固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂膠中氯霉素殘留

王玉涵，王欣然，陸超麗，吳殿軍，周金慧，3，4*，李熠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.昭平縣農(nóng)村社會事業(yè)促進(jìn)站，廣西 賀州 546800；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

蜂膠，是蜜蜂采集膠源植物（楊樹、樺樹、桉樹、酒神菊類植物、血桐屬植物、黃檀屬植物）樹脂等分泌物后與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)，被蜜蜂用來修補(bǔ)蜂箱的縫隙、加固以及清潔蜂巢[1-2]。蜂膠組成復(fù)雜，主要包括樹脂（55%）、蜂蠟（30%）、揮發(fā)性油（10%）以及蜂花粉（5%）等組分，已知成分達(dá)420余種，其中包含多達(dá)70余種的黃酮化合物以及其他活性物質(zhì)，豐富的活性成分賦予了蜂膠抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等生物活性，使其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力和預(yù)防疾病等功效[3-5]。蜜蜂在生存環(huán)境條件惡劣以及自身免疫力較低時，容易受到病菌的侵害，導(dǎo)致蜂群感染歐洲幼蟲腐臭病等細(xì)菌性疾病，蜂農(nóng)常用抗菌性藥物來防治這類蜜蜂疾病，其中包括具有廣譜抗菌性且價格低廉的氯霉素[6]。然而藥物的不規(guī)范使用會導(dǎo)致藥物在蜂群中殘留進(jìn)而污染蜂產(chǎn)品。已有相關(guān)研究表明氯霉素可導(dǎo)致再生障礙性貧血和灰嬰綜合征[7]，但目前尚無明確的劑量-效應(yīng)作用[8]。目前很多國家已禁止在食用性動物中使用氯霉素藥物，許多國家均規(guī)定氯霉素在動物源性食品中不得檢出[9-11]。然而蜂膠中氯霉素殘留檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，為保障蜂膠產(chǎn)品的質(zhì)量安全，需建立對蜂膠中氯霉素藥物殘留可靠有效的檢測方法。

目前為止，畜禽肉類、水產(chǎn)品、牛奶以及蜂蜜[8，12-14]等食品中氯霉素殘留檢測方法已多見報道，氯霉素的檢測手段主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[15]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[16]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[17]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）[18]，還包括酶生物傳感器[19]和鎢酸鋅納米電化學(xué)傳感器[20]等新型檢測方法。其中HPLC-MS/MS具有高靈敏度和穩(wěn)定性，常與液-液萃取[21]和基體分散固相萃?。╩atrix solid-phase dispersion，MSPD）[14]等技術(shù)相結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于食品中藥物殘留檢測，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量[22]。目前，對蜂膠中氯霉素提取多采用液-液萃取法，使用大量的對環(huán)境和人體健康不利的有機(jī)試劑如乙酸鉛、甲基叔丁基醚、正己烷等[5，18，21，23]。此外，此類研究定量線性范圍有限，未涵蓋50 μg/L以上的較高濃度范圍。因此，建立一種快捷、高效、綠色環(huán)保，同時可實(shí)現(xiàn)蜂膠中不同濃度氯霉素殘留的準(zhǔn)確定量的檢測方法是十分必要的。

本研究通過HPLC-MS/MS法進(jìn)行定性、定量分析測定蜂膠中氯霉素藥物殘留。考察不同提取溶劑、固相萃取柱等因素對蜂膠中殘留氯霉素的提取、凈化效率的影響。并對色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到分析目標(biāo)物所需的靈敏度和穩(wěn)定性。因此本研究可為監(jiān)控蜂膠質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠樣品：市售；氯霉素（純度98%）、氯霉素-D5（純度98%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；氯化鈉、氫氧化鈣（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Bond Elut Plexa 固相萃取柱（200 mg，6 mL）：美國 Agilent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 HPLC高效液相色譜儀、6495三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離源）：美國Agilent公司；G560E渦動儀：美國Scientific Industries公司；1-15PK離心機(jī)：美國Sigma有限公司；Milli-Q純水發(fā)生器：美國Millipore公司；BSA124S電子天平：德國賽多利斯有限公司；Kinetex C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）：美國 Phenomenex公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃棕色瓶中避光保存；用乙腈將氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液；將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋制備濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為 50 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備

在溫度高于25℃的條件下，蜂膠呈黏性膠質(zhì)狀態(tài)，將樣品置于-20℃條件下冷凍2 h，取出冷凍樣品立即用粉碎機(jī)制備蜂膠均勻粉末。

1.4.2 提取

稱取蜂膠粉末0.25 g于50 mL離心管中，加入25 μL濃度為100 ng/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻。加入5 mL乙腈，渦旋至蜂膠完全溶解，加入5 mL 0.5%Ca（OH）2溶液，渦旋混勻，再加入 1 g NaCl，漩渦振蕩2 min，于4℃下8 000 r/min離心10 min，取出上層清液，在40℃下氮吹至近干，加入10 mL 10%甲醇復(fù)溶，4℃下8 000 r/min離心10 min，保留上層清液，下層沉淀中加入10 mL 10%甲醇溶解，重復(fù)提取一次，將兩次上清液合并，待固相萃取柱凈化。

1.4.3 凈化

Bond Elut Plexa固相萃取柱（6 mL，200 mg）使用前依次用10 mL甲醇和10 mL水活化，將1.4.2節(jié)中上清液轉(zhuǎn)移至已活化的Bond Elut Plexa固相萃取柱中，調(diào)節(jié)流速以≤3 mL/min通過固相萃取柱。待上清液完全流出后，10 mL水淋洗，棄去流出液，負(fù)壓抽干。10 mL甲醇洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中，于40℃下氮吹至近干，1 mL 10%乙腈水復(fù)溶，4℃下14 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜條件

流動相 A：水；流動相 B：乙腈。梯度洗脫：0～2 min，10%B；2 min～4 min，30%B；4 min～4.1 min，75%B；4.1 min～5.1 min，100%B；5.1 min～6.5 min 10%B。流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）；負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：2 500 V；干燥氣溫度：270℃；干燥氣流速：11L/min；霧化器壓力：275.8kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：0 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件

氯霉素在負(fù)離子模式下可獲得穩(wěn)定的分子離子[M-H]-。本試驗(yàn)中分別將1.0 mg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.0 mg/L的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源，在負(fù)離子（ESI-）全掃描模式下獲得氯霉素和氯霉素-D5的分子離子[M-H]-。然后在碎片離子掃描模式下得到氯霉素和氯霉素-D5的子離子信息。最后通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式對各子離子碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，獲得氯霉素和氯霉素-D5的最佳質(zhì)譜參數(shù)，質(zhì)譜選擇離子參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜選擇離子參數(shù)Table 1 Transitions and optimal conditions used for MS/MS analysis

2.2 色譜條件確定

本研究考察了甲醇/水和乙腈/水兩種不同的流動相體系，由于乙腈的極性比甲醇弱，它更能有效地洗脫弱極性的氯霉素，縮短氯霉素在色譜柱中的保留時間，同時在乙腈/水體系中干擾峰少，且氯霉素獲得了較高的質(zhì)譜響應(yīng)。通過調(diào)整流動相洗脫比例，可使目標(biāo)分析物盡可能遠(yuǎn)離雜質(zhì)干擾峰產(chǎn)生的離子抑制區(qū)域，以降低基質(zhì)影響并提高目標(biāo)分析物的質(zhì)譜響應(yīng)[24-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈比例快速增加時，可縮短目標(biāo)分析物的保留時間并獲得更高的信號響應(yīng)。色譜柱的溫度也會影響分析時間和目標(biāo)物的分離效果，為了在合適的分析時間內(nèi)完成目標(biāo)物的有效分離，對不同柱溫（30、35、40℃）進(jìn)行了測試和比較。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物在柱溫為40℃時分離效果最佳。因此，本研究中采用乙腈/水作為流動相，40℃柱溫，經(jīng)優(yōu)化的色譜柱流動相梯度洗脫，在6.5 min（含清洗和平衡時間）的分離時間內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離并獲得較高的質(zhì)譜響應(yīng)。

經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜和液相色譜條件下空白蜂膠基質(zhì)、加標(biāo)基質(zhì)（2.0 μg/kg）以及氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μg/L）的MRM色譜圖見圖1。

圖1 MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取條件優(yōu)化

氯霉素的油水分配系數(shù)對數(shù)值為1.02，是偏親脂性物質(zhì)，可溶于有機(jī)溶劑，微溶于水。本研究中考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈以及甲苯/水溶液對蜂膠中氯霉素的提取效果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑提取蜂膠中氯霉素的絕對回收率Fig.2 Absolute recoveries of chloramphenicol inpropolis using different extraction solutions

由圖2可知，乙酸乙酯作提取劑時氯霉素的絕對回收率最高，但乙酸乙酯作提取溶劑時提取溶液渾濁，由于蜂膠中含有較多的脂溶性成分，因此在乙酸乙酯共同提取物中存在了較多脂溶性雜質(zhì)（樹脂、蜂蠟以及黃酮類化合物[26]，這些共同提取物產(chǎn)生的雜質(zhì)干擾峰影響目標(biāo)物在質(zhì)譜中的響應(yīng)，不利于后續(xù)的分析測定。以甲醇∶水（體積比3∶7）作提取劑時，氯霉素絕對回收率為38%；當(dāng)乙腈作為提取劑時，絕對回收率為59%，乙腈提取物相比于乙酸乙酯提取物澄清，且乙腈提取物的色譜圖中雜質(zhì)峰與目標(biāo)分析物分離度高，基質(zhì)干擾較小，利于低濃度目標(biāo)物的篩查測定。當(dāng)甲苯/水體系作為提取劑時，由于蜂膠可溶于甲苯，而氯霉素不溶于甲苯但可微溶于水，使得蜂膠基質(zhì)中的脂溶性物質(zhì)萃取到甲苯層而氯霉素萃取到水層，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)氯霉素與蜂膠基質(zhì)中親脂性雜質(zhì)干擾物的分離。同時，不同比例的甲苯/水體系可導(dǎo)致提取效果有所差異，本研究測試了不同比例的甲苯∶水（體積比 7∶3、6∶4、5∶5、4∶6）的提取效果，其中甲苯∶水體積比為 6∶4 時可獲得較高的絕對回收率（51.68%）；甲苯∶水體積比 5∶5、4∶6時絕對回收率均近似為45%；甲苯∶水體積比為7∶3時，甲苯/水的萃取回收率最低，僅為41.57%。同時發(fā)現(xiàn)隨著甲苯比例的增加，萃取過程發(fā)生了乳化，因此過高的甲苯比例不利于目標(biāo)分析物的萃取分離。由以上結(jié)果表明，乙腈和甲苯∶水（體積比6∶4）作為提取溶劑時氯霉素的絕對回收率較高，同時共同提取物干擾少，有利于后續(xù)分析測定。由于甲苯的毒性較大且使用時危險性較高，因此，最終選用乙腈作為提取劑。

為除去乙腈提取物中的雜質(zhì)干擾，需對提取物進(jìn)行除雜處理。本研究中分別測試了不同濃度的堿性溶液[Ca（OH）2溶液、NaOH 溶液]、酸性溶液（三氯乙酸）以及酸堿復(fù)合溶液的除雜效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同除雜溶液作用下蜂膠中氯霉素絕對回收率Fig.3 Absolute recoveries of chloramphenicol inpropolis using different solutions to remove impurities

由圖3可知，采用1%NaOH溶液聯(lián)合5%三氯乙酸除雜所獲得絕對回收率最差（3%），由于黃酮類化合物可溶于堿性溶液，同時在酸性溶液中沉淀析出[27]，在乙腈提取物中先后加入1%NaOH溶液和5%三氯乙酸溶液，出現(xiàn)了大量懸浮的絮狀物，由于絮狀物可能包裹目標(biāo)分析物導(dǎo)致回收率變差；5%三氯乙酸除雜所獲得絕對回收率為20%，由于氯霉素在酸性環(huán)境中易形成離子態(tài)，使得目標(biāo)分析物的極性增大，難以被有機(jī)溶劑提??；1%NaOH溶液絕對回收率（58%）與0.5%Ca（OH）2溶液接近，當(dāng)NaOH溶液與乙腈提取物混合時，同樣出現(xiàn)明顯絮凝現(xiàn)象，同時絮凝物與液體分層不明顯。濃度為0.5%的Ca（OH）2溶液絕對回收率最高（66.8%），且絮凝物在靜置3 min后可聚集并下沉到下層。本研究結(jié)果與楊黎等[28]的研究結(jié)果一致，0.5%Ca（OH）2溶液可用于去除乙腈蜂膠提取物中的親脂性物質(zhì)。

為促進(jìn)液液萃取時雜質(zhì)萃取層與目標(biāo)分析物萃取層的分離，參考Koltsakidou等[29]的研究，在乙腈提取物與0.5%Ca（OH）2溶液混合體系中加入NaCl以促進(jìn)兩相分層。最后，在固相萃取柱凈化前，需將樣品溶液的溶劑體系轉(zhuǎn)化為高比例水相體系，由于10%甲醇可以溶解氯霉素，同時不會破壞固相萃取柱的填料結(jié)構(gòu)，因此，本研究采用10%甲醇對氮吹后的濃縮提取物進(jìn)行復(fù)溶。

2.3.2 固相萃取小柱的選擇及凈化條件優(yōu)化

經(jīng)純化的乙腈提取物呈淡黃色，表明其中黃酮類化合物未被完全除去。為進(jìn)一步凈化和保留富集乙腈提取物中的氯霉素，本研究比較了混合型陽離子交換固相萃取柱（PCX）、親水親脂型反相固相萃取柱（Oasis HLB）以及非極性保留固相萃取柱（Bond Elut Plexa）的凈化效果。PCX和Oasis HLB固相萃取柱對添加氯霉素濃度水平為40 μg/kg的蜂膠基質(zhì)進(jìn)行富集凈化，Bond Elut Plexa對添加氯霉素濃度水平為4 μg/kg的蜂膠基質(zhì)進(jìn)行富集凈化，添加氯霉素的蜂膠基質(zhì)經(jīng)不同固相萃取柱凈化后獲得MRM色譜圖如圖4所示。

圖4 不同固相萃取柱凈化蜂膠中氯霉素的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of residual chloramphenicol in propolis under different solid-phase extraction cartridges

由圖4可知，Oasis HLB柱相比于PCX柱，其對目標(biāo)物的凈化效果更好，可獲得較高的目標(biāo)物質(zhì)譜信號響應(yīng)，但其對添加濃度水平為4 μg/kg的提取物的凈化富集效果不佳。為凈化低添加濃度水平的提取物，本研究中考察了Bond Elut Plexa柱的凈化能力，由于Bond Elut Plexa柱是以表面含羥基配體的親水苯乙烯-二乙烯苯聚合物為填料[30]，因此，能夠保留具有羥基結(jié)構(gòu)的氯霉素同時還能去除脂類雜質(zhì)。由圖4中Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化加標(biāo)提取物中氯霉素的MRM色譜圖可知，Bond Elut Plexa對基質(zhì)凈化效果明顯，降低了雜質(zhì)干擾并獲得了較高的信號響應(yīng)。在整個提取、除雜以及凈化過程中都使用了與氯霉素結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的同位素內(nèi)標(biāo)物氯霉素-D5，以校正分析物在前處理過程中的質(zhì)量損失，在最佳提取和凈化條件下，獲得了90%以上的相對回收率。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 方法線性關(guān)系

用乙腈溶劑配制濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/L，內(nèi)標(biāo)物氯霉素-D5 濃度均為2.5 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化后的質(zhì)譜和色譜條件下進(jìn)行測定。以所對應(yīng)的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），各濃度下氯霉素色譜峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y），外標(biāo)法線性回歸方程為Y=31 177X+105 316（R2=0.998 5）；以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），各濃度下氯霉素色譜峰面積與氯霉素-D5色譜峰面積比值的平均值為縱坐標(biāo)（Y），內(nèi)標(biāo)法的線性回歸方程為 Y=0.413 2X-1.237 9（R2=0.999 2）。綜上，采用同位素內(nèi)標(biāo)校正，線性相關(guān)系數(shù)和回收率均優(yōu)于外標(biāo)法，因此，本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量，氯霉素在0.1 μg/L～500.0 μg/L濃度范圍內(nèi)，其濃度與對應(yīng)的其定量離子峰面積比值呈良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，滿足殘留分析的要求。

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)評價

由于基質(zhì)中存在共提取物，會增強(qiáng)或抑制待測目標(biāo)物的信號響應(yīng)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。為對目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，需對樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估。由1.4節(jié)前處理操作制備得到含內(nèi)標(biāo)物的空白基質(zhì)液，在0.1 μg/L～500.0 μg/L濃度范圍內(nèi)配制與上述含內(nèi)標(biāo)物的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度相同的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，并計算出含內(nèi)標(biāo)物的樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=733.36X+2 166.8（R2=0.999 0）。基質(zhì)效應(yīng)計算公式為B/A×100（A為含內(nèi)標(biāo)物的溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率；B為含內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率），當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%到120%之間被認(rèn)為是可被接受的低基質(zhì)效應(yīng)，小于80%被認(rèn)為存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；大于120%被判定為存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[31]。結(jié)果表明，經(jīng)內(nèi)標(biāo)物校正的基質(zhì)效應(yīng)為85.16%，基質(zhì)抑制效應(yīng)低于20%，因此本試驗(yàn)中可采用含內(nèi)標(biāo)物的溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液進(jìn)行定量分析。

2.4.3 方法檢出限

按2.4.2方法得到含內(nèi)標(biāo)物的空白基質(zhì)液，添加系列濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測定分析，根據(jù)6個空白樣品中基線噪音的平均值，以3倍信噪比（S/N=3）計算得到該方法檢測限；以10倍信噪比（S/N=10）計算得到該方法定量限。經(jīng)測定本方法檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別為 0.4 μg/kg 和 1 μg/kg。

2.4.4 方法加標(biāo)回收率和精密度

在含內(nèi)標(biāo)物的空白蜂膠樣品中分別添加1、2、10 μg/kg 3個同濃度水平，每個水平設(shè)5個平行，設(shè)置一組空白對照。計算得到回收率及精密度，測定結(jié)果見表2。

表2 方法回收率、精密度、檢測限和定量限（n=5）Table 2 Recovery，precision，LOD and LOQ of CAP in blank propolis samples（n=5）

蜂膠樣品中氯霉素在3個添加濃度的回收率在93.25%～103.41%之間。日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.98%～3.95%；日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.93%～5.37%。由回收率和精密度可見，該方法準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好，可滿足殘留檢測的要求。

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本文所建立的方法測定2019年不同蜂場、蜂產(chǎn)品公司和超市的26份蜂膠樣品。測定結(jié)果顯示，15.38%的蜂膠樣品檢出氯霉素，其濃度在1.06 μg/kg～130.62 μg/kg之間。表明目前我國養(yǎng)蜂業(yè)中存在違規(guī)使用氯霉素的情況，因此，需加強(qiáng)對養(yǎng)蜂業(yè)中氯霉素藥物的監(jiān)督管理。

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂膠中氯霉素殘留的定性篩查與定量分析方法。經(jīng)優(yōu)化的前處理方法便捷、高效，經(jīng)乙腈提取，經(jīng)Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化蜂膠基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)蜂膠中氯霉素殘留物的有效提取與富集凈化。該方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均經(jīng)過方法學(xué)評價，滿足殘留檢測的要求，本方法可用于準(zhǔn)確檢測蜂膠中氯霉素殘留水平。