腸易激綜合征兩種亞型的腸黏膜免疫激活情況及其腸道微生態(tài)研究

魯艷妮，周清文

長(zhǎng)安醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710016

腸易激綜合征(IBS)是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，主要表現(xiàn)為腹痛、糞便性狀異常等。目前，在我國(guó)IBS疾病的發(fā)病率最高可達(dá)到10%[1]。IBS具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，對(duì)患者的日常生活及工作等均有影響，同時(shí)也增加患者經(jīng)濟(jì)壓力。有研究顯示IBS的發(fā)病機(jī)制可能與腸黏膜免疫激活及腸道微生態(tài)存在關(guān)系，主要表現(xiàn)為腸道菌群具有多樣性，且益生菌數(shù)量異常下降，致病菌的數(shù)量異常上升[2-3]。目前，臨床上主要將IBS分為2種亞型，即腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)和便秘型腸易激綜合征(IBS-C)[4]。但是目前關(guān)于以上兩種亞型的腸黏膜免疫激活情況及其腸道微生態(tài)的觀(guān)察研究較少。本研究為了進(jìn)一步分析IBS-D和IBS-C在腸黏膜免疫激活及腸道微生態(tài)方面的研究，選取IBS患者176例作為研究對(duì)象，旨在為臨床治療以上2種亞型IBS提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4月至2020年4月本院收治的IBS患者176例作為研究對(duì)象。根據(jù)IBS 2種亞型分為 IBS-D組86例、IBS-C組90例。IBS-D組男性42例、女性44例，年齡29～51歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為19.38～27.49 kg/m2，IBS-C組男性42例、女性48例，年齡29～51歲，平均(40.23±10.44)歲，BMI 為19.38～27.49 kg/m2，兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且所有患者均已簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均分別符合IBS 2種亞型的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)既往無(wú)其他免疫系統(tǒng)方面的疾??；(3)均同意參加本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肺等臟器功能障礙；(2)既往存在其他惡性腫瘤疾??；(3)既往伴有精神疾病史者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集 取所有研究對(duì)象早晨新鮮糞便標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存。所有納入的研究對(duì)象都在結(jié)腸鏡下結(jié)腸直乙交界處取活檢標(biāo)本2～3塊，立即放入到10%的中性福爾馬林固定液當(dāng)中，固定后之后制成石蠟切片。

1.2.2糞便性狀評(píng)分 采用Bristol大便分型量表進(jìn)行評(píng)分[6]。1型為1分、2型為2分，依次類(lèi)推。

1.2.3采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)糞便中腸道菌群數(shù)目 取上述標(biāo)本新鮮糞便，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察涂片染色標(biāo)本，選擇具有代表性的視野中的部分區(qū)域，一般要選擇100～200個(gè)細(xì)菌，計(jì)算各個(gè)細(xì)菌所占的比例。再按照連續(xù)稀釋法稱(chēng)取0.5 g糞便放入到勻漿瓶當(dāng)中，稀釋成不同的稀釋度，按照不同細(xì)菌正常菌落數(shù)量的范圍采用不同稀釋度完成培養(yǎng)。使用選擇性培養(yǎng)平板來(lái)培養(yǎng)乳桿菌、腸球菌、大腸桿菌、雙歧桿菌等。平板分別放置在37 ℃孵箱和厭氧菌培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)(需氧培養(yǎng)24 h，厭氧培養(yǎng)72 h)，之后按照平板上的活菌計(jì)數(shù)法完成計(jì)數(shù)，鑒定細(xì)菌。提取總DNA，再根據(jù)雙歧桿菌、大腸埃希菌等的序列設(shè)計(jì)引物序列，PCR擴(kuò)增，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各個(gè)菌株的DNA片段，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算基因拷貝數(shù)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)各組結(jié)腸組織標(biāo)本中Toll樣受體(TLR)4、TLR5 mRNA表達(dá) 提取結(jié)腸組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，再將逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物置于PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增操作，凝膠電泳，TLR4、TLR5 mRNA均采用β-actin校正。

1.2.5各組炎性因子檢測(cè) 取上述結(jié)腸組織標(biāo)本，剪碎，再予以適量的生理鹽水溶液及抑肽酶，將其置于玻璃勻漿中，離心，去除下層沉淀，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組炎性因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-10水平。

1.2.6肥大細(xì)胞檢測(cè) 取上述結(jié)腸組織標(biāo)本，采用胰酶溶液進(jìn)行消化，獲取肥大細(xì)胞，予以甲苯胺藍(lán)溶液進(jìn)行染色。肥大細(xì)胞的判定：取5個(gè)視野，在不重復(fù)的情況下進(jìn)行觀(guān)察，取平均數(shù)。

1.3觀(guān)察指標(biāo) 觀(guān)察各組糞便性狀評(píng)分、腸道菌群數(shù)目、肥大細(xì)胞數(shù)目、結(jié)腸組織中TLR4、TLR5 mRNA、炎性因子TNF-α、IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1各組患者糞便性狀評(píng)分比較 IBS-D組、IBS-C組患者糞便性狀評(píng)分分別為(5.76±0.65)分、(5.68±0.58)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組腸道菌群數(shù)目比較 IBS-D組、IBS-C組雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)目比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大腸埃希菌、腸球菌數(shù)目比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組腸道菌群數(shù)目比較

2.3各組結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞數(shù)目比較 甲苯胺藍(lán)溶液染色結(jié)果顯示，IBS-D組、IBS-C組患者均能夠明顯觀(guān)察到大量肥大細(xì)胞的表達(dá)，且主要呈現(xiàn)紫藍(lán)色，其中細(xì)胞核主要呈現(xiàn)藍(lán)色，大量存在于黏膜固有層中，且細(xì)胞的大小不一，未脫落細(xì)胞比較完整，且細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)，脫落細(xì)胞的細(xì)胞膜明顯破裂，并且細(xì)胞的形狀不一。見(jiàn)圖1。IBS-D組、IBS-C組肥大細(xì)胞的數(shù)目分別為(25.28±3.25)個(gè)/5 Hp、(25.17±2.89)個(gè)/5 Hp，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為IBS-D組；B為IBS-C組。

2.4各組TLR4、TLR5 mRNA及炎性因子TNF-α、IL-10水平比較 IBS-D組、IBS-C組TLR4 mRNA、TLR5 mRNA及炎性因子TNF-α、IL-10水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組TLR4、TLR5 mRNA及炎性因子TNF-α、IL-10水平比較

3 討 論

目前，臨床上關(guān)于IBS的發(fā)病機(jī)制尚且需要進(jìn)一步研究。本研究主要探討IBS-D、IBS-C的發(fā)病機(jī)制是否均與腸黏膜免疫激活的情況及腸道微生態(tài)有關(guān)，從而對(duì)以上兩種亞型疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。IBS-D以腹瀉為主，IBS-C以便秘為主，本研究結(jié)果顯示，IBS-D組、IBS-C組患者糞便性狀評(píng)分分別為(5.76±0.65)分、(5.68±0.58)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IBS-D組糞便性狀評(píng)分略高，分析其原因可能由于選取的樣本量少有關(guān)，期待后續(xù)研究擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析，以提高研究結(jié)果準(zhǔn)確性。

IBS-D組、IBS-C組肥大細(xì)胞的數(shù)目分別為(25.28±3.25)個(gè)/5 Hp、(25.17±2.89)個(gè)/5 Hp，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示肥大細(xì)胞數(shù)量與疾病類(lèi)型無(wú)關(guān)，無(wú)論何種類(lèi)型的IBS，均存在肥大細(xì)胞數(shù)量異常的情況。肥大細(xì)胞主要來(lái)源于淋巴、黏膜血管等位置，并且還具有免疫活性的作用，與此同時(shí)還能夠不斷分泌炎性物質(zhì)等，主要在腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，當(dāng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)被抗原激活以后，機(jī)體中的感覺(jué)神經(jīng)末梢會(huì)產(chǎn)生興奮作用，進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體不斷分泌出IgE抗體，抗原與抗體形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞受到激活作用或者脫落，進(jìn)一步促進(jìn)肥大細(xì)胞不斷分泌出炎性物質(zhì)等，如炎性因子TNF-α、IL-10等[7-8]。越來(lái)越多的研究均顯示[9-11]，IBS是主要由于內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，從而引起的一種動(dòng)力性疾病，在免疫系統(tǒng)各個(gè)環(huán)節(jié)中，肥大細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，主要發(fā)揮信息調(diào)控作用。激活后的肥大細(xì)胞主要將免疫應(yīng)答信息傳遞給神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)機(jī)體靶器官，最終使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[12]。有研究報(bào)道，免疫系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程與腸道菌群存在關(guān)系，腸道菌群分泌的毒性物質(zhì)具有免疫原性作用，一定程度上能夠?qū)C(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮刺激作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)以上毒性物質(zhì)的抵抗能力[13]?？傊琁BS-D和IBS-C兩種亞型疾病的發(fā)病機(jī)制可能均與腸黏膜免疫激活存在關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，IBS-D組、IBS-C組雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)目比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大腸埃希菌、腸球菌數(shù)目比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此研究結(jié)果提示IBS可能與腸道微生態(tài)異常存在關(guān)系。分析其原因可能是由于腸道菌群多樣性及數(shù)目等出現(xiàn)異常變化，增加腸道的通透性，從而引起機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂的現(xiàn)象，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體多種炎性反應(yīng)，腸道通透性增加，體液在進(jìn)入腸腔處異常增多，糞便中的含水量則上升，腸道處的活性物質(zhì)不斷刺激腸道平滑肌，使其收縮，進(jìn)一步促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，另外，相關(guān)炎性因子及活性物質(zhì)的刺激作用亦可對(duì)患者的內(nèi)臟感覺(jué)系統(tǒng)發(fā)揮激活作用，從而影響患者機(jī)體胃腸反射，誘導(dǎo)患者出現(xiàn)腹痛癥狀。還有研究報(bào)道，兩種亞型IBS患者中致病菌大腸埃希菌、腸球菌的數(shù)目均比體檢健康者多，優(yōu)勢(shì)菌雙歧桿菌、乳酸桿菌均較少，微生態(tài)環(huán)境變化，進(jìn)一步加重IBS患者疾病癥狀[14]。本研究結(jié)果顯示，IBS-D組、IBS-C組TLR4 mRNA、TLR5 mRNA及炎性因子TNF-α、IL-10水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有研究報(bào)道，TLR4、TLR5均在微生態(tài)失調(diào)與炎性反應(yīng)之間發(fā)揮著重要的作用，微生態(tài)失調(diào)引起機(jī)體炎性反應(yīng)，TLR4、TLR5基因表達(dá)均異常上升[15]。

綜上所述，IBS-D和IBS-C發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均存在腸黏膜免疫激活的情況及腸道微生態(tài)異常，可能與活化TLR4、TLR5的表達(dá)有關(guān)，從而產(chǎn)生炎性因子，促進(jìn)IBS的發(fā)生、發(fā)展，其中IBS-D患者結(jié)腸組織中雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)目更低。