肺癌合并肺栓塞患者DNA甲基化基因的表達(dá)差異的分析研究①

唐 樂，李 宏，牛海文，曹國(guó)磊，馬榮輝，何麗麗，羅 琴

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011）

表觀遺傳學(xué)調(diào)控是指非DNA結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的基因表達(dá)水平及相應(yīng)功能的可逆性變化，其調(diào)控作用相對(duì)于遺傳學(xué)突變更加頻繁及普遍[1]。DNA甲基化是其主要的調(diào)控方式，參與機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育，作用類似基因活性的調(diào)節(jié)器。近年研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化分布異常參與了癌癥、血栓形成、慢性肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)生發(fā)展，基因轉(zhuǎn)錄上游調(diào)控序列的異常甲基化可導(dǎo)致抑癌基因沉默、癌基因高表達(dá)，促進(jìn)癌癥發(fā)生及轉(zhuǎn)移[2-4]。靜脈血栓栓塞癥（venous thromboem bolism,VTE)是由基因、環(huán)境等多種因素參與作用的復(fù)雜疾病[5]，這些因素協(xié)同造就了個(gè)體的“血栓形成潛力”[6]。研究表明較高水平的整體DNA甲基化與早期原發(fā)VTE相關(guān)，且瘤患者形成VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加4～7倍，20%惡性腫瘤患者會(huì)在其疾病病程中并發(fā)VTE，此類VTE稱之為惡性腫瘤相關(guān)血栓（cancer associated thrombosis,CAT)，在實(shí)體瘤中CAT以肺癌合并最為常見[7]。CAT主要是由癌癥相關(guān)因素驅(qū)動(dòng)的，如腫瘤類型、分級(jí)、分期、抗腫瘤治療等[8]，血液學(xué)機(jī)制涉及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生促凝因子、腫瘤局部壓迫淤滯、全身性炎癥狀態(tài)等[9]，而凝血途徑的激活亦是腫瘤擴(kuò)散和侵襲性疾病發(fā)展的機(jī)制之一[10]。CAT導(dǎo)致患者住院率、發(fā)病率、延遲癌癥治療率的增加，是腫瘤患者的第二大死亡原因[11]。目前只有少數(shù)CAT的基因表達(dá)譜變化研究[12-13]，甲基化調(diào)控是否參與CAT形成過(guò)程中的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究對(duì)肺血栓形成和未形成的肺腺癌患者外周血樣本進(jìn)行RNAseq測(cè)序及甲基化芯片檢測(cè)，聯(lián)合分析肺腺癌合并肺栓塞患者的甲基化表觀調(diào)控基因表達(dá)譜，擬尋找肺腺癌患者中可預(yù)測(cè)VTE發(fā)生的甲基化生物標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月-2019年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的肺腺癌合并肺栓塞患者4例，其中男3例，女1例，年齡31～62歲，平均年齡（48.5±12.9）歲，收集同時(shí)期肺腺癌患者4例，其中男2例，女2例，年齡在40～75歲，平均年齡（59.0±15.6）歲，兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：2019BC007），受試者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)肺腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為肺腺癌患者。肺栓塞診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照歐洲心臟病學(xué)會(huì)急性肺栓塞塞診療指南（2019版）。肺癌相關(guān)肺栓塞診斷標(biāo)準(zhǔn)：在肺腺癌診斷前3個(gè)月或診斷后24個(gè)月內(nèi)發(fā)生的肺栓塞。排除標(biāo)準(zhǔn)[15]：既往合并心腦血管疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、血液系統(tǒng)、肝腎功能異常等疾病史的患者。

1.3 方法室溫下用EDTA抗凝管收集每位患者外周全血2.5 mL，儲(chǔ)存于-80℃冰箱，采用TRIzol?Reagent（Invitrogen）提取總RNA，采用天根基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 RNA-seq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理采用樣本總RNA構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)并質(zhì)檢，使用Illumina測(cè)序儀測(cè)序,對(duì)測(cè)序原始圖像文件進(jìn)行堿基識(shí)別并轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced Reads），經(jīng)歸一化處理后計(jì)算基因百萬(wàn)外顯子的堿基片段(FPKM)值。采用Limma軟件包進(jìn)行有生物學(xué)重復(fù)或配對(duì)的差異比較，利用DESeq包進(jìn)行沒有生物學(xué)重復(fù)的差異比較。差異表達(dá)基因(differently expressed gene,DEG)篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FC|≥1且P≤0.05，(FC即差異表達(dá)倍數(shù))[16]。

1.4.2 甲基化芯片雜交及數(shù)據(jù)處理樣本基因組DNA行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、NaOH變性、恒溫過(guò)夜擴(kuò)增；用隨機(jī)內(nèi)切酶使DNA片斷化；沉淀及重懸DNA；與Illu-mina850K芯片雜交，DNA片段與兩種特異性探針互補(bǔ)序列（（A/T和C/G））結(jié)合；清洗芯片；掃描芯片讀取基因組甲基化水平結(jié)果。將芯片原始掃描數(shù)據(jù)idat文件直接導(dǎo)入R包ChAMP進(jìn)行分析、過(guò)濾和歸一化校正后得到高質(zhì)量的CpG位點(diǎn)甲基化水平（Beta值）。利用R包Limma進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)分析。顯著差異CpG位點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4.3 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)-甲基化數(shù)據(jù)聯(lián)合分析計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄上游區(qū)域（mRNA的TSS1500、TSS200、5’UTR和1stExon)的DNA甲基化△Beta值和基因表達(dá)log2FC的pearson相關(guān)性，顯著甲基化驅(qū)動(dòng)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：0.7＜|r|≤1且P＜0.05；利用KOBAS注釋系統(tǒng)將篩選出來(lái)的差異甲基化-差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺癌組的轉(zhuǎn)錄上游差異甲基化的表達(dá)差異根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)及DNA轉(zhuǎn)錄上游異常甲基化分布數(shù)據(jù)，研究者共篩選到CD177、RNASE1、GMPR、NTN4、HIST1H2BM、SMIM5、MARCH2、CMBL、LGALS3、NME4、KIR2DL1、RNASE1 ANKRD9、SPTB共14個(gè)相關(guān)甲基化驅(qū)動(dòng)基因。在肺癌合并肺栓組中，對(duì)應(yīng)基因的平均FPKM值為4.603、0.608,5.988、0.163、2.460、2.168、5.359、1.381、5.427、1.796、0.633、0.608、1.779、3.772；而相對(duì)于肺癌組，肺癌合并肺栓組的差異表達(dá)log2FC值分別為2.594、3.666、1.946、-2.748、1.859、1.512、1.352、2.327、2.027、1.076、2.438、3.666、2.106、2.198,見表1。

表1 肺腺癌合并肺栓塞組對(duì)比肺癌組的轉(zhuǎn)錄上游差異甲基化-差異表達(dá)基因（按r值排序）

2.2 肺腺癌形成肺栓塞過(guò)程中甲基化驅(qū)動(dòng)基因GO功能14個(gè)甲基化驅(qū)動(dòng)基因在生物過(guò)程中（藍(lán)色）涉及了唾液腺形態(tài)形成中的支線、自然殺傷細(xì)胞抑制的信號(hào)通路、免疫突觸的形成等；在細(xì)胞成分中（黃色），主要作為鳥苷酸還原酶復(fù)合體、血影蛋白相關(guān)的細(xì)胞構(gòu)架成分；在分子功能中（紅色），主要有層粘連蛋白結(jié)合功能、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合功能、鳥苷酸還原酶活性等功能，見圖1。

圖1 甲基化-差異表達(dá)基因富集GO功能條目圖（前30位）

2.3 肺腺癌形成肺栓塞過(guò)程中甲基化驅(qū)動(dòng)基因調(diào)控通路KEGG通路分析表明基因NME4和GMPR主要參與了嘌呤代謝通路的調(diào)控；KIR2DL1主要參與了移植物抗宿主病、抗原處理和提呈、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用通路的調(diào)控；NME4參與了嘧啶代謝通路的調(diào)控；HIST1H2BM參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)返恼{(diào)控；NTN4參與了軸突引導(dǎo)通路的調(diào)控；HIST1H2BM參與了酒精中毒、病毒致癌作用通路的調(diào)控；CMBL、NME4參與了代謝通路的調(diào)控，見圖2。

圖2 差異甲基化-差異表達(dá)基因富集KEGG通路條目（前10位）

3 討論

本研究在肺腺癌合并肺栓塞組患者對(duì)比肺腺癌組患者的外周血標(biāo)本中，篩選到14個(gè)甲基化調(diào)控差異基因，1個(gè)高甲基化負(fù)性調(diào)控低表達(dá)基因NTN4，13個(gè)低甲基化高差異表達(dá)基因，其中表達(dá)差異最明顯的基因?yàn)镽NASE1。對(duì)比肺腺癌組，在肺癌合并肺栓組中NTN4基因高甲基化，負(fù)性調(diào)控了NTN4的表達(dá)降低。NTN4即神經(jīng)突起導(dǎo)向因子Netrin-4，該基因編碼netrin蛋白家族的一個(gè)成員。既往研究中，NTN4在乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌等多種癌癥高表達(dá)，并與癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成相關(guān)[17-18]。另外，NTN4參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成、抗炎等作用[19-20]。內(nèi)皮功能障礙是血管病變背景下的一個(gè)主要問(wèn)題，例如動(dòng)脈粥樣硬化或血栓形成。目前雖無(wú)NTN4和血栓或者CAT明確相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)本研究結(jié)果提示NTN4或參與肺癌患者肺栓塞的形成。對(duì)比肺腺癌組，在肺癌合并肺栓組中RNASE1（內(nèi)皮細(xì)胞外核酸內(nèi)切酶核糖核酸酶1）基因的轉(zhuǎn)錄上游調(diào)控序列差異性低甲基化分布，顯著負(fù)性調(diào)控了RNASE1的表達(dá)增高。研究發(fā)現(xiàn)RNASE1在前列腺癌、乳腺腫瘤、胃癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)[21-23]。內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是預(yù)防血栓事件和加速血栓消退的潛在靶點(diǎn)[24]。近年來(lái)，RNase1在內(nèi)皮細(xì)胞選擇性大量表達(dá)，被認(rèn)為是保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的相關(guān)分子，參與調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)[25]。這與本研究結(jié)果一致，而RNASE1的大量表達(dá)在肺癌合并肺栓形成中承擔(dān)保護(hù)因素還是促進(jìn)因素，其具體分子機(jī)制尚待研究。

另外，通過(guò)KOBAS注釋系統(tǒng)進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這14個(gè)甲基化驅(qū)動(dòng)基因涉及自然殺傷細(xì)胞抑制、免疫突觸形成、層粘連蛋白結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合功能等分子功能，也可能與核苷酸代謝、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、移植物抗宿主病抗原處理和提呈、軸突引導(dǎo)等通路相關(guān)?；谝陨?，提示這些基因與炎癥及免疫系統(tǒng)相關(guān)。研究表明炎癥及免疫反應(yīng)是血栓形成前狀態(tài)，而腫瘤細(xì)胞具有血栓前特性和炎癥反應(yīng)特性，在CAT形成中起重要作用[26]。因此這些基因及通路或許是CAT的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究通過(guò)分析樣本基因組的高通量數(shù)據(jù)，初步探討了參與肺癌患者血栓形成過(guò)程中的甲基化驅(qū)動(dòng)基因和信號(hào)通路，后期將針對(duì)這些甲基化驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行更深入的研究。