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      無曲液態(tài)米酒釀酒酵母篩選

      2022-01-25 08:04:20鄭瑞龍楊傳佳鈕成拓鄭飛云王金晶劉春鳳
      關(guān)鍵詞:品評(píng)米酒乙酯

      鄭瑞龍,楊傳佳,鈕成拓,鄭飛云,王金晶,李 崎,劉春鳳*

      (1.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫 214122;2.江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

      米酒是以糯米為主要原料,經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵釀造而成[1]。我國(guó)糯米釀酒歷史悠久。傳統(tǒng)米酒多為固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵,經(jīng)浸米、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、澄清、煎酒、陳化、勾兌等步驟,采用“酒曲復(fù)式發(fā)酵法”[2]。一般認(rèn)為,米曲是米酒釀造過程中重要微生物來源,可為米酒釀造過程提供淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等豐富酶系,但傳統(tǒng)米酒生產(chǎn)工藝效率較低,能耗較高,浸米廢水對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重,且無法保障米酒批間風(fēng)味穩(wěn)定性[3]。如今,酶制劑在釀造業(yè)應(yīng)用廣泛,盛鳳云等利用高溫淀粉酶將粉碎原料粉碎后液化,取代傳統(tǒng)工藝中的浸米和蒸米,并初步估算能量,可節(jié)省50%以上[4]。張敏將酶法液化的糯米粉進(jìn)一步添加糖化酶和麥曲進(jìn)行多酶釀造米酒[5]。但目前液態(tài)發(fā)酵米酒多為酒曲與酶制劑協(xié)同作用,中國(guó)釀酒協(xié)會(huì)曾提出從傳統(tǒng)雙邊發(fā)酵改為先糖化后發(fā)酵的清液發(fā)酵技術(shù)可行[6]。與傳統(tǒng)發(fā)酵米酒(曲和酵母聯(lián)合處理)相比,使用酶法液化制備糯米糖液,接種純種酵母液態(tài)米酒,使米酒產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)更可控,并且可以提高勞動(dòng)生產(chǎn)率和機(jī)械水平,有利于現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

      酵母性能優(yōu)劣不僅決定米酒釀造效率,還影響米酒風(fēng)味品質(zhì)[7-8]。我國(guó)傳統(tǒng)米酒酒曲中含有多種微生物,其中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是酒曲中主要產(chǎn)酒精功能菌,對(duì)米酒質(zhì)量和發(fā)酵效率有較大影響[9-10]。酒曲中酵母包括酵母屬、假絲酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬和畢赤酵母屬等[2],目前對(duì)適用于米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母研究較為缺乏。伍保龍等從米酒酒曲中分離得到產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的釀酒酵母,但并未對(duì)其風(fēng)味進(jìn)行分析及米酒純種發(fā)酵[11]。鄒凌波使用從酒曲和米酒醪中分離得到的釀酒酵母協(xié)同糖化酶進(jìn)行雙邊發(fā)酵[12]。對(duì)于適用于純液態(tài)發(fā)酵的釀酒酵母篩選應(yīng)用仍鮮有報(bào)道,菌株多樣化為釀造酒生產(chǎn)提供豐富多樣性[13],篩選適用于液態(tài)米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母具有重要價(jià)值與意義。為此,本研究以分離自米曲樣品中潛在釀酒酵母和實(shí)驗(yàn)室保藏共計(jì)198株菌株為研究對(duì)象,測(cè)定其產(chǎn)氣能力、乙醇生產(chǎn)能力和發(fā)酵速率等,并分析菌株發(fā)酵所得米酒理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其香氣貢獻(xiàn),最終得到具有優(yōu)良潛力的釀酒酵母。該研究對(duì)純種發(fā)酵液態(tài)米酒開發(fā)具有重要參考價(jià)值。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      糯米購(gòu)置于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng);米曲購(gòu)自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū);菌株YSHJ為上海某酒廠提供,應(yīng)用于米酒發(fā)酵,為釀酒酵母屬。有機(jī)酸、揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司;試驗(yàn)藥品均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

      1.2 培養(yǎng)基

      YPD培養(yǎng)基:用于酵母培養(yǎng),主要成分包括葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母粉10 g,瓊脂粉20 g(用于固體培養(yǎng)基),蒸餾水1 000 mL,115℃滅菌15 min;

      商業(yè)Biggy agar培養(yǎng)基:由青島海博生物技術(shù)有限公司提供;

      TTC底層培養(yǎng)基:葡萄糖50.5 g,蛋白胨10 g,酵母浸膏7.5 g,酸性磷酸鉀5 g,硫酸鎂2 g,檸檬酸1.35 g,瓊脂30 g,115℃滅菌15 min,滅菌冷卻后加入氨芐青霉素1.0 g;TTC上層培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖0.5 g,瓊脂15 g,115℃滅菌15 min,冷卻后加入TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)0.5 g。

      1.3 方法

      1.3.1 酵母菌株分離

      購(gòu)買來自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū)12種米酒酒曲。分別取2 g酒曲樣品添加至含玻璃珠50 mL無菌生理鹽水中,25℃、180 r·min-1活化20 min后,將菌液稀釋涂布至添加含有1 g·L-1丙酸鈉、25 mg·L-1氨芐抗菌YPD固體平板中,28℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑選出具有形態(tài)圓形、表明光滑、邊緣整齊菌落,在YPD平板上作二次劃線分離,純化分離物接入YPD液體甘油管中于-80℃保存,并編號(hào)。

      1.3.2 菌株起始發(fā)酵能力

      將甘油管保藏菌株接種于YPD液體試管中,28℃、180 r·min-1培養(yǎng)活化2次后接種至糖度為11%含杜氏小管糯米汁培養(yǎng)基中,25℃靜置培養(yǎng)48 h,保留起酵速度快菌株用于下一級(jí)篩選。

      1.3.3 菌株硫化氫生成能力

      在YPD液體試管中活化起酵能力較好菌株,在Biggy agar平板上點(diǎn)樣5μL過夜培養(yǎng)物,28℃靜置培養(yǎng)48 h,根據(jù)菌落顏色選擇低產(chǎn)或不產(chǎn)硫化氫菌株用于下一級(jí)篩選(菌落顏色越淺,硫化氫生成能力越低)。

      1.3.4 菌株乙醇生成能力

      將以上篩選得到酵母菌株在YPD液體試管中活化,在TTC下層平板上點(diǎn)樣5μL,28℃培養(yǎng)24~48 h,倒入TTC上層培養(yǎng)基,28℃避光培養(yǎng)2~4 h,挑選菌落顏色較深,產(chǎn)酒精能力強(qiáng)菌株。

      1.3.5 糯米汁糖液制備

      粉碎糯米按照料水質(zhì)量比1∶6,于50℃投料。添加高溫α-淀粉酶,升溫至95℃,保溫30 min,升溫至100℃,煮沸10 min;冷卻至50℃,按200 U·g-1糯米添加蛋白酶,保溫30 min;升溫至62℃,按180 U·g-1糯米添加糖化酶,保溫120 min;過濾后煮沸10 min。所得糯米糖液根據(jù)需要稀釋成目標(biāo)糖度,于高壓蒸汽滅菌鍋中105℃滅菌10 min。

      1.3.6 液化法米酒發(fā)酵試驗(yàn)

      在糯米汁中接種釀酒酵母菌株,以米酒酵母YSHJ為對(duì)照。

      具體發(fā)酵方法為:糯米汁糖度16%,發(fā)酵規(guī)模500 mL,裝液量60%,發(fā)酵體系中酵母接種量為107cfu·mL-1,25℃發(fā)酵,并監(jiān)測(cè)其失重,直至24 h內(nèi)失重<0.2 g·300 mL-1,發(fā)酵結(jié)束后離心過濾獲得米酒。每批次發(fā)酵設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行。

      1.3.7 液化法米酒分析檢測(cè)

      1.3.7.1 米酒理化指標(biāo)測(cè)定

      米酒理化指標(biāo)分析過程參照黃酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14]和《釀酒工業(yè)分析》[15]方法。

      1.3.7.2 米酒有機(jī)酸含量測(cè)定

      將酒樣適當(dāng)稀釋后,經(jīng)C18固相萃取柱過濾后用0.22μm水系濾膜過濾備用。

      色譜條件:色譜柱Waters X select HSS T3(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:0.02 mol·L-1(pH 2.5)磷酸二氫鉀緩沖液;流速:0.5 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量:10μL;柱溫30℃。根據(jù)峰保留時(shí)間和其峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品比較,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線作定量測(cè)定。

      1.3.7.3 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

      通過SPME-GC-MS測(cè)定米酒中揮發(fā)性化合物,酒樣處理?xiàng)l件為:將8 mL酒樣加入20 mL潔凈螺口頂空瓶中,并加入2.0 g NaCl和2-辛醇內(nèi)標(biāo)(終濃度50μg·L-1)。45℃預(yù)熱5 min,萃取60 min。萃取結(jié)束后,將75μm Car/PDMS萃取頭插入進(jìn)樣口,250℃解吸附5 min。分析條件為:EG-20 m彈性石英毛細(xì)管柱,30 m×0.25 m×0.25μm;載氣為高純氦氣,恒定流量為0.8 mL·min-1;升溫程序:從180℃開始,保持2 min,以3℃·min-1升溫到230℃,保持10 min;進(jìn)樣口溫度250℃,出樣口溫度200℃;檢測(cè)電壓350 V。

      MS條件:EⅠ離子源,發(fā)射電流200μA,電子能量70 eV,掃描范圍20~550 U。未知化合物定性通過與NⅠST 05質(zhì)譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)確定,化合物定量通過在體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液中配制待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)定量化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值與定量化合物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物濃度。

      1.3.8 米酒感官品評(píng)

      感官品評(píng)小組由2名具有專業(yè)品評(píng)經(jīng)驗(yàn)老師和8名經(jīng)酒類品評(píng)訓(xùn)練并選拔出的研究生組成,小組成員定期開展米酒感官品評(píng)訓(xùn)練后作為品評(píng)員完成感官品評(píng)。感官品評(píng)評(píng)分和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[2]。

      表1 感官品評(píng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Organoleptic evaluation criteria

      1.3.9 菌株18S rDNA鑒定

      將甘油管保藏菌株于10 mL YPD培養(yǎng)基中,28℃、180 r·min-1過夜活化,隨后轉(zhuǎn)接至10 mL YPD培養(yǎng)基中,28℃、180 r·min-1培養(yǎng)18~24 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min(12 000 r·min-1),棄上清,采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA,選用酵母ⅠTS通用引物(ⅠTS1-F:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′;ⅠTS4-R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)擴(kuò)增基因組DNA,測(cè)序PCR產(chǎn)物。采用BLAST方式將測(cè)定的18S rDNA序列與Gen-Bank中酵母菌序列作比對(duì),構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

      1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

      研究使用GraphPad Prism 8.4.3繪圖,使用SPSS 26.0作顯著性、主成分等統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 酵母菌株篩選

      試驗(yàn)從米曲樣品中分離得到菌株108株及實(shí)驗(yàn)室保藏菌株90株,共198株菌株用于下一步試驗(yàn)(見表2),表中短線以上數(shù)目為進(jìn)入下一篩選階段菌株個(gè)數(shù)。

      表2 菌株篩選結(jié)果Table 2 Screening results of strains

      對(duì)試驗(yàn)菌株作杜氏小管發(fā)酵試驗(yàn),25℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。結(jié)果表明,57株氣體全部充滿杜氏小管且均有一定酒精感,47株氣體占杜氏小管2/3,該104株為起酵能力較優(yōu)菌株。酵母在發(fā)酵過程中伴隨含硫化合物合成而產(chǎn)生H2S,H2S揮發(fā)性較強(qiáng),具有臭雞蛋不愉悅氣味。通過使用BⅠGGY瓊脂培養(yǎng)基顯色程度對(duì)杜氏小管篩選得到酵母產(chǎn)H2S能力作表征。其中29株菌株菌落為白色或黃色,認(rèn)為其低產(chǎn)硫化氫。進(jìn)一步通過TTC篩選平板,選擇菌落顏色深紅色產(chǎn)酒精能力強(qiáng)10株菌株開展后續(xù)研究。

      調(diào)整糯米汁發(fā)酵培養(yǎng)基糖度為12%,接種10株菌株,并以米酒酵母YSHJ為對(duì)照,該菌株為酒廠提供,并已應(yīng)用于米酒生產(chǎn)。測(cè)定發(fā)酵速度與酒精度。各菌株發(fā)酵速率根據(jù)其CO2生成速度判斷,斜率越大則發(fā)酵速度越快,結(jié)果如圖1顯示,菌株21和26的CO2失重最高,分別為4.86和4.84 g。菌株13和40發(fā)酵速度最慢。所有菌株中,有7株菌株酒精度高于對(duì)照菌株。

      圖1 不同菌株發(fā)酵性能Fig.1 Fermentation ability of different strains

      2.2 米酒發(fā)酵

      基于上述試驗(yàn)篩選得到7株發(fā)酵性能較為優(yōu)良菌株,開展米酒發(fā)酵試驗(yàn),同時(shí)以米酒酵母YSHJ為對(duì)照組,發(fā)酵完成后,分析其基礎(chǔ)理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味化合物。

      2.2.1 米酒理化指標(biāo)分析

      米酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)如表3所示,除菌株30和127發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng),12 d完成發(fā)酵,其余菌株發(fā)酵時(shí)間均為10 d。不同菌株發(fā)酵米酒酒精度為7.02%~7.19%V/V,無顯著差異,菌株21、30、184發(fā)酵米酒殘?zhí)歉哂趯?duì)照菌株YSHJ。相較于對(duì)照菌株,菌株26、89和167發(fā)酵米酒具有更高酒精度和更少殘?zhí)?,具有潛在發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。除菌株21、26具有較高總酸含量外,其余菌株發(fā)酵米酒總酸含量低,適量酸可提高米酒品質(zhì)。菌株21、26、127和167所得米酒具有較高甘油含量,甘油是酵母酒精發(fā)酵過程中主要副產(chǎn)物之一,可為酒體提供圓潤(rùn)、柔滑口感,一定含量甘油可增加米酒復(fù)雜性。

      表3 米酒理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indices of rice wine

      2.2.2 米酒有機(jī)酸含量分析

      米酒中有機(jī)酸種類豐富,共檢出有機(jī)酸8種,其中含量最高兩種有機(jī)酸為檸檬酸和乳酸。有機(jī)酸有助于穩(wěn)定酒體香氣,提高酒品質(zhì),但含量過高則表現(xiàn)酸感突出、酒質(zhì)粗糙。檸檬酸酸味較長(zhǎng),口感圓潤(rùn)清爽,但過量則辣口[16],對(duì)照菌株發(fā)酵所得米酒產(chǎn)生的檸檬酸為0.71 g·L-1,是所有菌株中產(chǎn)檸檬酸量最高菌株。乳酸口感柔和,增加酒體醇厚度[17],菌株167發(fā)酵的米酒乳酸含量最高,達(dá)0.55 g·L-1,作為一種溫和有機(jī)酸,更高濃度乳酸可能使酒體更柔滑。琥珀酸又稱丁二酸,具有酸味和咸苦味可調(diào)和酒體,其可形成丁二酸二乙酯等化合物,對(duì)酒的風(fēng)味具有重要影響[18],菌株21、26、127和30發(fā)酵的米酒均具有含量較高的琥珀酸。蘋果酸酸感清爽,呈味持久且略帶刺激性,菌株之間蘋果酸含量差異小,占總有機(jī)酸含量12%~15%(見表4)。

      表4 米酒有機(jī)酸組成Table 4 Organic acid components of rice wine (g·L-1)

      2.2.3 米酒感官品評(píng)

      按照黃酒品評(píng)描述對(duì)米酒作感官品評(píng),表5顯示各菌株發(fā)酵所得米酒感官品評(píng)得分結(jié)果。所有菌株發(fā)酵米酒色澤差異較小,酒體澄清透明,但光澤較弱。香氣指標(biāo)下各菌株具有一定差異,其中菌株21、26發(fā)酵米酒香氣較為馥郁,酒香純正且有糯米香,菌株184和YSHJ發(fā)酵米酒酒香較為突出,但米香略弱,菌株89和127發(fā)酵米酒香氣愉悅度低,有輕微異雜味,整體酒香、米香不足。發(fā)酵米酒酒體普遍清爽柔和,其中,菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒的酒體更為協(xié)調(diào),酸甜度較為適中。菌株127發(fā)酵米酒具有明顯辣口感和酸感,口感較差。典型性上雖得分差異小,但菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒相較于其他菌株米酒發(fā)酵香氣更為突出。因此,將進(jìn)一步測(cè)定各菌株發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以分析其特點(diǎn)。

      表5 米酒感官品評(píng)得分Table 5 Organoleptic evaluation of rice wine

      2.2.4 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

      通過GC-MS檢測(cè)8種不同菌株發(fā)酵米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物,共檢測(cè)到揮發(fā)性化合物84種,其中包含25種醇類化合物,30種酯類化合物,8種酸類化合物12種醛酮類化合物和其他類化合物9種。菌株27發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類最多,為60種。菌株67發(fā)酵米酒最少,為50種。菌株YSHJ、21和26發(fā)酵的米酒檢出55種,菌株30、89和104發(fā)酵米酒分別檢出56種、53種和54種揮發(fā)性風(fēng)味化合物(數(shù)據(jù)未顯示)。酯類化合物作為米酒中種類最多的揮發(fā)性化合物,主要以乙酯為主,如癸酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯等。醇類化合物含量最高分別為異戊醇、苯乙醇和異丁醇。

      在所有化合物中,以醇酯類化合物含量最為豐富,可占到揮發(fā)性化合物總量87.08%~91.47%(見圖2)。作為對(duì)照菌株,YSHJ發(fā)酵米酒中,醇類化合物相對(duì)含量69.39%,酯類化合物占比19.64%,酸類化合物占比7.54%,醛酮酚類化合物占比3.28%。酯類化合物可促進(jìn)果香和花香等香氣產(chǎn)生[19],對(duì)米酒香氣發(fā)揮積極作用,菌株26和30所得發(fā)酵酒中酯含量較高,占總揮發(fā)性風(fēng)味化合物24.22%和24.96%,其酸類化合物含量也相對(duì)較高,分別為9.75%和11.30%,適量的酸可提高酒的復(fù)雜程度和協(xié)調(diào)性。菌株89、167和184所得米酒醇類化合物占比在70%以上,菌株184發(fā)酵所得米酒中醇類化合物占比為所有菌株最高,為76.52%,高濃度醇類會(huì)產(chǎn)生刺激性氣味和苦澀味道[20]。

      圖2 米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成Fig.2 Composition of volatile compound in rice wine

      揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)香氣的貢獻(xiàn)更多取決于其風(fēng)味閾值和在酒中實(shí)際含量。因此,選取酯類含量較為豐富的菌株21、26、30、127和YSHJ,對(duì)其米酒中22種揮發(fā)性風(fēng)味化合物作定量分析。

      米酒中醇類物質(zhì)除乙醇外,主要為高級(jí)醇。高級(jí)醇是在發(fā)酵過程中,通過氨基酸脫羧和脫氨基形成。高級(jí)醇在酒中可使酒體更豐滿濃郁,但高級(jí)醇含量過高不僅破壞酒體協(xié)調(diào),更易對(duì)人體造成損傷[21],一般情況下發(fā)酵啤酒中高級(jí)醇含量<100 mg·L-1,黃酒中高級(jí)醇含量為8~540 mg·L-1,葡萄酒中高級(jí)醇認(rèn)為<300 mg·L-1[22]。異戊醇、異丁醇、苯乙醇和正丙醇是米酒中最主要高級(jí)醇。異戊醇、異丁醇具有明顯刺激性氣味和苦澀感,菌株127發(fā)酵米酒具有最高異戊醇產(chǎn)量(61.33 mg·L-1),菌株YSHJ發(fā)酵米酒具有最高異丁醇含量(67.99 mg·L-1)。苯乙醇可產(chǎn)生類似玫瑰、香甜和丁香的香氣,是米酒中獨(dú)特風(fēng)味化合物[23],菌株YSHJ、127和26發(fā)酵米酒中苯乙醇產(chǎn)量較高,分別為10.24、9.04、7.68 mg·L-1,作為米酒釀造菌株可為米酒提供典型米酒香氣。

      酯類化合物是黃酒香氣成分中含量第二高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯和丁酸乙酯是米酒中含量較高的酯類化合物。其中,乙酸乙酯在各菌株中含量最高,為5.88~6.90 mg·L-1,作為米酒中主要酯類風(fēng)味化合物之一,乙酸乙酯酒有積極的香氣貢獻(xiàn)。乳酸乙酯在菌株21和30發(fā)酵所得米酒中未檢出,在其他菌株發(fā)酵米酒中含量為2.63~2.67 mg·L-1。乙酸異戊酯具有香蕉風(fēng)味。中鏈脂肪酸乙酯,如丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯可提供令人愉悅的果香。

      表6 米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量分析Table 6 Quantitative analysis of volatile compounds in rice wine

      2.2.5 米酒主要揮發(fā)性化合物OAV

      香氣活力值(Odor activity value,OAV)用于表征化合物對(duì)樣品香氣的貢獻(xiàn)程度,通過該揮發(fā)性風(fēng)味化合物在樣品中濃度與該化合物氣味閾值比值計(jì)算[24],OAV大于1則表示該化合物對(duì)酒整體香氣具有明顯貢獻(xiàn)[25]。

      由表7可知,根據(jù)OAV計(jì)算結(jié)果,22種揮發(fā)性化合物中共有13種化合物OAV>1,是關(guān)鍵香氣化合物。苯乙醇作為米酒中具有特征風(fēng)味的化合物,其在4個(gè)菌株發(fā)酵米酒中香氣活力均不及對(duì)照菌株YSHJ,但菌株127和菌株26所得米酒相對(duì)較高,分別為1.81和1.54。乙酸異戊酯、丁酸乙酯和癸酸異戊酯OAV>10,乙酸異戊酯具有香蕉、水果特征香氣,丁酸乙酯具有白蘭地、水果特征香氣,癸酸異戊酯具有香蕉、青草和白蘭地特征香氣。這些化合物可給酒體貢獻(xiàn)積極的果香味,但癸酸異戊酯在菌株127所得米酒中并未檢出。結(jié)合感官品評(píng)結(jié)果,YSHJ和菌株127發(fā)酵米酒香氣得分較低,酒精感較明顯,與其異丁醇和異戊醇濃度較高有關(guān)。

      表7 主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物OAV及香氣描述Table 7 Odor activity value and aroma description of volatile compounds

      芳樟醇和十六酸乙酯在除菌株21以外菌株所發(fā)酵米酒中均有檢出,芳樟醇雖含量較低,但菌株26、30和127發(fā)酵米酒對(duì)應(yīng)OAV>1,可為酒提供花香和薰衣草香氣。十六酸乙酯具有果香、奶油香特征香氣,OAV>4,菌株26發(fā)酵米酒十六酸乙酯OAV最高,為4.32。中、長(zhǎng)鏈脂肪酸乙酯被認(rèn)為是米酒中具有代表性的重要風(fēng)味化合物[27]。

      酸類物質(zhì)是釀造酒中重要呈味物質(zhì),可賦予酒體協(xié)調(diào)的口感。但高濃度下,產(chǎn)生脂肪、腐臭等異味,給酒帶來負(fù)面影響[28-29],例如高含量辛酸造成酒風(fēng)味品質(zhì)下降。菌株127發(fā)酵米酒的酸類化合物OAV普遍高于其他菌株。菌株26發(fā)酵的米酒中酸類化合物OAV較低,感官評(píng)價(jià)香氣較為馥郁和諧。

      對(duì)OAV值大于1的13種揮發(fā)性化合物作主成分分析。如圖3所示,前兩個(gè)PC描述67.55%方差,其中第一主成分PC1占方差46.22%,與癸酸異戊酯呈負(fù)相關(guān)。第二主成分PC2占方差21.33%,與十六酸乙酯、芳樟醇等呈正相關(guān),與乙酸乙酯、正癸酸呈負(fù)相關(guān)?;衔镏g主成分得分有重疊,表明其含量具有相似特征。

      圖3 米酒主成分分析Fig.3 Principal components analysis of rice wine

      基于PC1和PC2計(jì)算得到每個(gè)菌株酒樣樣本分?jǐn)?shù),F(xiàn)AC1和FAC2,分別對(duì)應(yīng)圖B中x和y軸,該圖顯示5株樣品在坐標(biāo)系中差異,樣品相距越遠(yuǎn)其差異值越大。

      綜合上述研究,菌株NO.26發(fā)酵速度快,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成較優(yōu),感官評(píng)價(jià)酒體協(xié)調(diào),香氣馥郁,且?guī)в忻拙泼紫闩c清香,具有純種發(fā)酵優(yōu)質(zhì)米酒的潛力。

      2.3 菌株鑒定

      初步篩選獲得優(yōu)選菌株NO.26,提取菌體DNA后,采用BLAST方式將測(cè)定的18S rDNA序列與GenBank中序列作比對(duì),生成系統(tǒng)發(fā)育樹。所有篩選菌株與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1 171模式菌株形成一個(gè)簇,表明篩選菌株為釀酒酵母,結(jié)果如圖4所示。

      圖4 基于18S r DNA測(cè)序所構(gòu)建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeast based on 18S r DNA sequencing

      3 討論與結(jié)論

      優(yōu)質(zhì)酵母菌株對(duì)于釀造酒發(fā)酵至關(guān)重要,對(duì)口感和風(fēng)味均影響極大[30]。目前,對(duì)于米酒或黃酒酵母篩選多基于傳統(tǒng)釀造工藝,選育具有低產(chǎn)尿素[31]、低產(chǎn)高級(jí)醇[32]、高產(chǎn)β-苯乙醇[33]等菌株,對(duì)于篩選適用于純種液態(tài)米酒發(fā)酵的酵母菌株研究較少。純種釀酒酵母分離和應(yīng)用,有利于米酒釀造向現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)一步邁進(jìn)[3]。王瑩鈺使用6種黃酒酵母發(fā)酵液化法糜子黃酒,不同菌株之間發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成等存在顯著差異[34]。鄒凌波建立一種酶制劑完全替代酒曲液態(tài)米酒釀造工藝,并從酒曲和酒醪中篩選得到1株發(fā)酵能力較優(yōu)釀酒酵母,但并未根據(jù)其風(fēng)味特性和感官品評(píng)進(jìn)一步分析篩選[12]。

      本試驗(yàn)以米酒酒曲和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株為篩選源,基于菌株產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)酒精試驗(yàn),發(fā)酵性能試驗(yàn)和揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析,篩選獲得優(yōu)良釀酒酵母菌株NO.26。該菌株在糖度16%糯米糖液中,25℃發(fā)酵10 d可產(chǎn)生酒精度為7.19%V/V米酒,發(fā)酵速率快,產(chǎn)酒精能力強(qiáng)。使用該菌株發(fā)酵所得米酒中多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物如苯乙醇、芳樟醇、十六酸乙酯等均優(yōu)于其他菌株或處于較高水平,釀造米酒具有發(fā)酵米酒典型米香和清香,口感清爽鮮甜,感官品評(píng)結(jié)果優(yōu)于其他菌株。

      目前,適用于米酒發(fā)酵的菌株多樣性不足,嚴(yán)重限制米酒風(fēng)格豐富性。研究對(duì)酵母菌株發(fā)酵特性提供系統(tǒng)的選育方法,并篩選得到具有優(yōu)良釀造品質(zhì)的釀酒酵母,對(duì)于未來開發(fā)純種液態(tài)法米酒產(chǎn)品具有較強(qiáng)工業(yè)應(yīng)用參考。

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