氟磺胺草醚及其降解菌對大豆生長及生物固氮的影響

周聰，陳未，高巖*，施曼，李江葉，劉麗珠，陳金林

（1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；2.江蘇省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；3.浙江農林大學林業(yè)與生物技術學院，杭州 311100）

氟磺胺草醚是一類常用于大豆田除草的高效莖葉類除草劑，但其在土壤中半衰期較長，為100～240 d[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，氟磺胺草醚田間實際用量為登記用量的3～4 倍[2]，80%～90%的除草劑最終進入土壤，長殘效除草劑（氟磺胺草醚）在農田土壤中長期累積，導致雜草抗性日趨加重，作物產量逐漸下降，后茬作物立苗受到顯著影響，土壤微生物多樣性和活性遭到破壞，生物固氮受到影響[3?4]。因此，及時有效地消除氟磺胺草醚對豆科作物生長及固氮微生物的不利影響是農業(yè)生產過程中亟待解決的關鍵問題。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌在不同環(huán)境長期的自然選擇過程中，形成了降解有毒物質的關鍵酶系。據報道，從不同污染土壤中分離獲得的根瘤菌能夠在離體條件下降解甲苯、莠去津、多環(huán)芳烴、茅草枯、草甘膦等有機污染物[5?6]。根瘤菌能夠增強有機污染物的降解可能是因為：根瘤菌定殖在植物根部，生存環(huán)境較好，可以增加植物根系分泌物，促進土壤微生物數(shù)量及土壤酶活性，改善土壤微生物群落結構，形成植物?微生物修復體系，增強微生物的降解作用[7]；微生物可以通過變異產生新的菌種，形成新的降解酶系統(tǒng)，降解相應的人工合成的有機化合物[8]。因此，篩選高效降解氟磺胺草醚根瘤菌應用于長期施用該除草劑的土壤是緩解其對農田系統(tǒng)生物固氮及豆科作物生長所造成負面影響的一種有效手段。

本項目組篩選出了一批具有降解氟磺胺草醚能力的固氮根瘤菌，其中菌株Sinorhizobiumsp.W16 在預試驗中對緩解氟磺胺草醚藥害以及促進大豆苗期生長表現(xiàn)出了良好的效果，但其對大豆生長過程中生物固氮的影響還不清楚。生物固氮占全球固氮總量的70%，其包括自生固氮、共生固氮以及聯(lián)合固氮，生物固氮是大豆的主要氮素來源[9]。目前，氟磺胺草醚降解菌對作物生長影響的研究較多，但對豆科植物?根瘤菌共生固氮及土壤固氮微生物的影響及相關機制仍不明確[10]。本項目組通過盆栽試驗，研究了氟磺胺草醚及其降解菌Sinorhizobiumsp.W16 對大豆生長、生物固氮能力、根瘤菌干質量與根瘤固氮酶活性、根際固氮功能基因豐度及氮轉化相關功能基因豐度的影響，旨在為大豆種植中合理施用除草劑以及修復除草劑污染土壤提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗土壤采自江蘇省常州市（119°57′05″E，31°56′49″N）0～20 cm 農田耕層土壤，農田5 a 內未曾使用過氟磺胺草醚。試驗所用土壤為長江中下游典型大豆種植區(qū)域土壤——黃棕壤，土壤理化性質為：有機質4.03 g·kg?1、全氮0.370 g·kg?1、堿解氮17.33 mg·kg?1、全磷0.552 g·kg?1、有機磷0.040 g·kg?1、pH 7.29。土樣在室溫下自然風干，磨碎，過2 mm篩，供盆栽試驗使用。

試驗所用除草劑為25%氟磺胺草醚水劑，購自山東天潤化工有限公司。所用大豆品種為蘇C1008，由江蘇省農業(yè)科學院經濟作物研究所提供。

試驗所用降解菌株Sinorhizobiumsp.W16 由江蘇省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所農產品產地環(huán)境研究中心篩選提供。以50 mg·kg?1氟磺胺草醚為唯一碳源，5%的接種量（質量比）進行7 d 液體降解試驗，降解菌株W16 對氟磺胺草醚的降解率在35%左右，通過測序發(fā)現(xiàn)菌株W16 為中華根瘤菌Sinorhizobiumsp.。

試驗用盆為硬質塑料花盆，底部留有孔徑以供排水，盆的規(guī)格為長24 cm×寬24 cm×高19 cm。

1.2 試驗設計

試驗于2020 年5 月在江蘇省農業(yè)科學院溫室大棚（118°52′13.65″E，32°02′9.07″N）進行，光照為自然光照。在每個花盆中裝入4.5 kg 風干土壤，盆內播種大豆種子8～10粒，澆透水，然后采用稱質量的方法將土壤含水率維持在田間持水量（60%）。待長出真葉后每個花盆保留4株長勢一致的幼苗。

試驗采用完全隨機設計，共7個處理，包括不接菌組（F）、接菌組（FJ）和對照組（CK）。其中，不接菌組和接菌組均設置3 個氟磺胺草醚施用劑量（以有效成分計），分別為大田推薦劑量（F1和FJ1，225 g·hm?2）、2倍大田推薦劑量（F2和FJ2，450 g·hm?2）和5倍大田推薦劑量（F3和FJ3，1 125 g·hm?2）。對照組不施用氟磺胺草醚且不接菌。每個處理設置4 個重復，每個時間點采集4/5個重復樣本，共計140盆。

在播種后第21 d（V2 苗期）時施用除草劑，使用配有氟磺胺草醚試劑的真空按壓分裝瓶（30 mL）對每盆植株進行莖葉噴施。播種后第28 d時，在接菌組大豆根部滴加20 mL降解菌懸液。

加入降解菌懸液后分別在始花期（10 d，R1）、初莢期（20 d，R2）、盛莢期（30 d，R4）、鼓粒期（40 d，R6）和成熟期（50 d，R7）進行樣品的破壞性采樣。采集土壤樣品時首先進行盆土分離，將非根際土壤混勻后，取1 kg左右用于土壤銨態(tài)氮和土壤硝態(tài)氮的測定，并將采集的一部分新鮮土壤保存于?20℃冰箱用于土壤脲酶的測定。去除根系附著土壤，然后用毛刷輕輕刷取大豆根部新鮮根際土壤并保存于?80 ℃冰箱，用于土壤DNA 的提取以及相關功能基因的測定。同時采集作物地下部樣品，輕輕洗去根系附著土壤，用吸水紙擦干，用于根部生物量以及根瘤固氮酶活性的測定，地上部樣品保存于?80 ℃冰箱用于植物全氮的測定。

1.3 植物與土壤理化指標的測定

采用凱氏定氮法[11]測定植株全氮含量，采用乙炔還原法[12]測定大豆根瘤固氮酶活性；使用索萊寶試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）測定土壤脲酶活性；使用天平稱取作物單株質量、籽粒百粒質量、根干質量、根瘤干質量。采用FastDNA Spin 試劑盒（MP Biomedical，Carlsbad，USA）提取土壤樣品的DNA，根據LI 等[13]和XU 等[14]已修正的程序，采用實時熒光定量擴增技術（qPCR）測定基因拷貝數(shù)，擴增引物及擴增條件詳見表1。

表1 擴增引物及擴增條件Table 1 Amplification primers and amplification conditions

土壤氟磺胺草醚提取方法：稱取2 g 冷凍干燥的新鮮土樣于50 mL 離心管中，加入5 mL 去離子水和5 mL 乙腈，渦旋1 min，浸泡2 h 后，振蕩4 h，然后將離心管置于離心機中8 000 r·min?1離心5 min，取5 mL上清液轉移至裝有1 g NaCl 的10 mL 離心管中，振蕩20 min后，靜置15 min，取上層乙腈相過0.22μm 有機相濾膜后上機測試。液相色譜測定條件：分離柱為ZORBAX SB?C 184.6 mm×150 mm 不銹鋼柱，流動相為乙腈/水（0.5%磷酸）=65/35，波長290 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min?1，進樣量20μL。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel 2012 和Adobe Illustrator 2020 進行數(shù)據處理和制圖。采用SPSS 22.0 進行單因素、多因素方差分析和皮爾遜相關分析，處理間多重比較采用最小顯著性差異（LSD）法。

2 結果與分析

2.1 氟磺胺草醚及其降解菌對大豆生長和氮累積的影響

由圖1A 可知，大豆干質量（地上部生物量）隨著氟磺胺草醚施用量的增加呈現(xiàn)降低趨勢，2 倍和5 倍大田推薦劑量時的，大豆干質量較CK 顯著下降7.42%和11.12%（P＜0.05）；接菌后，大豆植株干質量較不接菌提高3.16%～5.44%。氟磺胺草醚的施用顯著降低了大豆籽粒百粒質量（鮮質量），且隨著施用劑量的增加，影響加?。▓D1B）。5倍大田推薦劑量顯著降低籽粒百粒質量達22.23%。相較于不接菌，接菌處理使得大豆籽粒百粒質量增加9.30%～11.94%。施用不同劑量氟磺胺草醚均顯著降低大豆根干質量（圖1C），降低率最高達43.51%。接種菌株W16能夠一定程度緩解高劑量除草劑對大豆根系的藥害作用，相較于不接菌，接菌后根干質量增加1.57%～12.73%。

隨氟磺胺草醚施用量的增加，大豆對氮素的累積呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖1D）。接種菌株W16可以顯著提高大豆全氮含量，相較于未接菌處理，接菌可增加大豆全氮含量15.84%～24.93%。

2.2 氟磺胺草醚及其降解菌對大豆根瘤和根瘤固氮酶活性的影響

由圖2A 可知，氟磺胺草醚的施用降低了根瘤干質量，且隨著施用劑量的增加而加劇，2 倍大田推薦劑量顯著降低大豆根瘤干質量，5 倍大田推薦劑量時的抑制率達到最高，為26.47%。接菌后，根瘤干質量增加1.52%～11.01%。

總體上大豆根瘤固氮酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2B），其中盛莢期R4 時根瘤固氮酶活性最高。這可能是與大豆生長習性有關，在鼓粒期R6前，大豆生長急需氮素供應，因此大豆根瘤固氮酶活性逐漸升高，以獲取充足的氮素供應滿足生長需求。氟磺胺草醚的施用在大豆各個時期均抑制了根瘤固氮酶活性，大田推薦量下的抑制率可達38.37%（盛莢期R4），2倍田間推薦量下的抑制率可達52.23%（始花期R1）、5倍田間推薦量下的抑制率可達91.07%（始花期R1）。接菌處理能夠顯著緩解中、低劑量氟磺胺草醚對根瘤固氮酶活性的抑制，其中在30 d（盛莢期R4）時，接種W16 降解菌可使1 倍和2 倍田間推薦量下根瘤固氮酶活性恢復至與對照相近水平。

2.3 氟磺胺草醚及其降解菌對大豆根際土壤氮循環(huán)功能基因豐度和土壤氮素轉化的影響

由圖3A 可知，大豆根際土壤nifH基因豐度隨著時間的增加呈上升趨勢，這可能是受到W16 菌株及大豆生長的持續(xù)影響。但與未施用除草劑的對照相比，施用氟磺胺草醚降低了根際土壤nifH基因豐度。接種W16 降解菌可以顯著增加施用氟磺胺草醚根際土壤nifH基因豐度（P＜0.05），使根際土壤nifH基因豐度增加31.86%～146.87%，使根際土壤nifH基因豐度（成熟期R7）恢復甚至高于未施用除草劑的對照水平。

土壤氨氧化古菌AOA基因豐度（圖3B）隨大豆生長呈先上升后下降的趨勢，土壤氨氧化細菌AOB 基因豐度（圖3C）隨大豆生長呈下降趨勢。與未施用除草劑相比，施用高濃度氟磺胺草醚顯著降低大豆各生長時期根際土壤AOA 基因豐度（P＜0.05），根際土壤AOB基因豐度在大豆始花期R1受氟磺胺草醚影響較小，但在盛莢期R4和成熟期R7時受施用高濃度氟磺胺草醚影響而顯著增加。接種W16 降解菌提高了根際土壤AOA 和AOB 的基因豐度，最高分別達未接菌根際土壤的1.31倍和2.05倍。

與未施用除草劑的對照相比，氟磺胺草醚的施用在大豆不同生長時期整體表現(xiàn)為田間推薦量處理顯著刺激了土壤脲酶活性，而2 倍和5 倍田間推薦量處理顯著抑制土壤脲酶活性（圖3D）。相較于未接菌，接種W16 降解菌僅在成熟期R7 時，使土壤脲酶活性增加了27.62%。

由圖4A可知，在培養(yǎng)期內，土壤銨態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢，與未施用除草劑的對照相比，氟磺胺草醚的施用使土壤中銨態(tài)氮含量降低了9.46%～19.83%。相較于未接菌，接種W16 降解菌使土壤中銨態(tài)氮含量增加了5.34%～6.21%。

土壤中硝態(tài)氮含量隨著大豆的吸收作用而不斷下降（圖4B）。與未施用除草劑的對照相比，氟磺胺草醚的施用在始花期R1、鼓粒期R6 和成熟期R7 均顯著（P＜0.05）降低了土壤硝態(tài)氮含量。相較于未接菌，接種W16 降解菌促進了大豆?根際系統(tǒng)中生物固氮和土壤硝化作用，增加了土壤中有效氮素的供應。

2.4 Sinorhizobium sp.W16 菌液處理后土壤氟磺胺草醚降解動態(tài)

由圖5 可知，施用不同濃度的氟磺胺草醚后，其殘留量均隨時間推移呈顯著下降趨勢，但高劑量氟磺胺草醚殘留量均顯著高于低劑量。接菌處理組氟磺胺草醚的殘留量均顯著低于未接菌組（P＜0.05）：未接菌組氟磺胺草醚最終降解率為71.32%～75.37%；而接菌組氟磺胺草醚降解率提升了8.76個百分點（大田推薦劑量）、14.05 個百分點（2 倍大田推薦劑量）、10.03個百分點（5倍大田推薦劑量）。

3 討論

3.1 Sinorhizobium sp.W16 降解菌對氟磺胺草醚殘留及大豆生長的影響

目前，已有研究證實降解菌不僅可以應用于土壤的修復，還可以緩解其對植物的毒害作用，恢復甚至促進植物生長[18?19]。本研究中，施用氟磺胺草醚后，大豆根系受到氟磺胺草醚藥害，生物量及產量顯著下降。Sinorhizobiumsp.W16 降解菌的接種不僅有效地降低了土壤氟磺胺草醚殘留量，而且提高了大豆籽粒百粒質量、根生物量、根瘤生物量，較好地恢復了大豆植株的生長，緩解了氟磺胺草醚對豆科作物生長所造成的負面影響。這與YANG 等[10]從氟磺胺草醚污染土壤中分離的多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina的生物效應接近，該菌不僅具有良好的氟磺胺草醚降解能力，同時能促進玉米和高粱的生長。郭靜等[20]也發(fā)現(xiàn)接入氟磺胺草醚降解菌可以較好地恢復玉米的各項生長和生理指標。接種降解菌能夠較好地恢復植物生長，一方面，是由于降解菌可有效降解土壤中有機污染物，降低其殘留量。氟磺胺草醚在土壤中的自然降解率為40.85%～50.55%[21]。本研究中所使用的菌株W16 為中華根瘤菌（Sinorhizobiumsp.），其能夠以氟磺胺草醚作為唯一生長碳源，氟磺胺草醚最終降解率達81.97%，與對照相比，降解率提高8.76～14.05 個百分點，較好緩解了氟磺胺草醚對大豆的持續(xù)藥害。FENG 等[22]發(fā)現(xiàn)好氧細菌Pseudomonas zeshuiiBY?1 通過脫鹵（氯、氟）、脫硫及乙?；倪^程對氟磺胺草醚進行脫毒降解。本研究中Sinorhi?zobiumsp.W16 對氟磺胺草醚的降解機理需要后續(xù)進一步研究。另一方面，氮素是大豆生長發(fā)育和產量形成的主要元素，接種Sinorhizobiumsp.W16降解菌顯著刺激大豆根瘤固氮酶活性、土壤脲酶活性，改變氟磺胺草醚對原有根際土壤氮循環(huán)功能微生物區(qū)系的影響，增加了根際土壤nifH基因豐度31.86%～146.87%，提高了根際土壤AOA 和AOB 的基因豐度，加速了土壤中有機氮的水解，促進土壤中固氮作用和硝化作用，增加土壤對大豆的速效氮供應。

3.2 氟磺胺草醚及其降解菌對根際土壤固氮的影響

目前，大量研究已表明除草劑對土壤固氮潛力具有較大的影響[23?24]。本研究中氟磺胺草醚的施用顯著降低了根際土壤nifH基因豐度，弱化了土壤固氮潛力。EBERBACH 等[25]認為除草劑主要是通過影響土壤細菌數(shù)量進而影響固氮系統(tǒng)。目前已發(fā)現(xiàn)氟磺胺草醚、甲氨磷、西瑪津等除草劑的添加顯著減少土壤細菌總量以及土壤好氧固氮微生物數(shù)量，使土壤nifH基因豐度顯著下降，從而弱化土壤微生物固氮能力[26?28]。KOLE 等[29]則發(fā)現(xiàn)除草劑氯乙氟靈、二甲戊樂靈的施用顯著降低了花生田間土壤細菌總量及好氧非共生固氮菌數(shù)量，導致土壤非共生微生物固氮潛力下降。而根瘤菌的存在有利于土壤固氮微生物的生存，增加生物固氮潛力。前人研究發(fā)現(xiàn)，在未受任何污染的大豆土壤上接種根瘤菌后土壤中自由固氮細菌（寡養(yǎng)細菌）數(shù)量增加，土壤nifH固氮菌的基因豐度提高[30?31]。本研究中菌株Sinorhizobiumsp.W16 的接種較好地緩解了氟磺胺草醚對大豆?根際系統(tǒng)中土壤固氮微生物的限制，使根際土壤nifH基因豐度恢復至未施用氟磺胺草醚的對照水平，增強了微生物固氮潛力。大豆根瘤固氮酶活性是衡量大豆固氮能力的一個重要指標[32]。本研究中450 g·hm?2和1 125 g·hm?2氟磺胺草醚的施用顯著抑制了根瘤生物量和根瘤固氮酶活性，導致大豆?根瘤菌共生固氮受限，但接種Sinorhizobiumsp.W16 后顯著緩解了氟磺胺草醚對大豆根瘤固氮酶活性的抑制，在盛莢期R4 時可恢復至與對照相近水平，提升了大豆共生固氮潛力。MOORMAN 等[33]認為根瘤固氮酶活性受限主要是由于除草劑抑制了作物的光合作用以及根系的生長。除草劑的施用又會導致根瘤中同化產物供應不足、根瘤血紅蛋白下降，從而降低根瘤固氮酶活性[34?35]。

3.3 氟磺胺草醚及其降解菌對土壤及大豆氮素累積的影響

本研究發(fā)現(xiàn)與未施用除草劑相比，氟磺胺草醚的施用限制了土壤有效氮素的累積，降低了土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量。在培養(yǎng)期內，土壤銨態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢，這可能是由于在鼓粒期R6前，土壤nifH基因豐度的增加以及大豆根瘤固氮酶活性和土壤脲酶活性受到刺激，增強生物固氮潛力，增加尿素水解，提高土壤中有效氮素的供應，而在生長后期大豆對氮素需求降低，土壤硝化作用開始增強。土壤中硝態(tài)氮含量隨大豆生物量增加而不斷下降，這可能是由于一部分土壤硝態(tài)氮被大豆吸收利用。而接種Sinorhizobiumsp.W16 后土壤脲酶活性、土壤AOA 和AOB 基因豐度顯著增加，從而提升了土壤中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量，增加土壤有效氮素的累積。這與GORICA 等[31]接種根瘤菌及共生固氮細菌后土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量增加結果一致。與FENG 等[36]在華南低磷酸土壤上接種根瘤菌提升土壤氮素狀況的結果相近。

大豆植株氮素積累是產量形成的基礎，土壤中氮素的變化又直接影響著大豆氮素累積量。氟磺胺草醚一定程度上限制了大豆?根際系統(tǒng)的生物固氮，導致大豆全氮含量下降。而接種Sinorhizobiumsp.W16降解菌后，大豆全氮含量增加達24.93%，這一方面受益于接菌有效降解了土壤中氟磺胺草醚的殘留，緩解了除草劑殘留對大豆生長的抑制，另一方面接菌提升了大豆?根際系統(tǒng)的固氮潛力，增加了土壤中有效氮素的供應。由此可見，接種氟磺胺草醚降解菌Sino?rhizobiumsp.W16 有利于大豆氮累積，促進大豆生長發(fā)育。

4 結論

（1）氟磺胺草醚施用劑量（以有效成分計）達到或超過450 g·hm?2時會顯著抑制大豆根生物量和根瘤固氮能力，同時顯著降低根際土壤nifH基因豐度，導致大豆根際生物固氮受限。土壤脲酶活性、土壤氮循環(huán)相關微生物功能基因豐度受氟磺胺草醚影響逐漸降低又造成了土壤有機氮素轉化受限，從而影響大豆生長。

（2）從大豆根瘤中分離獲得的一株氟磺胺草醚降解根瘤菌Sinorhizobiumsp.W16，其不僅有效地降低了氟磺胺草醚的殘留量，還緩解了氟磺胺草醚對大豆?根際系統(tǒng)的土壤有機氮素轉化，提升了大豆?根際系統(tǒng)中生物固氮能力，較好恢復了大豆植株生長。Sinorhizobiumsp.W16 降解菌在氟磺胺草醚污染土壤修復上具有較好的應用前景。