植物源防腐劑的制備及抑菌機(jī)理研究

張梅，李曉君，*，成悅，張志軍，渠志燦

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030051；2.山西納安生物科技股份有限公司，山西 太原 030006）

防腐劑是指以抑制微生物生長和繁殖為目的而加入產(chǎn)品的一種（類）物質(zhì)，是產(chǎn)品設(shè)計(jì)中重要的添加劑，不僅可以保障產(chǎn)品在生產(chǎn)和貨架期的穩(wěn)定，同時(shí)可有效防止二次污染。傳統(tǒng)的化學(xué)合成防腐劑種類繁多[1]，部分防腐劑在應(yīng)用過程存在許多問題，如食品防腐劑超標(biāo)會(huì)引發(fā)致病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，部分化妝品防腐劑會(huì)引發(fā)皮膚過敏等不良反應(yīng)[2]，同時(shí)近年來大眾越來越追求純天然、綠色產(chǎn)品，越來越多的企業(yè)開始尋求新的安全無害的防腐替代方案。

植物提取物（以下簡稱植提物）以其綠色、安全等特性成為化學(xué)防腐劑的最佳替代品[3-5]。但是單一的植提物其抑菌活性和廣譜性有限，通過組合復(fù)配開發(fā)新型防腐劑顯得尤為重要?；诖?，本文以9種植提物對3種常見污染微生物的抑菌強(qiáng)弱及廣譜性為依據(jù)，從中篩選出4種植提物，并進(jìn)一步復(fù)配得到一種抗菌性較強(qiáng)的植物源防腐劑，同時(shí)通過測定植物源防腐劑對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞壁完整性等的影響來探究其抑菌機(jī)理，為開發(fā)新型綠色、安全、高效的植物源防腐劑提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌：中國普通微生物菌種保藏管理中心；連翹精油、無花果精油、丁香精油：江西億森源植物香料有限公司；紫蘇提取物、丁香提取物、無花果提取物（均為水提物）：中北大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；2%連翹苷、銀杏黃酮19C、銀杏黃酮20C：寧波瑞源生物科技有限公司；復(fù)配防腐劑（組分：1.0%～1.6%5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、0.3%～0.5%2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、0.7%～0.8%氯化鎂、20%～25%硝酸鎂、水）：大連百傲化學(xué)股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、二甲基亞砜、無水乙醇、葡萄糖、牛血清蛋白、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250、巰基乙醇、2.5%戊二醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

可見分光光度計(jì)（JH-14-04）：上海菁華科技儀器有限公司；臺(tái)式恒溫培養(yǎng)搖床（FLY-200B）：深圳市愛特爾電子科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQLS-50S）：北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；超凈工作臺(tái)（VD-1320）：上海市金鵬分析儀器有限公司；酶標(biāo)分析儀（DNM-9602G）：北京普朗新技術(shù)有限公司；電導(dǎo)率儀（DDS-11A）：杭州奧立龍儀器有限公司；電泳儀（DYY-12）：北京市六一儀器廠；掃描電子顯微鏡（SU8010）：日本日立儀器有限公司。

1.2 植物提取物的篩選

1.2.1 菌懸液的制備

將菌種轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基中，37℃（真菌轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基，28℃）、120 r/min于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h用分光光度計(jì)測其在600 nm處的OD值，用比濁法[6]將菌液濃度調(diào)至107CFU/mL備用。

1.2.2 植物提取物的濃度梯度

精油類：連翹精油（編號1#）、無花果精油（編號2#）、丁香精油（編號 3#），濃度梯度為 30%、20%、10%、1%、0.5%、0.25%、0.125%；其他植物提取物：紫蘇提取物（編號 4#）、2%連翹苷（編號5#）、丁香提取物（編號6#）、銀杏黃酮 19C（編號 7#）、銀杏黃酮 20C（編號 8#）、無花果提取物（編號9#），濃度梯度為100%、90%、80%、40%、20%、5%、2.5%、1.25%。精油類稀釋溶劑為4%二甲基亞砜溶液，其他植提物稀釋溶劑為水。

1.2.3 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

MIC值測定采用96孔板法，確定菌懸液的菌落形成單位（CFU）滿足 106CFU/mL～108CFU/mL后，將試驗(yàn)組（各植提物＋菌液）、陰性對照組（無菌水＋菌液）、空白組（無菌水）分別加入到無菌的96孔板中，在37℃（真菌28℃）培養(yǎng)0、12、24 h后于600 nm處測其OD值，對比OD600得出MIC值，每個(gè)樣品做3組平行。通過比較9種提取物對3種供試菌的抑菌強(qiáng)弱及廣譜性，篩選出4種植提物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 4種植提物的復(fù)配

通過1.2篩選出4種植提物，分別為連翹精油（編號 1#）、無花果精油（編號 2#）、丁香精油（編號 3#）、紫蘇提取物（編號4#），用棋盤稀釋法[7-8]將4種植提物進(jìn)行復(fù)配，首先兩兩復(fù)配，然后選取有聯(lián)合作用的兩種植提物與第3種植提物進(jìn)行復(fù)配，以此類推。以各提取物MIC值的1/8、1/4、1/2、1倍、2倍進(jìn)行聯(lián)合，示意圖見圖1。

圖1 棋盤稀釋法示意圖Fig.1 Schematic diagram of chessboard dilution method

在96孔板中，保證每個(gè)孔內(nèi)所加液體體積一致，平均每個(gè)孔做3組平行。MIC值的測定同1.2.3，通過以下公式計(jì)算復(fù)配強(qiáng)度（compound strength，CS），判斷其復(fù)配抑菌效果。

式中：CS≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜CS≤1為相加作用；1＜CS≤2 為無關(guān)作用；CS＞2 為拮抗作用。

1.4 植物源防腐劑抑菌機(jī)理分析

按1.3復(fù)配后將得到3個(gè)配方，以抑菌能力及廣譜性為原則，選擇最佳配方，并選擇抑菌性較強(qiáng)的100%無花果精油作為對照，以大腸桿菌作為試驗(yàn)菌種研究抑菌機(jī)理。

1.4.1 植物源防腐劑對3種供試菌MIC值測定

方法同1.2.3。

1.4.2 細(xì)胞膜通透性試驗(yàn)

細(xì)胞膜通透性指細(xì)胞膜遭到破壞后，胞內(nèi)的物質(zhì)釋放到胞外的程度。細(xì)胞膜完整性可通過K+滲透試驗(yàn)及核酸滲漏試驗(yàn)有效反映。

1.4.2.1 K+滲透試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法[9-11]并稍作修改。取對數(shù)生長期的菌懸液，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用5%葡萄糖溶液洗滌3次，重懸菌體調(diào)節(jié)至107CFU/mL，分別加入無菌水、無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）、復(fù)配防腐劑（編號MIT）使其最終濃度為各自的0.5 MIC，于37℃下培養(yǎng)4 h。然后8 000 r/min離心10 min，取上清液測定電導(dǎo)率L1；測定葡萄糖溶液的電導(dǎo)率L0；測定不含菌體、加入不同抑菌劑的葡萄糖溶液的電導(dǎo)率L3；取另一份不加抑菌劑的菌懸液煮沸5min后測定上清液電導(dǎo)率L2，細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性用相對電導(dǎo)率C來表示。

1.4.2.2 核酸滲漏試驗(yàn)

參照Lv等的方法[12]并稍作改動(dòng)。取對數(shù)生長期的菌懸液8000r/min離心10min，棄去上清液，用0.067mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH7.2）洗滌沉淀3次，用PBS重懸至107CFU/mL得到菌體沉淀和PBS的混合液，混合液分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的混合液作為陰性對照，加復(fù)配防腐劑（編號MIT）的混合液作為陽性對照，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4 h，10 000 r/min離心10 min，測定上清液OD260值即為核酸滲漏量，陰性對照組以PBS為參比，試驗(yàn)組以加入抗菌劑的PBS為參比。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照Xing等[13]的方法稍作改動(dòng)。取大腸桿菌菌懸液，分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的菌懸液作為陰性對照，加復(fù)配防腐劑（編號MIT）的菌懸液作為陽性對照，分別加100 μL樣品緩沖液，37℃下分別孵育 1、3、6 h，8 000 r/min 離心 1 min，取 20 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE。濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12.5%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染液染色并脫色處理。

1.4.4 掃描電鏡分析

參照文獻(xiàn)方法[14]并稍作修改。取對數(shù)期的菌懸液，分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的菌懸液作為陰性對照，加復(fù)配防腐劑（編號MIT）的菌懸液作為陽性對照，37℃、120 r/min培養(yǎng)3 h，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用0.067 mol/L的PBS（pH7.2）洗滌沉淀3次，重懸至108CFU/mL。然后用預(yù)冷的2.5%戊二醛重懸，4℃下固定24 h后8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，按順序分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水，每次靜置10 min，最后將酒精換為叔丁醇，冷凍干燥，噴金后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均設(shè)置3次平行，采用Origin 2019進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種植物提取物對3種供試菌的MIC值測定結(jié)果

不同植物提取物對3種供試菌的MIC值見表1。

表1 不同植物提取物對3種供試菌的MIC值Table 1 MIC values of different plant extracts against three tested bacteria

由表1可知，連翹精油、無花果精油、丁香精油、紫蘇提取物對3種供試菌抑制作用較強(qiáng)，因此選擇這4種植提物進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 4種植提物復(fù)配結(jié)果

4種植提物聯(lián)合對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的CS值見表2、表3、表4。

表2 4種植提物聯(lián)合對大腸桿菌的CSTable 2 Four plant extracts combined with CS against Escherichia coli

表3 4種植提物聯(lián)合對金黃色葡萄球菌的CSTable 3 Four plant extracts combined with CS against Staphylococcus aureus

續(xù)表3 4種植提物聯(lián)合對金黃色葡萄球菌的CSContinue table 3 Four plant extracts combined with CS against Staphylococcus aureus

表4 4種植提物聯(lián)合對白色念珠菌的CSTable 4 Four plant extracts combined with CS against Candida albicans

由表2、表3、表4可知，4種植提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌得到3種復(fù)配結(jié)果，分別為配方Ⅰ（0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物）、Ⅱ（0.062 5%連翹精油-0.125%無花果精油-0.031 25%丁香精油-1%紫蘇提取物）、Ⅲ（0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物），體積比均為1∶1∶1∶1。由于配方Ⅰ、Ⅲ結(jié)果一致，考慮到植物源防腐劑抑菌廣譜性，選擇配方Ⅰ為植物源防腐劑最佳配方，即0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物。

2.3 植物源防腐劑抑菌機(jī)理分析

2.3.1 植物源防腐劑對3種供試菌的MIC值

植物源防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分別為0.25%、0.125%、0.25%。

2.3.2 植物源防腐劑對細(xì)胞膜通透性的影響

2.3.2.1 K+滲透試驗(yàn)

不同試驗(yàn)處理組對K+滲透的影響見圖2。

圖2 不同試驗(yàn)處理組對K+滲透的影響Fig.2 Effect of different experimental treatment groups on K+permeation

由圖2可知，與陰性對照相比，植物源防腐劑處理組（BP處理組）菌懸液相對電導(dǎo)率增加了82.57%，原因可能是植物源防腐劑能破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜內(nèi)的K+等電解質(zhì)離子釋放到菌懸液中導(dǎo)致菌懸液電導(dǎo)率升高[15]，也有可能因?yàn)橹参镌捶栏瘎┻M(jìn)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，破壞了細(xì)胞正常生理代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞膜破裂。

2.3.2.2 核酸滲漏試驗(yàn)

不同試驗(yàn)處理組對核酸滲漏的影響見圖3。

圖3 不同試驗(yàn)處理組對核酸滲漏的影響Fig.3 Effect of different experimental treatment groups on nucleic acid leakage

核酸在260 nm處有最大吸收，通過測定菌懸液在260 nm處的OD值可有效反映大腸桿菌的核酸滲漏情況。如圖3所示，植物源防腐劑處理組（BP處理組）的核酸含量是陰性對照的3倍，且比純精油的無花果精油處理組（2#處理組）增加接近1倍，但低于陽性對照組。說明植物源防腐劑增加了菌體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致在正常狀態(tài)下處于胞內(nèi)的核酸大分子通過細(xì)胞膜滲漏到胞外，與電導(dǎo)率的變化趨勢一致[16]，李琪孟等[17]研究所得馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑的抑菌機(jī)理也是通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性導(dǎo)致核酸滲漏增加，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.4 SDS-PAGE測定結(jié)果

不同試驗(yàn)處理組對大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)表達(dá)的影響如圖4所示。

圖4 不同試驗(yàn)處理組對大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different treatment groups on protein expression of Escherichia coli

在作用時(shí)間1、3、6 h后，大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為條帶由多變少，3個(gè)試驗(yàn)組均能較好地抑制大腸桿菌蛋白質(zhì)的表達(dá)，且由泳道1、2條帶的變化可知，植物源防腐劑對蛋白質(zhì)表達(dá)的影響大于無花果精油，究其原因，可能是植物源防腐劑對大腸桿菌菌體相關(guān)蛋白酶的活性有所抑制[18]。

2.5 掃描電鏡結(jié)果

圖5為不同試驗(yàn)處理組大腸桿菌掃描電鏡圖。

圖5 不同試驗(yàn)處理組大腸桿菌掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy of Escherichia coli in different experimental groups

由圖5a和圖5b可知，正常生長的大腸桿菌呈棒狀、表面光滑；經(jīng)植物源防腐劑處理過的大腸桿菌表面出現(xiàn)明顯突起，部分菌體有明顯的扭曲變形（圖5c和圖5d），表明植物源防腐劑可破壞大腸桿菌細(xì)胞壁的完整性，從而抑制其生長繁殖；同時(shí)無花果精油處理組和陽性對照組也對大腸桿菌細(xì)胞壁有較強(qiáng)的破壞作用。究其原因可能是植物源防腐劑含有精油成分，精油類物質(zhì)脂溶性較強(qiáng)，細(xì)菌細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層及蛋白質(zhì)構(gòu)成，親脂性較強(qiáng)的植物源防腐劑作用于大腸桿菌導(dǎo)致細(xì)胞壁被破壞，細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜失去細(xì)胞壁保護(hù)極易被破壞[19-20]。

3 結(jié)論

通過初篩和組合復(fù)配，開發(fā)出一款由連翹精油、無花果精油、丁香精油和紫蘇提取物組成的植物源防腐劑，其配方為0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物，體積比為1∶1∶1∶1；并對植物源防腐劑的抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探究，與單一植提物相比，經(jīng)復(fù)配后的植物源防腐劑抑菌能力更強(qiáng)。初步推測植物源防腐劑的抑菌機(jī)理為破壞細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞膜的滲透壓，改變其通透性，再破壞細(xì)菌的遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)達(dá)到抑菌防腐的目的。本研究說明植物源防腐劑在天然抑菌劑方面有一定的發(fā)展前景。