，Amd1)[14]的cDNA編碼肌源性堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix，bHLH)因子的一個家族成員，此外，Amd1基因在成人體壁肌肉中有明顯表達，但在心臟和其他非肌肉組織中未見表達，肌源性bHLH因子參與了肌肉發(fā)育和形成。另外，膽堿能受體煙堿 α2(Cholinergic receptor nicotinic alpha 2，Chrna2)對脂肪的形成和代謝有重要作用，Jun等[15]敲除了小鼠的Chrna2基因，發(fā)現(xiàn)由于小鼠體內(nèi)脂肪細胞自主調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致了小鼠在寒冷環(huán)境中產(chǎn)熱和代謝功能的障礙，揭示了Chrna2通路在米色脂肪生物發(fā)生和能量穩(wěn)態(tài)中的生物學(xué)意義。除此之外，差異表達基因中還有Hpn[16]，Wisp2[17]，Cxcl14[18]，Mylk4[19]，Plin5[20]，Mchr1[21]等一些基因影響了ETV5敲除小鼠的肌肉發(fā)育、脂肪累積和體質(zhì)量變化。

圖9 qPCR檢驗差異表達基因在ETV5基因敲除和野生型小鼠肌肉組織的相對表達量Fig.9 Detecting the relative expression of DEGs in muscle tissue of ETV5 knockout and wild type mice by qPCR

3 討論與結(jié)論

Wang等[22]前期通過基因編輯技術(shù)制備了ETV5基因敲除的小鼠模型用來研究該基因與精原干細胞發(fā)育的關(guān)系，但是基因編輯帶來的影響并不是單一的，雖然敲除小鼠的ETV5基因的確得到了內(nèi)源性精原細胞消融的“唯支持細胞綜合征”表型，但是同時也影響了小鼠的整體發(fā)育和生長，而產(chǎn)生這些表型的分子機制很少有人報道。為此，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序得到了ETV5敲除小鼠和野生型小鼠的轉(zhuǎn)錄本，分析兩者之間存在的差異表達基因，通過生物信息學(xué)的方法分析得到了敲除ETV5基因可能對小鼠產(chǎn)生影響的分子機制。結(jié)果表明，敲除ETV5后的小鼠與野生型小鼠相比差異表達基因大部分為編碼蛋白的基因，差異表達基因中的部分基因?qū)游锏纳L發(fā)育、肌肉發(fā)育以及脂肪累積等有不同的影響，從而影響了ETV5敲除小鼠的肌肉發(fā)育和脂肪累積，出現(xiàn)體質(zhì)量下降以及發(fā)育不良的現(xiàn)象。

GO富集分析的結(jié)果顯示，富集前5的生物學(xué)過程都與脂肪代謝相關(guān)，分別是：脂肪酸代謝、脂質(zhì)氧化、脂質(zhì)分解代謝、脂肪細胞分化、脂肪酸氧化。這表明，敲除ETV5基因?qū)π∈蟮闹敬x影響很大，可能導(dǎo)致了小鼠儲存脂肪的障礙。KEGG富集分析的結(jié)果顯示，所有差異表達基因主要富集在脂肪酸代謝、cAMP信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路等方面。PPAR通路可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪形成、維持代謝的穩(wěn)態(tài)以及炎癥基因的表達。PPAR在不同的物種中找到了3種亞型，PPARα通過調(diào)節(jié)參與肝臟和骨骼肌脂質(zhì)代謝基因的表達以在細胞脂質(zhì)中發(fā)揮作用[23]，PPARβ/δ參與脂質(zhì)分解代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥、生存、增殖、分化以及哺乳動物皮膚、骨骼和肝臟的再生[24]，PPARγ可調(diào)節(jié)糖和脂代謝、內(nèi)皮功能和炎癥[25]。測序結(jié)果中的Plin5、Fabp3等部分差異表達基因在PPAR通路中起作用。GO和KEGG分析的結(jié)果表明，敲除ETV5基因可能會影響小鼠的脂肪代謝、能量代謝以及整體的發(fā)育。

本研究對ETV5敲除小鼠和野生型小鼠的肌肉組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，以探究敲除ETV5基因?qū)π∈蠹∪庑纬梢约吧L發(fā)育相關(guān)基因和信號通路的影響。結(jié)果表明，我們篩選出了574個差異表達基因，這些差異表達基因大多與脂肪代謝以及生長發(fā)育相關(guān)，其中發(fā)現(xiàn)Amd1可能影響了ETV5敲除小鼠的肌肉發(fā)育，Chrna2可能影響了ETV5敲除小鼠的脂肪代謝。GO和KEGG分析顯示差異表達基因主要富集在脂肪代謝、能量代謝的通路，這也能對應(yīng)我們觀察到ETV5敲除小鼠發(fā)育不良的表型。這些結(jié)果為敲除ETV5基因?qū)е滦∈蟀l(fā)育的緩慢和延遲提供了解釋，以及為研究ETV5基因的體內(nèi)多樣性功能提供了參考。