1株鵝星狀病毒分子進(jìn)化分析及纖突蛋白多克隆抗體的制備

伍輝吉，趙 丹，陳濟鐺，張溢珊，朱婉君，張濟培*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山528231；2.佛山萬牧洲生物科技有限公司，廣東 佛山 528231)

星狀病毒(astroviruses,AstV)為無囊膜，單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為6.8～7.9 kb[1]。5′非編碼區(qū)(5′UTR)開始緊接著3個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)以及多聚腺苷酸尾巴(poly-A tail)，其中ORF1a與ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白(capsid protein,CP)[2]。國際病毒分類學(xué)委員會(ICTV)根據(jù)感染宿主的不同將星狀病毒科劃分為2個不同的病毒屬：哺乳動物星狀病毒屬(Mamastrovirus,MAstV)和禽星狀病毒屬(Avastrovirus,AAstV)，并規(guī)定ORF2全長氨基酸序列的平均氨基酸遺傳距離為0.576～0.741,可劃分為不同種的星狀病毒[3]。ORF2編碼的衣殼蛋白，包括保守的N端和高變的C端，N端主要為衣殼殼體蛋白結(jié)構(gòu)域，C端主要為纖突蛋白(Spike)結(jié)構(gòu)域，是病毒主要的免疫原性蛋白[4]。YORK等[5-7]的研究均顯示通過重組系統(tǒng)表達(dá)的衣殼蛋白C端具有良好的免疫原性及反應(yīng)性。

2015年以來，中國山東、河南、河北、湖南、廣東、福建、黑龍江等地雛鵝群中相繼暴發(fā)致死性雛鵝內(nèi)臟痛風(fēng)。YUAN等[8-10]均于出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀的雛鵝體內(nèi)分離獲得2型鵝星狀病毒(GoAstV-2)，并通過病例復(fù)制試驗證實2型鵝星狀病毒與雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)相關(guān)。目前針對雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)大多處于對癥治療階段，尚無有效商品化疫苗用于雛鵝致死性內(nèi)臟痛風(fēng)的防控，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本試驗對實驗室分離鑒定保存的1株鵝星狀病毒的ORF2即衣殼蛋白基因進(jìn)行序列測定，通過同源比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、氨基酸平均遺傳距離計算了解分離株分子進(jìn)化情況。通過推導(dǎo)的氨基酸序列，預(yù)測衣殼蛋白纖突結(jié)構(gòu)(Spike)并通過生物信息學(xué)分析了解Spike蛋白的變異情況、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。運用pET-30a表達(dá)載體及BL21(DE3)表達(dá)菌株完成Spike重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及初步表達(dá)，免疫新西蘭白兔獲得Spike蛋白多克隆抗體，以期為鵝星狀病毒Spike蛋白功能研究、血清學(xué)檢測方法的建立以及亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與衣殼蛋白來源毒株由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病研究所2018年11月從廣東省肇慶市發(fā)生雛鵝痛風(fēng)的鵝廠中采集的組織樣品中分離獲得，命名為AstV/goose/Guangdong/1811LHC/2018，簡稱LHC株。鵝星狀病毒衣殼蛋白由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病研究所以LHC株為模板構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)并純化獲得。

1.2 主要試劑TransZol Up Plus RNA Kit，BL21(DE3) Chemically Competent Cell(北京全式金生物技術(shù)公司)；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa LA Taq，E.coliDH5α Competent Cells，PMD18-T Vector(寶日生物技術(shù)(北京)公司)；Gel Extraction Kit(200)(OMEGA公司)；pET-30a(+)(優(yōu)寶生物科技公司)；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ，XhoⅠ，T4連接酶(New England Biolabs 公司)；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，IPTG(碧云天生物技術(shù)公司)；His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(康為世紀(jì)公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢三鷹生物技術(shù)公司)；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma 公司)。

1.3 衣殼蛋白基因序列測定與分析根據(jù)GenBank中保存的鵝源星狀病毒全基因序列(AXI69840)針對編碼衣殼蛋白的ORF2設(shè)計特異性擴增引物JD256：5′-AGTCGGGCCCGACTTCT-3′；JD257：5′-CTGTACCCTCGATCCTACTCG-3′，預(yù)期擴增片段大小為2 215 bp。運用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取病毒總RNA，PrimeScr-ipt Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。運用引物JD256/JD257以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，Gel Extraction Kit(200)試劑盒對目的條帶進(jìn)行回收純化?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含氨芐的LB平板上。篩選出的陽性克隆菌株送至生工測序，測序結(jié)果上傳至NCBI。

應(yīng)用EditSeq對測得序列進(jìn)行ORF定位，并推導(dǎo)獲得LHC株衣殼蛋白氨基酸序列。應(yīng)用Conserved Domain Search進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，MegAlign對LHC株與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的星狀病毒衣殼蛋白氨基酸序列做相似性分析，MEGA 7.0對其進(jìn)行遺傳距離分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 纖突蛋白理化特性分析根據(jù)Conserved Domain Search保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果推導(dǎo)獲得纖突蛋白編碼序列，并通過ExPAsy服務(wù)器的Protaram程序分析纖突蛋白理化性質(zhì)，I-TASSER進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，ESpript對LHC株纖突蛋白與其他鵝星狀病毒進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)及氨基酸序列多重比對。

1.5 纖突蛋白的原核表達(dá)及純化根據(jù)LHC株測序結(jié)果針對Spike基因序列設(shè)計特異性擴增引物。HJ-F1： 5′-TCTCATATGCAGGTTACACCCTCG-CTT-3′;HJ-R1：5′-TTGCTCGAGGTCAGTCTCA-TCTTCCGCTGT-3′,引入雙酶切位點NdeⅠ和XhoⅠ，預(yù)期目的片段大小為711 bp。運用引物HJ-F1/HJ-R1以1.3所獲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物膠回收，獲得含有雙酶切位點的編碼纖突蛋白的cDNA片段，分別對回收的纖突蛋白cDNA片段與原核表達(dá)載體pET-30a(+)(Kan+)進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶雙酶切處理后回收，并將回收后載體與片段以1∶3混合后加入T4連接酶，16℃恒溫連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于卡那霉素抗性平板。通過雙酶切鑒定與測序驗證獲得重組質(zhì)粒命名為pET-30a-Spike。

pET-30a-Spike重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21表達(dá)菌株，篩選陽性菌株接種至Kan+(50 mg/L)LB肉湯，振蕩培養(yǎng)過夜的菌液按1∶100接種至新鮮Kan+LB肉湯，振蕩培養(yǎng)(37℃，200 r/min)至D600值為0.6左右，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)37℃、100 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。含pET-30a(+)的對照菌株進(jìn)行同步誘導(dǎo)表達(dá)。重組纖突蛋白預(yù)期大小為26.8 kDa，C端含有His標(biāo)簽。培養(yǎng)好的菌液離心后用PBS重懸，超聲破碎后再離心，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的可溶性。

經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行初步鑒定后，按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書對目的蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白以1∶2 000比例稀釋的抗His的鼠單克隆抗體為一抗，1∶10 000比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot驗證。運用截留相對分子質(zhì)量(MWCO)為10 kDa的蛋白超濾管對純化后的纖突蛋白溶液進(jìn)行離心濃縮后加入適量PBS再離心進(jìn)行纖突蛋白溶液的脫鹽和緩沖液更換，并運用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定纖突蛋白濃度，計算蛋白得率。

1.6 纖突蛋白多克隆抗體的制備及鑒定選擇8周齡，雌性，新西蘭兔作為免疫動物。初次免疫：取0.4 mg 蛋白加PBS至總體積500 μL，與等量弗氏完全佐劑混勻并乳化后，皮下分點注射(4個部位，兩側(cè)腹股溝和腋窩)；初免14 d后二次免疫：取0.2 mg 蛋白加PBS至500 μL，與等量弗氏不完全佐劑混勻并乳化后，皮下注射；二免14 d 后第3次免疫：取0.1 mg蛋白加入100 μL PBS，不加佐劑，靜脈注射。于第2次加強免疫后7 d 耳緣靜脈采血，分離血清。 分別以原核表達(dá)的衣殼蛋白與纖突蛋白為抗原，1∶2 000比例稀釋的兔抗纖突蛋白血清為一抗，1∶10 000比例稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western blot 驗證。

2 結(jié)果

2.1 衣殼蛋白序列測定及分子進(jìn)化分析衣殼蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠自動成像系統(tǒng)中于2 200 bp左右可見單一高亮條帶(圖1)，大小與預(yù)期相符。測序結(jié)果經(jīng)ORF定位顯示LHC株衣殼蛋白基因全長2 115 nt，共編碼704個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為77.6 kDa，其中第39～406位氨基酸殘基為預(yù)測的衣殼蛋白N端，構(gòu)成衣殼內(nèi)側(cè)的殼體蛋白，第425～665位氨基酸殘基為預(yù)測的衣殼蛋白C端，為殼體外側(cè)的纖突蛋白。

M.DL5000 DNA Marker；1.衣殼蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物

衣殼蛋白氨基酸序列相似性分析顯示，分離株LHC與鵝星狀病毒2型(GoAstV-2)參考株相似性最高，達(dá)97.8%～99.2%，與火雞2型星狀病毒(TAstV-2)、鵝1型星狀病毒(GoAstV-1)、火雞1型星狀病毒(TAstV-1)、鴨1型星狀病毒(DAstV-1)、鴨2型星狀病毒(DAstV-2)、雞星狀病毒(CAstV)以及禽腎炎病毒(ANV)參考株之間的相似性均低于60%。氨基酸平均遺傳距離結(jié)果顯示，分離株LHC與GoAstV-2參考株的平均距離為0.011，而與GoAstV-1、TAstV-1、TAstV-2、DAstV-1、DAstV-2、CAstV以及ANV參考株間的平均遺傳距離均大于0.284，其中與TAstV-2間的平均遺傳距離最小，為0.566(表1)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，分離株LHC與GoAstV-2型參考株處于同一分支，與TAstV-2、DAstV-1距離較近，而與2014年從湖南腸炎型病鵝中分離到的鵝星狀病毒[11](FLX株)及其他禽星狀病毒距離較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 分離株LHC衣殼蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(▲表示分離株)

2.2 纖突蛋白理化特性分析Conserved Domain Search保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果提示衣殼蛋白第425～665位氨基酸殘基為纖突蛋白，共241個氨基酸殘基。ProtParam Tool理化特性分析結(jié)果顯示纖突蛋白等電點為4.47，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期為10 h，親水平均系數(shù)為-0.417。纖突蛋白氨基酸序列多重比對結(jié)果顯示LHC株與2014—2018年于湖南、廣東、安徽、山東等地分離到GoAstV-2享有很高的序列以及結(jié)構(gòu)相似性，氨基酸序列相似性達(dá)96.3%～99.2%，僅出現(xiàn)個別氨基酸位點發(fā)生點突變。均具有3個α螺旋，11個β折疊，2個無規(guī)卷曲以及9個TT轉(zhuǎn)角(圖3)。

圖3 分離株纖突蛋白氨基酸序列與不同時間不同地區(qū)分離到的GoAstV-2參考株間的多重比對

2.3 纖突蛋白基因的擴增與重組質(zhì)粒的鑒定運用引物HJ-F1/HJ-R1進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見于750 bp附近有1條高亮的單一熒光條帶，大小與預(yù)期相符(圖4)。

M.DL5000 DNA Marker； 1.纖突蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物

pET-30a-Spike重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見分別于700，5 000 bp附近出現(xiàn)2條高亮條帶，大小均與預(yù)期相符。質(zhì)粒測序結(jié)果進(jìn)一步驗證 pET-30-Spike構(gòu)建成功(圖5)。

M.DL15000 DNA Marker；1.pET-30a-Spike重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2.pET-30a空載質(zhì)粒雙酶切對照

2.4 纖突蛋白原核表達(dá)及鑒定如圖6所示，目的蛋白得到了正確表達(dá)，于25 kDa 附近出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵體形式存在沉淀中， BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)對照與轉(zhuǎn)化有pET-30a空載的BL21(DE3)的誘導(dǎo)對照均未出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的蛋白條帶。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Spike重組蛋白破碎后上清；2.Spike重組蛋白破碎后沉淀；3.BL21(DE3)菌株對照上清；4.BL21(DE3)菌株對照沉淀；5.含pET-30a空載的對照上清；6.含pET-30a空載的對照沉淀

Spike重組蛋白經(jīng)His標(biāo)簽鎳柱純化后，如圖7所示于25 kDa附近有單一的目的蛋白條帶表明已得到了高純度的Spike重組蛋白，純化后的蛋白紫外分光光度法測得質(zhì)量濃度為2.1 g/L。Spike重組蛋白Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色在25 kDa 附近出現(xiàn)單一清晰目的條帶，大小與預(yù)期相符。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.Spike重組蛋白純化產(chǎn)物

2.5 纖突蛋白多克隆抗體的鑒定用兔抗纖突蛋白的血清作為一抗分別對纖突蛋白與衣殼蛋白進(jìn)行檢測，免疫前血清作為陰性對照，如圖8所示以兔抗纖突蛋白的血清作為一抗分別于25,78 kDa出現(xiàn)特異的纖突蛋白與衣殼蛋白條帶，免疫前血清作為一抗的陰性抗體對照未出現(xiàn)蛋白條帶，表明表達(dá)的纖突蛋白具有良好的免疫原性，兔抗纖突蛋白抗體能特異性識別2型鵝型狀病毒衣殼蛋白，制備的兔抗多克隆抗體具有良好的反應(yīng)活性。

M．預(yù)染的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.以1∶2 000的兔抗纖突蛋白的血清為一抗的被特異性識別的纖突蛋白(28.6 kDa)；2.以1∶2 000的兔抗纖突蛋白的血清為一抗的被特異性識別的衣殼蛋白蛋白(78 kDa)；3.以免疫前血清作為一抗未被特異性識別的纖突蛋白

3 討論

2014年，LIU等[11]在湖南一群表現(xiàn)為腸炎與零星死亡的寧鄉(xiāng)白鵝群中分離到第1株鵝星狀病毒2型毒株，命名為HN1G(KY807085)。2017年以來中國山東、湖南、廣東、河南、黑龍江等地雛鵝群相繼暴發(fā)致死性內(nèi)臟痛風(fēng)，姜曉寧等[12]于表現(xiàn)為痛風(fēng)的雛鵝中分離到鵝星狀病毒2型毒株，并通過病例復(fù)制試驗證實致病病原為鵝2型星狀病毒。NIU等[13]從中國6省采集了4～21日齡病鵝樣品共計189份，檢出鵝源星狀病毒2型陽性樣品154份，檢出率高達(dá)81.5%，提示鵝星狀病毒2型已在中國雛鵝群中形成廣泛傳播。本試驗于2018年分離獲得的LHC株分子進(jìn)化分析顯示該分離株為鵝源星狀病毒2型毒株，與2014—2018年中國不同地區(qū)分離到的2型鵝源型狀病毒序列相似性達(dá)97.8%～99.2%，其中與2014年分離到HN1G株相似性為97.8%；表明2014—2018年中國不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株尚未發(fā)生明顯變異，與正鏈RNA病毒進(jìn)化速率特征相符。

星狀病毒衣殼蛋白包括保守的N端和高變的C端，N端主要為衣殼殼體蛋白結(jié)構(gòu)域，C端主要為纖突蛋白結(jié)構(gòu)域。LEE等[14]運用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得雞星狀病毒重組衣殼蛋白，免疫SPF雞可獲得中和抗體。通過推導(dǎo)的LHC株衣殼蛋白氨基酸序列分析其保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示第425～665位氨基酸殘基為衣殼蛋白纖突結(jié)構(gòu)，LHC株與鵝星狀病毒2型參考株纖突蛋白多重比對結(jié)果顯示，2014—2018年不同地區(qū)分離到的鵝星狀病毒2型毒株的纖突蛋白享有很高的序列以及結(jié)構(gòu)相似性，僅出現(xiàn)個別氨基酸位點發(fā)生點突變，表明2014—2018年中國不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株纖突蛋白尚未發(fā)生明顯變異。以LHC株為模板構(gòu)建鵝星狀病毒2型毒株纖突蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行初步表達(dá)，重組纖突蛋白可溶性分析結(jié)果顯示目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，少部分以包涵體形式存在沉淀中，與纖突蛋白親水性預(yù)測結(jié)果基本相符。免疫新西蘭白兔分離血清獲得多克隆抗體，以倍比稀釋的兔抗纖突蛋白的血清作為一抗對星狀病毒纖突蛋白及衣殼蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示抗體稀釋度達(dá)1∶2 000時仍可見清晰的纖突蛋白與衣殼蛋白條帶，表明制備的兔抗纖突蛋白多克隆抗體具有良好的免疫原性及反應(yīng)活性。

本試驗運用分子生物學(xué)方法測定了分離株LHC的衣殼蛋白基因，同源性、系統(tǒng)發(fā)育分析及氨基酸平均遺傳距離計算結(jié)果均表明分離株為鵝星狀病毒2型毒株，2014—2018年中國不同地區(qū)間的鵝星狀病毒2型毒株尚未發(fā)生明顯變異。成功構(gòu)建鵝星狀病毒2型纖突蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)獲得具有生物活性的重組纖突蛋白，免疫新西蘭白兔獲得具有反應(yīng)活性的多克隆抗體，為鵝星狀病毒纖突蛋白功能研究、血清學(xué)檢測方法的建立以及亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。