鹽堿脅迫對中華絨鰲蟹毒性作用研究

楊雨虹，李明帥,，羅 亮，王世會，張 瑞，郭 坤，劉金雨,3，李海濤,3，趙志剛*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質資源及增養(yǎng)殖重點開放實驗室，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 200090）

我國鹽堿水資源豐富，但卻不能為人畜飲用，也無法直接運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。通過漁業(yè)手段有效開發(fā)和利用鹽堿水域資源，對拓展水產(chǎn)養(yǎng)殖空間、保障水產(chǎn)品供給、實現(xiàn)鹽堿環(huán)境生態(tài)修復具有重要意義[1]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將鹽堿水養(yǎng)殖作為十大模式之一，列入《2020年水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖模式示范行動方案》[2]。鹽度和堿度作為鹽堿水養(yǎng)殖過程中重要水質參數(shù)，顯著影響水產(chǎn)動物生長發(fā)育、生理代謝、組織功能等方面[2-3]。水生動物鹽堿耐受性是遺傳因素和環(huán)境長期共同作用結果。開展水生動物鹽堿耐受能力研究，對揭示其耐鹽堿機制、開發(fā)耐鹽堿水產(chǎn)養(yǎng)殖品種具有重要意義。目前，研究人員對鯽（Carassius auratus）[4]、羅氏沼蝦（Macrobrochium rosenbergii）[5]、凡 納 濱 對 蝦（Litopenaeus vannamei）[6]、大鱗鲃（Barbus capito）[7]等養(yǎng)殖品種鹽堿耐受能力開展相關研究。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）屬十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、絨螯蟹屬，俗稱河蟹，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，是我國重要經(jīng)濟水產(chǎn)動物。自然條件下，中華絨螯蟹生活史較為復雜，幼蟹和成體主要生長在淡水中，而親本繁殖行為及幼體發(fā)育均需在半咸水中完成[8]。研究表明，鹽度變化可顯著影響中華絨螯蟹攝食生長、性腺發(fā)育、繁殖行為、組織生理、能量代謝、機體免疫等[9-11]。目前，關于堿度及鹽堿交互脅迫對中華絨螯蟹相關方面研究極少。本研究通過測定中華絨螯蟹對氯化鈉鹽度、碳酸氫鈉堿度以及鹽堿交互作用耐受能力，探究中華絨螯蟹對鹽堿水域環(huán)境生理耐受性，為中華絨螯蟹鹽堿水養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蟹為中華絨螯蟹，來自遼寧盤錦。挑選體質健壯、規(guī)格整齊、附肢完整幼蟹用于試驗，平均體質量為（8.33±1.76）g，平均體寬為（25.6±2.1）mm，平均體長為（24.7±1.8）mm。試驗開始前在玻璃水箱中暫養(yǎng)15 d，暫養(yǎng)期間每日定量投喂，持續(xù)充氧，每日換水1/3。試驗開始前停飼24 h。

1.2 試驗用水配制方法

試驗用水為充分曝氣的自來水，每個試驗處理用水均為10 L。鹽度和堿度分別采用分析純氯化鈉（NaCl）和碳酸氫鈉（NaHCO3）配制。配制時將氯化鈉和碳酸氫鈉按所需量準確稱量加入自來水中，試劑溶解后充分混勻，靜置穩(wěn)定24 h后測定，水體鹽度通過鹽度計測定，堿度采用鹽酸甲基橙標定法測定。

1.3 方法

正式試驗前預試驗，獲得中華絨螯蟹24 h全部死亡最低鹽堿濃度和96 h全部存活最高鹽堿濃度。鹽、堿單一因素試驗根據(jù)預試驗結果采用等對數(shù)間距法均設置6個濃度梯度組及1個對照組，鹽度梯度分別為20.00、22.97、26.38、30.32、34.81和40.00 g·L-1；堿度梯度分別為60、72、87、104、125和150 mmol·L-1，鹽堿交互雙因素試驗濃度采用單獨作用試驗時前5個水平質量濃度50%，然后按照等水平均勻設計表要求設計5個質量濃度梯度。每個濃度梯度設3個平行組，每組10只中華絨螯蟹。試驗期間水溫保持（21.9±0.2）℃，持續(xù)充氧，每日換水1/3。試驗開始后記錄24、48、72和96 h蟹成活數(shù)和活動情況，試驗過程中死蟹及時撈出。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0作分析。鹽、堿單獨作用半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間采用寇氏法（Karber氏法）計算，計算公式如下：

式中，Xm為最高濃度對數(shù)；d為濃度對數(shù)差；Pi為死亡率；n為試驗動物數(shù)；SD為標準差。

安全濃度SC參照陳小紅等方法[12]計算：

鹽堿交互雙因素試驗中將鹽度和堿度濃度轉換為水中所含溶質質量分數(shù)，試驗結果運用SPSS 19.0作二項式回歸分析[13]。

2 結果與分析

2.1 鹽度對中華絨螯蟹的毒性作用

對照組中，中華絨螯蟹行為正常，但在鹽度脅迫濃度組中，試驗蟹反應較強烈，40 g·L-1處理組中毒反應強烈，短時間內出現(xiàn)躁動不安，游動速度加快等中毒現(xiàn)象。隨脅迫時間增加，蟹游動遲緩，出現(xiàn)部分附肢脫落現(xiàn)象，個別蟹出現(xiàn)腹部上翻，身體僵直。26.38、30.32和34.81 g·L-1處理組蟹出現(xiàn)中毒反應時間稍晚，隨脅迫時間增加，試驗蟹也開始出現(xiàn)反應遲鈍、抱團、少數(shù)附肢脫落、腹部上翻等中毒現(xiàn)象。20.00和22.97 g·L-1處理組蟹均未表現(xiàn)中毒反應。隨鹽度增加，不同處理時間中華絨螯蟹死亡率逐漸升高（見表1）。經(jīng)計算，鹽度對中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時半致死濃度分別為35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全濃度為8.54 g·L-1。

表1 鹽度對中華絨螯蟹毒性試驗結果Table 1 Toxicity test results of salinity to Chinese mitten crab

2.2 堿度對中華絨螯蟹的毒性作用

在堿度脅迫條件下，蟹的行為反應與鹽度脅迫一致，但整體出現(xiàn)中毒反應時間較晚。150 mmol·L-1處理組試驗蟹在脅迫初期表現(xiàn)亂游現(xiàn)象，隨脅迫時間增加，蟹體逐漸出現(xiàn)行動遲緩、抱團及附肢脫落現(xiàn)象。60和72 mmol·L-1處理組蟹在暴露初期均未出現(xiàn)異常，24 h后，個別個體開始逐漸出現(xiàn)游動變緩、反應遲鈍、死亡等中毒癥狀。經(jīng)計算，堿度對中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時半致死濃度分別為110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全濃度為18.25 mmol·L-1（見表2）。

2.3 鹽堿交互對中華絨螯蟹的毒性作用

在鹽堿交互作用條件下，隨鹽堿濃度升高，蟹中毒現(xiàn)象明顯，主要表現(xiàn)為短時間內急速游動，隨鹽堿暴露時間增加，行動逐漸遲緩，直至大部分蟹體靜臥于試驗缸底，部分蟹體出現(xiàn)附肢脫落。鹽堿對中華絨螯蟹的交互作用結果見表3，中華絨螯蟹死亡率隨溶液中鹽度、堿度升高和暴露時間增加而升高。在堿度為62.5 mmol·L-1、鹽度為17.41 g·L-1時96 h中華絨螯蟹死亡率達100%。根據(jù)武鵬飛等[13]試驗方法分析數(shù)據(jù)獲得脅迫24、48、72和96 h時中華絨螯蟹死亡率與鹽堿關系擬合較好（R2＞0.95，P＜0.05）回歸模型：

表3 鹽堿聯(lián)合對中華絨螯蟹的毒性試驗結果Table 3 Toxicity test results of salt-alkali combination to Chinese mitten crab

式中，x1和x2分別代表鹽度和堿度，y1、y2、y3、y4分別代表24、48、72和96 h死亡率，由回歸模型分析得出：在所有回歸模型中，鹽度對死亡率表現(xiàn)為一元一次方程，而堿度對死亡率表現(xiàn)為一元二次方程。試驗期間，鹽度和堿度交互項系數(shù)均為正值，鹽度和堿度對蟹死亡率表現(xiàn)為協(xié)同作用，表明鹽堿交互條件下毒性作用強于單一鹽度或堿度，在48～96 h協(xié)同系數(shù)逐漸增大，表明鹽度和堿度協(xié)同作用在96 h表現(xiàn)最強，48 h表現(xiàn)最弱。

表2 堿度對中華絨螯蟹毒性試驗結果Table 2 Toxicity test results of alkalinity to Chinese mitten crab

3 討論

3.1 中華絨螯蟹對鹽度的耐受性

水體鹽度在一定程度上直接影響水生動物生長和發(fā)育[14]。一般情況下，水生動物主要通過滲透壓調節(jié)適應環(huán)境水體鹽度變化[15]。在鹽度脅迫條件下，水生動物主要通過增加鰓中泌氯細胞數(shù)量和Na+-K+-ATP酶活性調節(jié)細胞內離子跨膜轉運及物質能量代謝，從而調節(jié)體內外滲透壓動態(tài)平衡[16]。不同水生動物在鹽度脅迫下表現(xiàn)的滲透壓調節(jié)能力不同，具體為其鹽度半致死濃度和安全濃度存在差異。本研究中，通過對比分析半致死濃度和安全濃度表明，中華絨螯蟹對鹽度耐受能力不僅高于鯉（Cyprinus carpio）[17]、彭澤鯽（Carassius auratusPengze）[18]等普通經(jīng)濟淡水魚類，也高于凡納濱對蝦[6]、大鱗鲃[7]等耐鹽堿水產(chǎn)動物，但其鹽度耐受能力低于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[19]。中華絨螯蟹作為廣鹽性高滲透調節(jié)物種在其繁殖期和幼體發(fā)育期需在淡、海水交界處完成[8]，此時中華絨螯蟹對鹽度具有較強滲透壓調節(jié)能力。隨鹽度進一步升高，水體環(huán)境中滲透壓和離子濃度高于血漿時，中華絨螯蟹必須通過大量攝入高鹽水維持自身血漿滲透壓，當機體無法在短時間內完成“保水排鹽”滲透調節(jié)時，機體內大量鹽分無法及時排出[20]，此時蟹體滲透壓平衡遭到破壞，機體代謝功能失調，當機體出現(xiàn)不可逆轉的組織損傷時，機體開始死亡。

3.2 中華絨螯蟹對堿度的耐受性

堿度作為鹽堿水域重要理化因子，對維持養(yǎng)殖水體pH及離子穩(wěn)態(tài)具有重要意義[21-22]。研究表明，堿性環(huán)境造成水生動物鰓組織損傷，改變其能量代謝方式，并可能影響其正常脫殼和生長[23-25]。中華絨螯蟹在堿性脅迫時也呈現(xiàn)相似生理反應[26-28]。雷衍之等認為碳酸鹽堿度對魚體的影響是通過堿度與pH協(xié)同作用的結果[29]。在碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境中，隨碳酸鹽堿度升高，水體中pH與HCO3-含量也隨之升高，這些離子直接作用于水生動物鰓表面上皮細胞，導致其鰓上皮分離或破裂，氯細胞增生或肥大，從而影響細胞表面離子交換體系，同時，HCO3-也可通過影響血液中二氧化碳平衡系統(tǒng)，從而對水生動物產(chǎn)生危害[29]。魚類由淡水進入堿性水體中，魚體組織結構發(fā)生適應性改變，但這種改變無法超過魚體耐受極限。雷衍之等在碳酸鹽堿度對魚類毒性作用的研究中提出，10 mmol·L-1堿度可作為常見淡水魚養(yǎng)殖用水危險指標[29]。本試驗結果表明，中華絨螯蟹堿度安全濃度為18.25 mmol·L-1，明顯高于此數(shù)值。比對分析表明，中華絨螯蟹堿度半致死濃度高于澎澤鯽[18]、淡水白鯧（Colos soma brachypomum）[30]等高耐堿魚類，且其安全濃度也明顯高于凡納濱對蝦[6]、羅氏沼蝦[5]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[31]等水產(chǎn)動物。以上結果表明，中華絨螯蟹對碳酸鹽堿度具有較強耐受性。

3.3 中華絨螯蟹對鹽堿聯(lián)合的耐受性

本試驗探究中華絨螯蟹對鹽堿聯(lián)合毒性耐受能力，結果表明，鹽度和堿度對中華絨螯蟹聯(lián)合毒性作用在96 h內全部表現(xiàn)為協(xié)同作用，62.5 mmol·L-1碳酸鹽堿度和17.41 g·L-1鹽度聯(lián)合毒性作用使中華絨螯蟹在96 h內全部死亡。王桂春在鹽度和堿度對中華絨螯蟹毒性作用的研究表明中華絨螯蟹在21.02 mmol·L-1碳酸鹽堿度和8 g·L-1鹽度聯(lián)合脅迫96 h時全部死亡，其測定結果低于本試驗，這可能與中華絨螯蟹品種、規(guī)格及試驗環(huán)境條件不同有關[32]。另外，與其他水生動物相比，中華絨螯蟹在96 h內全部死亡的鹽堿濃度高于羅氏沼蝦[5]，略低于達里湖高原鰍[4]和克氏原鰲蝦[33]。此外，鹽堿聯(lián)合作用于不同水生生物表現(xiàn)出不同聯(lián)合效應。例如，鹽堿聯(lián)合對泥鰍[31]、克氏原螯蝦[23]、達里湖鯽（Carassius auratus）[33]等毒性作用表現(xiàn)為拮抗作用，即鹽堿聯(lián)合作用毒性比鹽度和堿度單獨作用毒性總和弱；而對澎澤鯽[18]和淡水白鯧[30]表現(xiàn)為協(xié)同作用。

鹽堿水對水生生物的影響是水體pH、鹽度、堿度等多種因素綜合作用結果，水體Cl-和HCO3-是其中最主要影響因素[2]。目前僅見鹽堿聯(lián)合毒性對魚類影響的相關報道。趙麗慧等研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚主要通過離子轉運與滲透壓調節(jié)過程響應鹽堿脅迫，鰓組織中Na+-K+-ATP酶和碳酸酐酶則作為重要轉運酶參與上述過程[34]；梁從飛等也探究鹽堿交互作用對尼羅羅非魚的影響，并認為鹽堿混合條件下不同離子間存在協(xié)同作用[35]。參考上述魚類相關研究結果，提出中華絨螯蟹被鹽、堿脅迫激活的不同調節(jié)機制，并隨時間增加機體耗能持續(xù)增加，最終導致能量不足，使鹽堿脅迫對中華絨螯蟹的毒性作用加劇，這可能是鹽堿聯(lián)合毒性對中華絨螯蟹表現(xiàn)為協(xié)同作用的主要原因之一。目前，關于堿度及鹽堿聯(lián)合對中華絨螯蟹脅迫的研究較少，本文為后續(xù)中華絨螯蟹對鹽度、堿度以及鹽堿交互脅迫的響應機制等方面提供基礎資料。

4 結論

本文開展中華絨螯蟹對鹽度、堿度及鹽堿交互耐受能力研究。結果表明，中華絨螯蟹在24、48、72和96 h時氯化鈉（NaCl）鹽度半致死濃度（LC50）分別為35.24、32.81、31.25和26.55 g·L-1，安全濃度為8.54 g·L-1；在24、48、72和96 h的碳酸氫鈉（NaHCO3）堿度半致死濃度（LC50）分別為110.43、90.50、75.78和69.74 mmol·L-1，安全濃度為18.25 mmol·L-1。鹽堿交互作用對中華絨螯蟹的毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。中華絨螯蟹對碳酸鹽型鹽堿水環(huán)境具有較強耐受性，適宜在鹽度低于8.54 g·L-1或碳酸鹽堿度低于18.25 mmol·L-1鹽堿水域開展增養(yǎng)殖。