基于FD-GC-O 和OAV 法分析不同處理的黃瓜汁關(guān)鍵活性成分差別

譚夢(mèng)男，潘少香，孟曉萌，劉雪梅，鄭曉冬，吳茂玉，宋 燁，曹 寧，閆新煥

（中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250014）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，具有美容、抗過(guò)敏之效，還有通經(jīng)、活血、解毒、利尿等生理作用[1-2]。我國(guó)黃瓜的總產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的81%，是全球最大的黃瓜生產(chǎn)國(guó)。黃瓜作為世界上十大熱量最低的蔬菜之一（16 Kcal/100 g），具有獨(dú)特的風(fēng)味，脆嫩的質(zhì)地，深受全球各國(guó)人民的喜愛。隨著消費(fèi)水平的提升，人們對(duì)產(chǎn)品多樣性及質(zhì)量要求不斷提高，促進(jìn)了黃瓜精深加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，黃瓜汁產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。鮮榨黃瓜汁以其清爽的口感、清新的香氣越來(lái)越受到人們歡迎，市場(chǎng)占有率越來(lái)越大。但黃瓜汁中的香氣成分多為熱敏性物質(zhì)，受溫度影響較大，在殺菌過(guò)程中，加熱處理會(huì)導(dǎo)致美拉德等反應(yīng)，使相關(guān)香氣物質(zhì)發(fā)生變化產(chǎn)生異味甚至不良風(fēng)味，因此目前黃瓜汁仍未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

氣相色譜-嗅聞技術(shù)（GC-O）是將人體感官分析與儀器檢測(cè)相結(jié)合，從復(fù)雜的混合物中篩選和評(píng)價(jià)氣味活性物質(zhì)貢獻(xiàn)大小的一種有效方法[3]。目前用于客觀性評(píng)價(jià)單一香氣組分的感官貢獻(xiàn)大小的GC-O 方法大體分為3 類：稀釋閾值法（dilute to threshold analysis，DTA）、直接強(qiáng)度法（direct intensity analysis，DIA）和頻率檢測(cè)法（frequency detection analysis，F(xiàn)DA）[4-5]。與其它兩種方法相比，F(xiàn)DA 方法可以用最少的時(shí)間確定化合物香味屬性，分析結(jié)果具有較好的重復(fù)性，是應(yīng)用較普遍的一種GC-O 分析方法。依據(jù)該方法得出，一種氣味物質(zhì)的檢測(cè)頻率（detection frequency，DF）越大，其香氣貢獻(xiàn)就越大。香氣活性值（OAV）是香氣化合物濃度與閾值的比值，能確切地評(píng)價(jià)單一香氣成分對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)作用，一般認(rèn)為OAV≥1 的物質(zhì)對(duì)整體香氣的呈現(xiàn)有貢獻(xiàn)作用[6-7]。將GC-O 技術(shù)與香氣強(qiáng)度法相結(jié)合，可以更快速地篩選出樣品特征香氣化合物，香氣強(qiáng)度越大，對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)越大[2]。

本文利用頻率檢測(cè)-氣相色譜-嗅聞技術(shù)（FD-GC-O）和香氣活性值法（OAV）對(duì)鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，鑒定黃瓜汁關(guān)鍵活性成分，為優(yōu)化黃瓜汁加工工藝、提升黃瓜汁品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲堤黃瓜，采摘于濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)區(qū)曲堤街道郭家村蔬菜大棚。

氯化鈉，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇，色譜純，德國(guó)Dr.Ehrensorfrt GmbH 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；破碎機(jī)，UM5，德國(guó)STEPHAN 公司；蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，TRACE 1300-ISQ，美國(guó)Thermos 公司；電子天平（精度0.01 g），PL2002，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；20 mL 頂空進(jìn)樣瓶，HM-2075G，浙江哈邁科技有限公司；50/30μm萃取頭，DVB/CAR/PDMS，美國(guó)supelco 公司；嗅聞儀，PALRSI，德國(guó)GERSTEL 公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 工藝流程

黃瓜→挑選→清洗→破碎打漿→壓榨→均質(zhì)→加熱（95 ℃）殺菌→冷卻→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

挑選無(wú)病蟲、無(wú)腐爛、新鮮的黃瓜，用流動(dòng)的清水洗凈，放入破碎機(jī)中破碎，經(jīng)紗布過(guò)濾，得到黃瓜汁；均質(zhì)，在95 ℃下殺菌30 s，冷卻后，置于4 ℃下貯藏備用。鮮榨黃瓜汁不經(jīng)過(guò)殺菌處理，以此作為對(duì)照。

1.4 樣品前處理

HS-SPME 處理：稱取5.00 g 黃瓜汁樣品于盛有1 g氯化鈉的20 mL 頂空瓶中，并加入32.88 μg/mL 的2-辛醇20 μL 作為內(nèi)標(biāo)。將頂空瓶加蓋密封后，放入三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器上，待測(cè)。

1.5 揮發(fā)性成分檢測(cè)方法

采用GC-O-MS 系統(tǒng)對(duì)黃瓜汁揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析。GC-O-MS 是由氣相色譜、質(zhì)譜和嗅聞裝置組成。樣品經(jīng)進(jìn)樣口解析后，經(jīng)GC 分離后分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器和嗅聞檢測(cè)器，分流比為1∶1。嗅聞人員在嗅聞口記錄所聞到的香味特征和保留時(shí)間。

1.5.1 自動(dòng)進(jìn)樣器條件

選擇SPME 進(jìn)樣模式，樣品孵化時(shí)間5 min，振搖速度 為 450 r/min，孵化溫度為40℃；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 纖維萃取頭（萃取前按照說(shuō)明進(jìn)行老化處理）的萃取深度為18 mm，萃取時(shí)間35 min，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)振搖；進(jìn)樣深度為35 mm，脫附時(shí)間300 s后，進(jìn)行GC-MS 分析。

1.5.2 GC-MS 分析條件

GC 條件：DB-5MS色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；采用程序升溫模式，起始溫度為40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min 升溫速率升至180 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min 升溫速率升至250 ℃，保持3 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；以氦氣（純度99.999%）為載氣，流速為1.666 mL/min，不分流進(jìn)樣。

MS 條件：電子轟擊離子源（EI），EI 電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃，GC/MS 傳輸線溫度250 ℃；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍50～600 mau。延遲2 min。

嗅聞條件：氣相毛細(xì)管柱末端以分流比為1∶1 分別連接質(zhì)譜和嗅聞儀。氣味輸出通過(guò)無(wú)涂層填充的色譜柱，色譜柱溫度設(shè)定為220 ℃，在嗅聞口處對(duì)氣體進(jìn)行加濕，防止因氣體干燥引起嗅聞人員不適。黃瓜汁中香氣組分的鑒定由10 名嗅聞人員來(lái)完成。所有嗅聞人員對(duì)GC-O 有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過(guò)知識(shí)培訓(xùn)、標(biāo)準(zhǔn)品嗅聞、樣品感官和GC-O 上機(jī)實(shí)驗(yàn)等培訓(xùn)等，嗅聞過(guò)程中要求嗅聞人員記錄香氣物質(zhì)出現(xiàn)的時(shí)間，并對(duì)其香氣屬性進(jìn)行準(zhǔn)確描述。以每種物質(zhì)被10 名聞香人員所嗅聞到的總次數(shù)作為它們的DF，來(lái)表征每種物質(zhì)的香氣貢獻(xiàn)大小。本實(shí)驗(yàn)中，將DF≥5 的物質(zhì)確定為關(guān)鍵香氣成分。

1.5.3 定性與定量

定性方法：通過(guò)正構(gòu)烷烴C5～C20進(jìn)行揮發(fā)性組分的線性保留指數(shù)（linear retention index，LRI），并與已發(fā)表文獻(xiàn)中的LRI 進(jìn)行匹配，然后利用GC/MS 工作站軟件Xcalibur 自帶NIST 標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分，僅對(duì)能予以定性的物質(zhì)（SI 和RSI 值大于800）進(jìn)行探討。

定量方法：使用內(nèi)標(biāo)法定量，2-辛醇（32.88 μg/mL）為內(nèi)標(biāo)，并根據(jù)加入內(nèi)標(biāo)的含量從而計(jì)算樣品中每一個(gè)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量，計(jì)算公式見式（1）。

式中，Ci為物質(zhì)i的含量，mg/kg；cs為內(nèi)標(biāo)物s 的濃度，μg/mL；V為加入內(nèi)標(biāo)物s 的體積，mL，Ai和AS分別為待測(cè)組分i和內(nèi)標(biāo)化合物s 的峰面積；m為稱取的黃瓜汁樣品質(zhì)量，g；Fi為待測(cè)組分i對(duì)內(nèi)標(biāo)s 的相對(duì)質(zhì)量校正因子；本實(shí)驗(yàn)中各待測(cè)組分i的相對(duì)校正因子均為1[8-9]。

1.5.4 關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)分析

在各種揮發(fā)性組分定量的基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[10]中各物質(zhì)在水中的香氣閾值，計(jì)算該物質(zhì)的OAV值。OAV為揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度與該物質(zhì)嗅覺閾值的比值，通常用OAV 表示呈香物質(zhì)在香氣中起作用的強(qiáng)度，當(dāng)OAV≥1 時(shí)，認(rèn)為該香氣物質(zhì)可能對(duì)食品香氣的貢獻(xiàn)和影響較大，OAV＜1，則表明該物質(zhì)對(duì)總體香氣無(wú)實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)，一般情況下，OAV 越大則說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)總體香氣的貢獻(xiàn)越大[11]。因此，本研究把OAV≥1 作為黃瓜汁特征香氣成分的判別標(biāo)準(zhǔn)[7]，其計(jì)算公式見式（2）。

式中，OAVi表示揮發(fā)性成分i的氣味活度值；Wi表示每個(gè)揮發(fā)性成分的含量，mg/kg；Qi表示揮發(fā)性成分i在水中的氣味閾值，mg/kg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定10 次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發(fā)性成分種類及含量

利用HS/SPME-GC-MS 方法測(cè)得鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，見表1，總離子流圖如圖1（見下頁(yè)）所示。共發(fā)現(xiàn)22 種化合物，其中醛類物質(zhì)10 種，醇類物質(zhì)7 種，酮類物質(zhì)1 種，酯類物質(zhì)1種，酸類物質(zhì)1 種，其他物質(zhì)2 種。結(jié)果表明，黃瓜汁主要香氣成分為能夠賦予黃瓜青鮮氣的不飽和C6、C9的醛、醇。定量結(jié)果表明鮮榨黃瓜汁中醇類物質(zhì)含量高達(dá)3.972 6 mg/kg，其中，反-2,順6-壬二烯醇含量最高，而加熱殺菌后的黃瓜汁中醇類物質(zhì)含量?jī)H為0.206 9 mg/kg；加熱殺菌后的黃瓜汁中醛類物質(zhì)含量高達(dá)3.460 2 mg/kg，其中反-2-,順-6-壬二烯醛含量最高，而鮮榨黃瓜汁中醛類物質(zhì)含量為0.192 9 mg/kg。鮮榨黃瓜汁中檢出的化合物含量超過(guò)0.1 mg/kg 的化合物有乙醇（0.12 mg/kg）、醋酸（0.23 mg/kg）、正己醛（0.11 mg/kg）、正壬醇（0.45 mg/kg）、順式-3-壬烯-1-醇（0.10 mg/kg）、(Z)-6-壬烯-1-醇（1.32 mg/kg）、反-2,順6-壬二烯醇（1.83 mg/kg）。加熱殺菌后的黃瓜汁中含量超過(guò)0.1 mg/kg 的化合物為壬醛（0.101 7 mg/kg）、(Z)-壬-2-烯醛（0.67 mg/kg）、反-2-,順-6-壬二烯醛（2.325 2 mg/kg）。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。尚明月等[12]報(bào)道黃瓜中含有較多的(E)-6-壬烯醛和壬醛，具有獨(dú)特的水果香甜風(fēng)味，其中‘南水8 號(hào)’反-2-,順-6-壬二烯醛含量最高，黃瓜風(fēng)味最為濃郁。王春芳等[13]發(fā)現(xiàn)采用反,順-2,6-壬二烯醛和己醛的含量測(cè)定進(jìn)行黃瓜汁的氣味評(píng)價(jià)是較為可靠的。

圖1 鮮榨黃瓜汁（a）和加熱殺菌后的黃瓜汁（b）總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram diagram of fresh cucumber juice(a) and heated sterilized cucumber juice(b)

表1 鮮榨黃瓜汁與加熱殺菌后黃瓜汁中揮發(fā)性組分的定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in fresh cucumber juice and heated sterilized cucumber juice

2.2 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發(fā)性成分FD-GC-O 與OAV 分析結(jié)果

表2 中列出了嗅聞人員采用GC-O 法從黃瓜汁中嗅聞到的活性化合物，共計(jì)15 種，以醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)居多。黃瓜汁整體嗅香主要表現(xiàn)為青草香的主香，并伴有果香及花香。所有嗅聞人員均嗅聞到的活性化合物（DF=10）為反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇且均被描述為“清香、黃瓜味”。除此之外，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后黃瓜汁中正己醛、2-己烯醛及反,反-2,4-庚二烯醛均被絕大多數(shù)嗅聞人員描述為“青草香”。在鮮榨黃瓜汁中有部分嗅聞人員嗅聞到的活性化合物有(+)-檸檬烯（清香味、檸檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）。加熱殺菌后黃瓜汁中嗅聞到的活性化合物數(shù)量明顯少于鮮榨黃瓜汁，且(+)-檸檬烯（清香味、檸檬味）、反式-2-已烯-1-醇（生青味）、甲酸庚酯（果香味）及醋酸（酸味）物質(zhì)未被嗅聞到。分析其原因是加熱殺菌使黃瓜汁中一些熱穩(wěn)定性較差的香氣物質(zhì)破壞，因而導(dǎo)致殺菌后黃瓜汁中香氣物質(zhì)種類及數(shù)量降低[14]。

表2 鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁揮發(fā)性成分FD-GC-O 與OAV 分析結(jié)果Table 2 Results of volatile components FD-GC-O and OAV of fresh cucumber juice and cucumber juice after heating sterilization

利用OVA 法從鮮榨黃瓜汁中鑒定出7 種關(guān)鍵活性化合物（OAV≥1），分別為正己醛、(+)-檸檬烯、順式-4-庚烯醛、醋酸、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇。其中反-2-,順-6-壬二烯醇OAV 值最高為1 827；從加熱殺菌后黃瓜汁中共鑒定出5 種關(guān)鍵活性化合物（OAV≥1），分別為正己醛、順式-4-庚烯醛、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇，其中反-2-,順-6-壬二烯醇加熱殺菌后OAV 值急劇降低至68，而反-2-,順-6-壬二烯醛OAV 值升高至232，說(shuō)明反-2-,順-6-壬二烯醇加熱殺菌后發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其含量急劇降低，推斷發(fā)生氧化反應(yīng)，部分反-2-,順-6-壬二烯醇脫氫生成反-2-,順-6-壬二烯醛。另外加熱殺菌導(dǎo)致醋酸及(+)-檸檬烯OAV＜1，說(shuō)明加熱殺菌在一定程度上造成香氣損失。一般情況下，DF 值與OAV 值呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，即DF 值越高，OAV 值越大，該物質(zhì)的活性越大[5]，對(duì)黃瓜汁的整體貢獻(xiàn)也越大，如反-2-,順-6-壬二烯醛及反-2-,順-6-壬二烯醇。但也有特殊情況，如鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁中2-己烯醛雖然OAV＜1，但因與其它物質(zhì)間存在協(xié)同效應(yīng)，在嗅聞過(guò)程中仍被識(shí)別到，因此對(duì)黃瓜汁香味貢獻(xiàn)大的物質(zhì)相對(duì)含量并不一定大，僅從相對(duì)含量來(lái)比較不同成分對(duì)香味的貢獻(xiàn)是不準(zhǔn)確的，需要結(jié)合閾值才能得出更真實(shí)的結(jié)果[15]。

3 結(jié)論

根據(jù)GC-MS 檢測(cè)結(jié)果，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁共發(fā)現(xiàn)22 種化合物，其中醛類10 種，醇類7種，酮類1 種，酯類1 種，酸類1 種，其他類別2 種，鮮榨黃瓜汁和加熱殺菌后的黃瓜汁主要香氣成分為能夠賦予黃瓜青鮮氣的不飽和C6、C9的醛、醇，其中鮮榨黃瓜汁中正己醛、(+)-檸檬烯、壬醛、醋酸、反-2-,順-6-壬二烯醛、反-2-,順-6-壬二烯醇具有較強(qiáng)的香氣活性（OAV≥1）易被大多數(shù)人識(shí)別（DF≥5）；加熱殺菌后的黃瓜汁中具有較強(qiáng)的香氣活性（OAV≥1）易被大多數(shù)人識(shí)別（DF≥5）的物質(zhì)為正己醛、壬醛、反-2-,順-6-壬二烯醛、反-2-,順-6-壬二烯醇。因此正己醛（青草味）、壬醛（花香）、反-2-,順-6-壬二烯醛（黃瓜味）、反-2-,順-6-壬二烯醇（清香、黃瓜味）是黃瓜汁的關(guān)鍵活性成分。