肺腺癌患者血清中非編碼RNA差異表達(dá)的分析研究①

牛海文,崔浩波,李 宏，曹國磊,何麗麗,曹嘉芮,張 迪，羅 琴

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011）

肺癌是世界范圍內(nèi)造成死亡最多的惡性腫瘤之一，2020年僅美國新確診的肺癌患者為228 820例，其中85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]。肺腺癌是NSCLC最常見的亞型,患者總體存活率較低[2-3]，尋找有效診斷肺腺癌的生物標(biāo)志物尤為重要。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度超過200 nt的ncRNAs[4]，LncRNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已成為腫瘤診斷和治療的關(guān)鍵生物標(biāo)志物[5]。有研究表明,lncRNA MUC5B-AS1在肺腺癌組織中上調(diào)，通過與MUC5B形成RNA-RNA雙鏈體來促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[6]；lncRNA MYOSLID通過調(diào)控miR-339-5p促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,抑制細(xì)胞凋亡[7]；肺癌患者血漿lncRNA H19水平顯著高于肺良性病變患者及健康對照人群,與臨床病理學(xué)特征相關(guān),在肺癌診斷中具有一定價值,可輔助傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物用于肺癌診斷及病情評估[8]。本研究采用RNA測序技術(shù)對比分析肺腺癌患者和健康人群外周血中l(wèi)ncRNA表達(dá)差異,并對其靶向的mRNA行GO及KEGG分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月-2019年12月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸科的4例肺腺癌患者為實(shí)驗(yàn)組，其中男2例，女2例，平均年齡（55.16±2.25）歲，選擇同時期4例健康體檢者為對照組，其中男2例，女2例，平均年齡（54.32±3.12）歲。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批（批準(zhǔn)號：2019BC007），受試者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）就診者具備完整準(zhǔn)確的的個人信息及臨床資料；（2）NSCLC組經(jīng)病理確診且期別為III-IV期的患者；（3）健康對照組無任何基礎(chǔ)疾??；（4）符合知情同意原則。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）合并任何基礎(chǔ)疾病的患者；（2）確診NSCLC但已經(jīng)過化療、放療或靶向治療；（3）除NSCLC以外還合并有其他惡性腫瘤的患者。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集選用含RNA保護(hù)劑的保存管,分別采集肺腺癌和健康對照組外周靜脈血液到采血管，與血液RNA保存管連通，管中負(fù)壓將自動轉(zhuǎn)移2.5 mL血液至RNA保存管，上下顛倒混勻保存管15～30次，以保證血液與保存液充分混合。

1.3.2 患者外周血中總RNA的提取方法取“1.3.1”項(xiàng)下樣本2.5 mL加入5 mL離心管中，使用TRIZOL試劑盒(美國Invitgen公司)從肺腺癌及健康體檢者外周血中提取總RNA。隨后進(jìn)行甲醛變性膠電泳，選擇質(zhì)量合格的Total RNA作為RNA測序的建庫起始樣品，采用QUBIT RNA ASSAY KIT對起始的Total RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1.3.3 RNA文庫建立及測序QUBITRNABR測定試劑盒對起始的總RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量,采用Ribo-Zero?Magnetic Kit(Epicentre)對總RNA中rRNA進(jìn)行分離去除，RNA 6000Pico芯片對去除rRNA的總RNA進(jìn)行質(zhì)控，構(gòu)建好去除rRNA的質(zhì)控轉(zhuǎn)錄測序文庫后，用QUBIT DNA HS ASSAY KIT對PCR產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量然后進(jìn)行RNA測序。

1.4 指標(biāo)的測定

1.4.1 肺腺癌對比健康正常人差異表達(dá)的lncRNA測定用Fastp軟件對原始數(shù)據(jù)過濾及分析。利用limma包進(jìn)有生物學(xué)重復(fù)或配對的差異比較，利用DESeq包進(jìn)行沒有生物學(xué)重復(fù)的差異比較。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FC|≥1且P≤0.05，利用R語言對篩選出的差異表達(dá)基因做層次聚類分析，構(gòu)建差異lncRNA圖譜。利用火山圖展示差異表達(dá)的lncRNA，利用熱圖對差異分析中的兩組樣品可以有效的區(qū)分開，互為重復(fù)的樣品會更好的聚到一起。

1.4.2 對差異表達(dá)的lncRNA行GO及KEGG分析對上述篩選得到的差異lncRNA,對其進(jìn)行靶向的mRNA導(dǎo)入Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/gp/index.html)中進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析（分析參數(shù)：MinOverlap≥3，MinEnrichment≥1.5，P＜0.05），通過Fisher Exact Test計算P值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者外周血中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異譜與健康正常人對照組相比，在肺腺癌外周血中共篩選出804個差異lncRNA表達(dá)（P＜0.05），其中425個lncRNA上調(diào)，379個lncRNA下調(diào)。本研究按照差異倍數(shù)大?。ú町惐稊?shù)值）分別列出了排序前10的上調(diào)和下調(diào)lncRNA，見圖1A、B和表1。圖1A聚類分析圖：圖中橫坐標(biāo)代表不同的樣本名稱，縱坐標(biāo)代表差異的轉(zhuǎn)錄本，對肺腺癌組和對照組8個樣本進(jìn)行等級聚類分析，圖中的每個矩型代表一個基因表達(dá)值，紅色表示表達(dá)上調(diào)的基因，綠色表示表達(dá)下調(diào)的基因。差異表達(dá)的lncRNA由火山圖1B顯示，橫坐標(biāo)為表達(dá)量差異倍數(shù)的log2值,縱坐標(biāo)為差異表達(dá)分析中P值取負(fù)對數(shù)后的值,綠色切片和紅色切片顯示肺腺癌組織中異常的lncRNA表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)2倍以上(P＜0.05)，黑色的點(diǎn)代表無顯著差異的lncRNA。

圖1 肺腺癌組與正常對照組差異lncRNA表達(dá)的聚類分析與火山圖

表1 肺腺癌和正常對照組中差異倍數(shù)排名前10的上、下調(diào)lncRNA

2.2對于差異lncRNA靶向的mRNA行GO及KEGG分析與健康對照組相比，肺腺癌組主要涉及生物學(xué)途徑有核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解過程、SRP依賴性共翻譯蛋白靶向膜、翻譯起始等過程；細(xì)胞成分中與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分、非膜細(xì)胞器等有關(guān)；分子功能涉及到聚（A）RNA結(jié)合、氧化還原酶活性，作用于NADH等，見表2。與健康對照組相比，肺腺癌組涉及的KEGG通路結(jié)果顯示在肺腺癌對比正常組織中，排名前10的KEGG通路主要涉及到核糖體、氧化磷酸化、HIF-1信號通路、B細(xì)胞受體信號通路等，見表3。

表2 排名前5的GO分類富集表

表3 排名前10的KEGG Pathway分析表

3 討論

近年來，研究基因在疾病中的發(fā)生發(fā)展作用越來越受到各界人士的青睞，在肺腺癌發(fā)生過程中往往伴隨著許多相關(guān)基因的異常表達(dá)和基因改變。有研究表明，LINC02193在蛛網(wǎng)膜下腔出血患者外周血中表達(dá)上調(diào)，提示它們可能作為蛛網(wǎng)膜下腔出血的生物標(biāo)志物或抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血所致神經(jīng)損傷的治療靶點(diǎn)[9]，本研究發(fā)現(xiàn)，LINC02193在肺腺癌患者外周血中高表達(dá)，但未見相關(guān)報道，因此LINC02193是否也可以作為肺腺癌患者治療靶點(diǎn)需要進(jìn)一步考證。Wu等人證實(shí)[10]MIAT在NSCLC中顯著上調(diào)，特別是在侵襲性病例中，并且與不良預(yù)后密切相關(guān)。其通過吸附miR-184，進(jìn)而上調(diào)剪接因子1(SF1)的表達(dá)部分發(fā)揮了致癌作用，為MIAT在NSCLC進(jìn)展中的潛在治療應(yīng)用提供了新的視角。這與本研究結(jié)果相一致。SNHG17基因，名為小核仁RNA宿主基因17。近年來，SNHG17被認(rèn)為是結(jié)腸癌中一種新的致癌基因[11]，有研究表明SNHG 17通過靶向miR-485-5p來上調(diào)WLS的表達(dá)，從而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。然而姜翠紅等人報道SNHG17在肺癌中高表達(dá),促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖,并通過調(diào)節(jié)p57的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[13]，提示SNHG17在肺癌中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

唐玲玲等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與良性肺病患者相比NSCLC患者血漿TUG1表達(dá)下調(diào),TUG1與UCA1聯(lián)合診斷NSCLC優(yōu)于TUG1、UCAI、CEA、CYFRA21-1四指標(biāo)單獨(dú)診斷,有望成為診斷NSCLC的潛在生物標(biāo)志物，與本研究結(jié)果一致。lncRNA-TUG 1過表達(dá)可抑制順鉑(DDP)耐藥NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬，其水平的調(diào)節(jié)為提高非小細(xì)胞肺癌化療藥物的抗腫瘤療效提供了新的途徑[15]。因此TUG1在肺腺癌中低表達(dá)很值得研究。LINC 01503是一種超增強(qiáng)子驅(qū)動的長時間非編碼RNA，在多種類型的人類癌癥中被調(diào)控。它在NSCLC癌組織中表達(dá)量升高,miR-335-5p表達(dá)量下降,二者表達(dá)量呈負(fù)相關(guān),可能成為提示NSCLC預(yù)后新的腫瘤標(biāo)志物[16]。對 于 差 異lncRNA靶 向 的mRNA行GO及KEGG分析，GO分析表明，翻譯起始為主要作用。高通量分析已經(jīng)鑒定出數(shù)以千計的哺乳動物轉(zhuǎn)錄本具有翻譯起始，除了IRES介導(dǎo)外，還涉及交替的5‘帽識別、mRNA序列元件和核糖體選擇。這些機(jī)制確保了在帽依賴翻譯被關(guān)閉的情況下特定mRNA的翻譯，并促進(jìn)包括心臟肥厚和癌癥在內(nèi)的病理狀態(tài)[17]。

綜 上 所 述，LINC02193、SNHG17、TUG1、LINC01503可作為肺腺癌發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物，肺腺癌的發(fā)生與核糖體、代謝途徑等通路有關(guān),為肺腺癌的診治提供了新的思路。本研究樣本數(shù)量較少，存在一定的局限性，因襲后期課題組擬擴(kuò)大樣本量深入研究，并對篩選所得差異顯著lncRNA及其目的基因等進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證研究。

[收稿日期:2021-09-01]