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    基于廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)與近紅外技術(shù)的高低油酸花生鑒評(píng)

    2022-01-24 08:55:12鄧權(quán)清洪彥彬李海芬梁炫強(qiáng)王潤(rùn)風(fēng)李少雄陳小平
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:油酸代謝物組學(xué)

    鄧權(quán)清,魯 清,劉 浩,洪彥彬,李海芬,梁炫強(qiáng),王潤(rùn)風(fēng),李少雄,陳小平

    (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

    【研究意義】花生(Arachis hypogaeaL.)是一種世界性的油料和蛋白質(zhì)作物,也是我國(guó)四大油料作物之一,其單產(chǎn)和總產(chǎn)長(zhǎng)期居油料作物之首[1]。近年來(lái),我國(guó)花生食品加工發(fā)展迅速,除了傳統(tǒng)食用植物油和副食品外,還開(kāi)發(fā)出極具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的花生營(yíng)養(yǎng)健康產(chǎn)品[2]。油酸是單不飽和脂肪酸,有較高的氧化穩(wěn)定性,能有效預(yù)防心血管疾?。?-3]。高油酸花生(油酸含量>50%)突出的保健作用與經(jīng)濟(jì)效益,使得選育高油酸花生品種成為國(guó)內(nèi)花生品質(zhì)改良育種的目標(biāo)之一[3]。與其他植物油相比,高油酸花生油具有貨架期長(zhǎng)、不飽和脂肪酸含量高(如油酸與亞油酸含量占油脂80%)、無(wú)豆腥和不含植物芥酸等特點(diǎn),越發(fā)受到花生榨油企業(yè)與消費(fèi)者青睞[4]。脂質(zhì)作為花生油脂的主要成分,其代謝物的轉(zhuǎn)化、合成與降解過(guò)程能夠動(dòng)態(tài)地影響著花生油脂的品質(zhì)[5]。然而,由于脂質(zhì)種類(lèi)多(其中主要成分為甘油三酯混合物),分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,現(xiàn)階段鮮有對(duì)花生脂質(zhì)準(zhǔn)確定性定量的研究[6-7]。因此,探索一種能甄別品種與鑒評(píng)品質(zhì)的檢測(cè)方法,不僅能提高花生育種效率,還能為食品安全提供有效分析手段。

    【前人研究進(jìn)展】花生栽培種屬于異源四倍體豆科作物,與其他模式作物相比,花生的基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱[8]?;ㄉ贩N鑒定主要通過(guò)形態(tài)特征和表型觀察,該法可靠性差、難以批量化操作[9]。隨著分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)在作物育種中普遍應(yīng)用,花生種質(zhì)也開(kāi)發(fā)出大量的分子標(biāo)記,如SSR、AFLP、RAPD 和RFLP 等[10-13],但由于這些分子標(biāo)記特異性與重復(fù)性欠佳,導(dǎo)致分析結(jié)果可能有所差異。此外,植物油脂的質(zhì)量鑒定主要通過(guò)檢測(cè)脂肪酸的含量與成分,即脂肪酸分析水平[7]。近年來(lái),油脂研究人員對(duì)脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與組成的研究愈發(fā)深入,直接推動(dòng)植物油脂檢測(cè)提升至脂質(zhì)分子層面[6-7]。

    【本研究切入點(diǎn)】脂質(zhì)組學(xué)是通過(guò)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLCMS/MS)技術(shù)對(duì)所有內(nèi)源性高豐度的脂質(zhì)分子進(jìn)行定性定量分析,從而更直觀地了解生物體內(nèi)各種脂質(zhì)代謝與合成的機(jī)理[6]。而應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)(Near infrared spectroscopy,NIRS)能夠準(zhǔn)確快速、批量化與標(biāo)準(zhǔn)化地測(cè)定這些花生品質(zhì)指標(biāo)[4]。本研究所利用得廣泛靶向脂質(zhì)代謝組技術(shù)綜合傳統(tǒng)靶向與非靶向代謝組檢測(cè)方法,通過(guò)檢測(cè)平臺(tái)的自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB(Metware database)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù),與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的手段研究樣品間的脂質(zhì)組差異[14-16]。同時(shí),將脂質(zhì)與蛋白質(zhì)含量作為考察花生品質(zhì)的主要指標(biāo)[2]。

    【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)利用廣泛靶向脂質(zhì)代謝組分析技術(shù)獲得高油酸花生與普通花生的核心差異脂質(zhì)代謝物,結(jié)合近紅外標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的品質(zhì)指標(biāo),運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)而聚類(lèi)生成可視化的特征圖譜,最終實(shí)現(xiàn)從表型與脂質(zhì)分子層面鑒評(píng)花生品種。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試材料選取兩個(gè)高、低油酸花生品種,高油酸品種開(kāi)農(nóng)1715(KN1715)、低油酸品種冀花7 號(hào)JH7H。試驗(yàn)材料于2020 年秋季(7—11 月)種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地(113′ 44″E,23′ 39″N)。田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每小區(qū)種植36 株(6 行×6 列),行株間距20 cm,3 次重復(fù)。收獲時(shí),每個(gè)花生品種隨機(jī)選取15 株進(jìn)行表型數(shù)據(jù)收集與廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)檢測(cè)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 參照魯清等[17]的方法,農(nóng)藝性狀檢測(cè)指標(biāo)包括主莖長(zhǎng)、第一側(cè)枝長(zhǎng)、單株果數(shù)、單株飽果數(shù)、百果重、百仁重,并計(jì)算單株飽果率、單株秕果率與出仁率。

    1.2.2 品質(zhì)性狀分析 花生收獲后,清洗成熟的花生莢果,去除表面泥土,40 ℃烘干脫水后,使用近紅外谷物分析儀DA7250(Perten,瑞典)對(duì)種子進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè),其中脂質(zhì)指標(biāo)包括脂肪(Fat)、油酸(Oleic acid,CHO)、亞油酸(Linoleic acid,CLA)、油酸/ 亞油酸含量比值(CHO/CLA)、棕櫚酸(Palmitic acid)、硬脂酸(Stearic acid)、花生酸(Arachidic acid)、山崳酸(Docosanoic acid)、二十四烷酸(Lignoceric acid),蛋白指標(biāo)包括蛋白質(zhì)(Protein,Pr)、氨基酸(Amino acid,AA)、蘇氨酸(Threonine,Thr)、纈氨酸(Valine,Val)、蛋氨酸(Methionine,Met)、異亮氨酸(Isoleucine,Ile)、亮氨酸(Leucine,Leu)、苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)、賴(lài)氨酸(Lysine,Lys)、組氨酸(Histidine,His)、精氨酸(Arginine,Arg)、脯氨酸(Proline,Pro)[4]。

    1.2.3 廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)分析 將烘干脫水后的花生種子(各品種3 個(gè)重復(fù))用研磨儀研磨(30 Hz、1.5 min)至粉末狀;準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg 粉末,用1 mL 脂質(zhì)提取液提??;渦旋2 min,超聲5 min,加入500 μL 水;40 ℃,12 000 r/min 離心,吸取上清液500 μL 于1.5 mL 離心管中,真空冷凍干燥(VIRTIS,美國(guó))濃縮,復(fù)溶后0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,保存于進(jìn)樣瓶中。后續(xù)的UPLCMS/MS 檢測(cè)與分析委托邁維(武漢)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

    1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    花生農(nóng)藝與品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并利用GraphPad Prism 軟件繪圖。品種間采用成對(duì)T 檢驗(yàn),使用SPSS 21 版軟件進(jìn)行。廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)的多元分析,如熱圖、火山圖、排序圖(Patterns hunter),主成分分析(Principal component analysis,PCA),偏最小二乘-判別分析PLS-DA(Partial least squaresdiscriminant analysis,PLS-DA)和得分圖通過(guò)MetaboAnalyst 軟件(http://www.metaboanalyst.ca)與圖圖云平臺(tái)(https://www.cloudtutu.com/)進(jìn)行[18]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高、低油酸花生品種農(nóng)藝性狀比較

    比較分析結(jié)果(圖1)表明,高、低油酸花生品種的農(nóng)藝性狀差異顯著,其中高油酸品種KN1715 的主莖、第一側(cè)枝長(zhǎng)度比低油酸品種JH7H 分別高11.72%和33.74%(圖1A、B),差異顯著;除單株秕果率外,KN1715 的單株果數(shù)、單株飽果率、百果重、百仁重與出仁率比JH7H 分別低46.23%、5.02%、5.35%、11.68% 和17.17%(圖1C~H),差異顯著。

    圖1 高、低油酸花生的農(nóng)藝性狀Fig.1 Agronomic traits of high and low oleic acid peanuts

    2.2 高、低油酸花生品質(zhì)性狀比較

    由表1 可知,脂質(zhì)指標(biāo)中,KN1715 的油酸/亞油酸含量比值為JH7H 的8.79 倍,油酸、硬脂酸、花生酸含量比JH7H 分別高102.71%、25.00%、15.33%,但亞油酸、棕櫚酸、山崳酸、二十四烷酸含量分別低76.83%、18.83%、17.67%、23.64%,差異均達(dá)顯著水平;蛋白指標(biāo)中,與JH7H 相比,KN1715 的蛋白質(zhì)、氨基酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸與脯氨酸含量分別高16.35%、16.89%、16.47%、23.81%、17.54%、17.19%、18.63%、19.03%、19.81%、13.85%,差異顯著(表2)。

    表1 高、低油酸花生種子脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量Table 1 Contents of lipid-related indexes of high and low oleic peanut seeds(%)

    表2 高、低油酸花生種子蛋白相關(guān)指標(biāo)含量Table 2 Contents of protein-related indexes of high and low oleic peanut seeds(%)

    2.3 高、低油酸花生脂質(zhì)組學(xué)特征

    基于KN1715 與JH7H 的廣泛靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化數(shù)據(jù)分析,從而顯示出兩品種的總樣本特征(圖2)。熱圖結(jié)果表明,在兩個(gè)品種的種子中均鑒定出16 類(lèi)295 種脂質(zhì)代謝物,且兩品種間脂質(zhì)代謝物含量差異明顯(圖2A)。此外,各品種的3 個(gè)生物重復(fù)均能分別聚類(lèi),說(shuō)明得到的數(shù)據(jù)重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)。火山圖根據(jù)差異倍數(shù)(Fold change,F(xiàn)C≥2,P≤0.05)進(jìn)一步篩選差異代謝物,結(jié)果表明,KN1715 中含量比JH7H 高的脂質(zhì)代謝物有90 種,比JH7H低的有114 種,無(wú)差異的有91 種(圖2 B)。

    初步可視化結(jié)果(圖2)表明,高、低油酸花生品種中存在核心差異脂質(zhì)代謝物。為了進(jìn)一步分析KN1715 與JH7H 的脂質(zhì)代謝物變化規(guī)律,以顯著差異的測(cè)試數(shù)據(jù)為自變量進(jìn)行PCA 分析和偏最小PLS-DA 分析,以進(jìn)一步展現(xiàn)脂質(zhì)代謝測(cè)試數(shù)據(jù)的一致性,同時(shí)確定兩個(gè)品種分離的關(guān)鍵代謝物。同時(shí),以PLS-DA 變量投影重要度(Variable importance in projection,VIP)衡量各測(cè)定指標(biāo)對(duì)各組樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力,從而輔助關(guān)鍵指標(biāo)的篩選(通常以VIP 值>1.0 作為篩選標(biāo)準(zhǔn))。PCA 分析結(jié)果(圖3 A)表明,所有測(cè)定指標(biāo)降維為2 個(gè)主成分,分別為PC1 和PC2 方差百分比為99.4%和0.6%,其中PC1 可以很好地表征所有測(cè)定指標(biāo)99.4%的信息;PLS-DA 分析(圖3 B)則降維出2 個(gè)變量,即變量1(99.4%)和變量2(0.6%),其中變量1 也可以很好地表征所有測(cè)定指標(biāo)99.40%的信息。從圖3 C、D 可以看出,PCA 與PLS-DA分析結(jié)果均可以將KN1715、JH7H 的脂質(zhì)代謝物完全分離為兩組,根據(jù)PLS-DA 分析的變量1生成VIP 得分圖進(jìn)一步分析,以量化測(cè)定參數(shù)對(duì)兩個(gè)品種分離的貢獻(xiàn)。從圖3 E 可以看出,兩個(gè)品種中存在3 類(lèi)(即甘油二酯DG 3.10%、甘油三酯TG 93.80%、磷脂酰膽堿PC 3.10%)31 種脂質(zhì)代謝物的VIP 值>1.0,說(shuō)明這31 種脂質(zhì)代謝物是形成兩品種分離的核心差異脂質(zhì)代謝物。

    圖2 高、低油酸花生的脂質(zhì)組學(xué)總樣本特征Fig.2 Total sample characteristics of lipidomics of high and low oleic acid peanuts

    圖3 脂質(zhì)代謝物的PCA 與PLS-DA 分析及PLS-DA 分析變量1 的VIP 得分Fig.3 PCA and PLS-DA analysis of lipid metabolites and variable importance in projection(VIP)to the component 1 of PLS-DA

    2.4 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的特征譜及其相關(guān)性

    通過(guò)31 種脂質(zhì)組核心差異代謝物與標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析,可以得到鑒定花生品種的可視化脂質(zhì)組特征圖譜(圖4)。圖4結(jié)果顯示,脂質(zhì)代謝物與品質(zhì)指標(biāo)在KN1715 與JH7H 兩個(gè)高、低油酸品種間具有明顯的差異,在KN1715 中,有19 種脂質(zhì)分子含量顯著上調(diào),其余12 種則相反,這也可作為區(qū)分高油酸花生與普通花生的特異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物。

    圖4 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的特征譜Fig.4 Characteristics mapping for core differential lipidomics metabolites and the quality indexes

    對(duì)脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析,既可進(jìn)一步探索代謝物與表型的關(guān)系,也佐證脂質(zhì)組核心差異代謝物。圖5A 結(jié)果表明,高油酸花生品種代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性熱圖,紅、藍(lán)與白分別表示正、負(fù)、無(wú)相關(guān)性,其顏色越深相關(guān)性越強(qiáng)。由于KN1715 與JH7H 分別為高、低油酸品種,故重點(diǎn)關(guān)注與油酸相關(guān)的指標(biāo)。由圖5 可知,油酸與部分指標(biāo)(LIPID-P-0860、LIPID-P-0861、LIPID-P-0795、LIPID-P-0796、LIPID-P-0157、LIPID-P-0797、LIPID-P-0881、LIPID-P-0879、LIPID-P-0869、LIPID-P-0804、LIPID-P-0822、CHO/CLA、LIPID-P-0817、LIPID-P-0931、LIPID-P-0814、LIPID-P-0812、LIPID-P-0329、LIPID-P-0807、LIPID-P-0932、LIPID-P-0803、硬脂酸C18:0、花生酸、Met、Phe、Arg、Pro、Ile、AA、Leu、His、Pr、Val)之間存在顯著正相關(guān),與Fat、Thr、Lys 及兩各品種均無(wú)顯著相關(guān)性外,與其他指標(biāo)之間則存在顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)而對(duì)所有與油酸密切相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行分類(lèi)排序,根據(jù)相關(guān)系數(shù)>0.5 進(jìn)行選擇,與油酸相關(guān)性由強(qiáng)到弱排序的結(jié)果見(jiàn)圖5 B。

    圖5 脂質(zhì)組核心差異代謝物與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性熱圖(A)及與油酸相關(guān)的指標(biāo)排序圖(B)Fig.5 Heat map(A)for core differential lipidomics metabolites and the quality indicators,and the top indexes correlated with oleic acid(B)

    3 討論

    本研究首次利用近紅外光譜技術(shù)與廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué),基于高、低油酸花生的品質(zhì)指標(biāo)與種類(lèi)繁多的脂質(zhì)分子的原始數(shù)據(jù),通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析,最終獲得品種鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)兼?zhèn)涞谋硇团c脂質(zhì)分子特征圖譜,以及篩選高油酸花生特異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物。目前,近紅外光譜技術(shù)作為一種無(wú)損、快速、低成本的檢測(cè)技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定與選育[19]、作物品質(zhì)評(píng)價(jià)[20]和食用植物油脂與油料品質(zhì)檢測(cè)[21]。本研究結(jié)果顯示,油酸與亞油酸含量成反比,這與禹山林等[22]最先利用近紅外技術(shù)測(cè)定花生的油脂與蛋白質(zhì)含量的結(jié)果類(lèi)似。本研究中,基于近紅外光譜檢測(cè)到的物質(zhì)均是脂肪酸水平的脂質(zhì)代謝物。而花生油作為廣東省主要的食用油之一,其不斷增加的市場(chǎng)需求,導(dǎo)致不良商家使用不健康或較便宜的油進(jìn)行摻假,而摻假物與純花生油脂的光譜非常相似,因此,研制能識(shí)別和量化相應(yīng)摻假物的通用、可靠的分析方法是今后研究的重要方向[23]。

    脂質(zhì)組學(xué)主要的研究對(duì)象是較高豐度的內(nèi)源性脂質(zhì)代謝物,而且其普遍采用的研究手段是UPLC-MS/MS 技術(shù),使得該技術(shù)天然具備高穩(wěn)定與高精度屬性。因此,廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)成功應(yīng)用于不同領(lǐng)域,如長(zhǎng)鏈脂肪酸的生物合成與棉纖維發(fā)育[24]、植物細(xì)胞表面脂質(zhì)鹽受體[25]。本研究使用UPLC-MS/MS 廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)對(duì)2 個(gè)油酸差異顯著的花生品種進(jìn)行分析,經(jīng)過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析最終得到3 類(lèi)31 種核心差異脂質(zhì)分子,即甘油三酯(93.80%)、甘油二酯(3.10%)和磷脂酰膽堿(3.10%)。甘油三酯作為植物油脂的主要成分,在植物脂質(zhì)代謝途徑中起到關(guān)鍵作用[26],而甘油三酯的功能決定于其骨架結(jié)構(gòu)上的脂肪酸種類(lèi)[7],這也是本研究中31 種核心差異脂質(zhì)代謝物的來(lái)源。此外,近年來(lái)多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種與生理生化等機(jī)理研究[27-28],本研究利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)花生表型組與脂質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行集成分析,并初步獲得與油酸含量相關(guān)的表型與脂質(zhì)組指標(biāo),這些結(jié)果將為揭示花生脂質(zhì)合成與代謝機(jī)制提供研究思路與理論依據(jù)。

    4 結(jié)論

    本研究分析了成熟期高、低油酸花生KN1715 與JH7H 的表型性狀(農(nóng)藝與品質(zhì)性狀)與脂質(zhì)組的差異。就表型性狀而言,KN1715 的主莖、第一側(cè)枝長(zhǎng)度、油酸、硬脂酸、花生酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸與脯氨酸含量顯著高于JH7H;就脂質(zhì)組而言,兩品種間存在較大的差異,共篩選到16 類(lèi)295 種脂質(zhì)分子,進(jìn)一步通過(guò)對(duì)差異代謝物多元統(tǒng)計(jì)分析,最終篩選到3 類(lèi)31 種核心差異脂質(zhì)分子,其在花生品種鑒定起到關(guān)鍵作用。另外,本研究集成近紅外與廣泛靶向脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),獲得KN1715 與JH7H的可視化脂質(zhì)組特征圖譜,建立從品質(zhì)表型與脂質(zhì)分子層面進(jìn)行花生品種鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)的新型分析方法。

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