超聲復(fù)合酶法提取藍靛果多糖優(yōu)化及紅細胞溶血保護作用

李小慶，修玥，唐博，張玉，安穎，徐雅琴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

天然植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗凝血和免疫增強等作用，因此受到研究者的廣泛關(guān)注[1-2]。多糖作為天然抗氧化劑，可清除體內(nèi)自由基，對治療疾病和保護人體健康大有益處。目前評價體外抗氧化活性的方法通常采用化學(xué)方法，如ABTS法、DPPH法、羥自由基法、超氧陰離子自由基法等[3-4]。而生物體內(nèi)氧化過程極其復(fù)雜，導(dǎo)致化學(xué)方法測定的結(jié)果不能很好同生物體內(nèi)的實際情況相符。因此，在化學(xué)方法評價的基礎(chǔ)上需進一步結(jié)合生物實驗進行評價。目前細胞生物學(xué)法已成為評價天然產(chǎn)物抗氧化活性及探討作用機制的重要手段，但應(yīng)用于多糖抗氧化性的研究相對較少[5-6]。

多糖的提取技術(shù)是多糖研究及應(yīng)用的基礎(chǔ)，如何簡化提取工藝，提高多糖得率是多糖研究的關(guān)鍵問題。多糖提取方法包括溶劑（水）提取法、酶提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助-酶法、微波輔助-酶法等[7-9]。超聲波輔助提取法利用超聲波的空化作用、機械作用以及熱效應(yīng)來加速植物細胞壁的破碎，具有環(huán)境友好、提取時間短、提取率高等優(yōu)點[8]。復(fù)合酶法提取通過酶解反應(yīng)，破壞植物細胞壁，強化傳質(zhì)過程，進而提高多糖得率，具有條件溫和、雜質(zhì)易除等優(yōu)點[10]。超聲復(fù)合酶法可綜合超聲提取和復(fù)合酶提取方法的優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取[8，11]。

藍靛果，學(xué)名藍靛果忍冬（Lonicera aerulea L.），是一種新興的小漿果資源[4]。藍靛果果實內(nèi)富含黃酮類、花色苷、糖類、維生素和礦物元素等物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、抗菌、抗腫瘤、護肝的功效[12-14]。目前，國內(nèi)外針對藍靛果果實的研究主要集中在黃酮類、花色苷等物質(zhì)，對于藍靛果多糖的研究報道較少[14-15]，關(guān)于超聲復(fù)合酶法優(yōu)化藍靛果多糖的提取工藝及采用細胞生物學(xué)方法評價抗氧化性的研究未見報道。本文以藍靛果果實為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲復(fù)合酶法藍靛果多糖提取工藝，并測定其對紅細胞損傷的保護作用。本研究為藍靛果果實多糖高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果果實：黑龍江省農(nóng)科院牡丹江農(nóng)科所；大孔吸附樹脂D4006：南開大學(xué)化工廠；兔紅細胞：廣州鴻泉生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒：南京建成科技有限公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

超聲破碎儀（JY92-IIV型）：寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍干燥機（FDU-1100型）：東京理化機械株式會社；可見分光光度計（WFJ-7200型）：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

準(zhǔn)確稱取藍靛果果實5.0 g，加入125 mL去離子水，超聲功率為300 W，超聲時間為40 min，以多糖得率為指標(biāo)，采用不同pH值（2.5～6.5）、果膠酶添加量（0.1%～0.9%）、纖維素酶添加量（0.1%～0.9%）進行超聲復(fù)合酶法提取試驗，研究不同提取條件對提取效果的影響。藍靛果果實總糖含量采用苯酚硫酸法測定[16]，還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[17]，多糖質(zhì)量及得率計算公式如下。

式中：m為藍靛果果實的質(zhì)量，g；m1為提取液中多糖質(zhì)量，g。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

以pH值、果膠酶添加量、纖維素酶添加量為自變量，多糖得率為響應(yīng)值進行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，并選擇二次多項式方程對模型進行擬合[7]。

1.2.3 驗證試驗

在最佳提取條件下進行3次重復(fù)試驗。將試驗值與預(yù)測值進行比較，以確定模型的有效性和準(zhǔn)確性。

1.2.4 藍靛果果實多糖的制備

利用優(yōu)化試驗得到的最佳條件提取藍靛果多糖，沸水浴滅酶10 min。提取液經(jīng)抽濾，濃縮，80%乙醇醇沉、4℃冰箱靜置過夜，所得沉淀即為藍靛果粗多糖。參考文獻[18]的方法，利用D4006型大孔樹脂純化藍靛果粗多糖，得到多糖命名為BHP，進行活性試驗測定。

1.2.5 多糖BHP對紅細胞溶血保護作用

1.2.5.1 紅細胞懸浮液的制備

將6%兔紅細胞用阿氏液稀釋成體積分數(shù)為3%紅細胞懸浮液，取1.0 mL體積分數(shù)為3%兔紅細胞懸浮液，分別加入0.5 mL不同濃度的多糖溶液和1.0 mL的生理鹽水，于37℃孵育10 min，然后加入1.5 mL H2O2（1 mmol/L）溶液，37℃水浴條件下反應(yīng)2 h得到紅細胞多糖懸浮液。

1.2.5.2 H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷紅細胞溶血率的測定

取出200 μL的反應(yīng)混合液，加入4.0 mL生理鹽水，2 000 r/min離心10 min，取上清液，在415 nm處測吸光度A1，相同條件下，用4.0 mL去離子水代替生理鹽水得到吸光值A(chǔ)2，每組平行3次。

1.2.5.3 H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷紅細胞MDA和GSH含量的測定

取紅細胞多糖懸浮液為測定樣品，生理鹽水作為空白對照組，VC作為陽性對照組，按照試劑盒說明書步驟，測定紅細胞中MDA和GSH含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用Minitab 19.0軟件進行響應(yīng)面試驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

不同pH值、果膠酶添加量和纖維素酶添加量對多糖得率影響見圖1。

圖1 不同因素對多糖得率的影響Fig.1 Effects of different factor on the polysaccharides yield

由圖1A可知，隨著pH值的不斷增加，多糖得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH值為3.5時多糖提取率達到最高，當(dāng)pH值繼續(xù)增加后，多糖得率有明顯下降趨勢，說明pH3.5更利于多糖的溶出。原因可能是pH值為3.5時更適合兩種酶發(fā)揮活性。適宜的pH值是保證酶活性的關(guān)鍵因素，pH值過高或過低會導(dǎo)致酶的活性減弱甚至喪失[19]。由圖1B可知，在果膠酶添加量為0.1%～0.7%的范圍內(nèi)，多糖得率隨著果膠酶添加量的增加而逐漸增大。當(dāng)添加量達到0.7%時，多糖得率最高；添加量超過0.7%，多糖得率開始降低，故果膠酶的最適添加量為0.7%。由圖1C可知，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)添加量達到0.5%時，多糖得率達到最大；再增加酶添加量，多糖得率開始緩慢下降，故纖維素酶的最適添加量為0.5%。原因是果膠酶和纖維素酶均能通過酶解作用破壞細胞壁，使得細胞內(nèi)多糖的有效成分溶出[20-21]。當(dāng)酶添加量升高時，酶與底物接觸的面積變大，破壞了細胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使多糖可以更好地溶出；但當(dāng)果膠酶添加量超過0.7%，纖維素酶添加量超過0.5%時，酶分子逐漸處于過飽和狀態(tài)，導(dǎo)致多糖得率略微下降[22]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 1 Experimental results of response surface analysis

將試驗結(jié)果用Minitab 19.0軟件進行回歸擬合，得到回歸方程為Y=2.824+0.464A+10.72B+8.375C+0.675AB-0.200AC-1.375BC-0.123 5A2-7.962B2- 5.838C2。對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

由表2結(jié)果可知，本試驗二次方程模型顯著（P＜0.000 1）。失擬項P=0.102 2＞0.050 0，說明回歸模型擬合度很好，該數(shù)學(xué)模型可以推測該試驗的結(jié)果。預(yù)測值與試驗值具有高度的相關(guān)性（R2=0.989 4），變異系數(shù)較低（0.51%），說明模型方程可以較好地反映真實試驗值，具有較高的準(zhǔn)確性[7]。模型準(zhǔn)確性分析見圖2。

圖2 模型準(zhǔn)確性分析Fig.2 Accuracy analysis of model

圖2的結(jié)果可進一步證明模型的準(zhǔn)確性。圖2A中各數(shù)據(jù)點分布幾乎在同一條直線上，未發(fā)生嚴(yán)重的偏離現(xiàn)象，殘差符合正態(tài)分布規(guī)律。在圖2B中，各個殘差的分布分散且無規(guī)律，均處在合理的范圍內(nèi)，說明殘差數(shù)據(jù)正常；殘差與順序圖如圖2C所示，該圖中殘差圍繞中心線隨機分布，說明殘差獨立于其他殘差，每個響應(yīng)值與擬合的回歸相比不存在異常點。

此外，由表 2 可知，一次項 B、C，二次項 A2、B2、C2對多糖得率的影響極顯著（P＜0.01）。各因素兩兩之間的相互作用對多糖得率的影響的大小順序為AB＞BC＞AC；各單因素的平方對多糖得率的影響的大小順序為B2＞C2＞A2；不同因素對藍靛果多糖得率影響的順序為B＞C＞A。

2.2.2 多糖最佳提取條件的確定和驗證試驗

根據(jù)Minitab軟件，得到多糖的最佳提取條件如圖3所示。

圖3 提取條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of extraction condition

由圖3可知，最佳提取條件為pH 3.53、果膠酶添加量0.77%、纖維素酶添加量0.57%，在此條件下多糖得率達到10.17%?？紤]到實際操作，選取多糖提取工藝條件為pH 3.5、果膠酶添加量0.8%、纖維素酶添加量0.5%，試驗結(jié)果為藍靛果多糖得率（10.08±0.14）%。說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性與可靠性。該方法和單獨超聲波提取藍靛果多糖得率（8.31±0.23）%[23]、復(fù)合酶法提取藍靛果多糖得率（8.72±0.18）%相比，得率分別增加了（1.77±0.09）%和（1.36±0.04）%。

2.3 H2O2誘導(dǎo)的紅細胞溶血的保護作用

2.3.1 H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷溶血率

不同濃度多糖樣品對H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷溶血率的影響如圖4所示。

圖4 多糖對紅細胞溶血保護作用Fig.4 Protective effect of the polysaccharides on the hemolysis of erythrocytes

由圖4可知，不同濃度多糖和VC均能有效地抑制由H2O2誘發(fā)的紅細胞氧化性溶血，但是多糖對紅細胞溶血的保護作用小于對照VC。隨著多糖濃度的增加，紅細胞溶血率逐漸減小。樣品濃度為4.0 mg/mL時，VC和多糖BHP可使由H2O2誘導(dǎo)的紅細胞溶血率分別降至（16.15±0.48）%和（29.08±0.73）%，同未加多糖相比，紅細胞溶血率減少（61.82±0.10）%。

2.3.2 H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷MDA含量的測定

不同濃度多糖樣品對H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷的MDA含量的影響如圖5所示。

圖5 多糖對H2O2誘導(dǎo)紅細胞氧化損傷的MDA含量的影響Fig.5 Influence of the polysaccharides on MDA levels of erythrocytes oxidative damage induced by H2O2

脂質(zhì)過氧化物MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸受到自由基的攻擊產(chǎn)生的，其含量高低能夠反映細胞膜受損害的程度，因此，測定MDA含量可以間接代表機體氧化損傷的程度[24-25]。由圖5可知，當(dāng)加入多糖或者VC后，紅細胞內(nèi)的MDA含量明顯降低并且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。當(dāng)多糖或者VC濃度為4.0 mg/mL時，紅細胞內(nèi) MDA 含量最低，分別為（38.05±3.46）、（18.31±1.07）nmol/mL。同未加多糖和VC相比，MDA含量分別減少（25.85±1.51）%、（45.59±3.90）%?？梢姸嗵悄軌虮Ｗo紅細胞免受氧化損傷，但是保護作用小于VC。

2.3.3 H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷GSH含量的測定

GSH是一種重要的抗氧化劑，它能使血紅蛋白及其它輔因子免受氧化損傷，GSH含量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[26]。不同濃度多糖樣品對H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷的GSH含量的影響如圖6所示。

圖6 多糖對H2O2誘導(dǎo)的紅細胞氧化損傷的GSH含量的影響Fig.6 Influence of the polysaccharides on GSH levels of erythrocytes oxidative damage induced by H2O2

由圖6可知，隨著多糖濃度增加，GSH含量逐漸增大。VC和多糖BHP體系的GSH值最高達到（15.36±1.07）、（13.21±1.07）mg GSH/L。同未加多糖或者 VC體系相比，GSH含量增加了（6.79±0.36）%、（8.93±0.36）%。

3 結(jié)論

在超聲功率300 W、超聲時間40 min、料液比1∶25（g/mL）的條件下優(yōu)化復(fù)合酶法提取藍靛果果實多糖，響應(yīng)面分析得到回歸模型合理。最佳提取條件為pH 3.5，果膠酶添加量0.8%、纖維素酶添加量0.5%。在此條件下，多糖得率為（10.08±0.14）%，接近預(yù)測值10.17%。藍靛果多糖對紅細胞氧化損傷具有一定的保護作用，當(dāng)多糖濃度為4.0 mg/mL時對紅細胞氧化損傷的保護作用最強，紅細胞溶血率與MDA含量分別減少了（61.82±0.10）%和（25.85±1.51）%，GSH 含量增加了（6.79±0.36）%。可見藍靛果多糖具有作為天然抗氧化劑的潛力。