燙傷模型的制備及對(duì)燙傷藥膏治愈和鎮(zhèn)痛藥效的驗(yàn)證

孫冰雪，李曉慧，崔佳潤(rùn)，吳凌宇，張大維*

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

燒燙傷是一種臨床上常見的疾病，一旦發(fā)生會(huì)給患者帶來(lái)極大的身心傷害，嚴(yán)重的威脅著人類的健康[1]。燙傷的損傷一般發(fā)在體表，但反應(yīng)在全身，燙傷愈重，反應(yīng)愈烈，是危險(xiǎn)人類健康的重要傷病之一[2]。燙傷會(huì)破壞皮膚天然屏障，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙甚至喪失血液灌注，同時(shí)造成局部營(yíng)養(yǎng)缺乏，全身免疫力下降，為細(xì)菌入侵創(chuàng)造良好條件[3]。創(chuàng)面感染傷常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)病急、進(jìn)展快，繼續(xù)惡化可引起膿毒癥（sepsis）、膿毒性休克（septic shock）、多器官功能障礙綜合征（MODS），甚至死亡[4]。

燙（凍）傷藥膏具有祛腐排膿、修復(fù)組織、生肌斂口、增強(qiáng)免疫、清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛的功效[5-6]。本研究通過建立豚鼠燙傷模型，對(duì)雌性小鼠進(jìn)行熱板致痛試驗(yàn)，從而驗(yàn)證燙傷膏修復(fù)組織，消腫止痛的效果[7]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)白化豚鼠（SYXK（吉）2016-0004）雌性，共計(jì)42只，在普通級(jí)環(huán)境設(shè)施下飼養(yǎng)（SYXK（吉）2017-0003），SPF級(jí)雌性ICR小鼠（SYXK（吉）2016-0003）60只，在屏障環(huán)境設(shè)置下飼養(yǎng)（SYXK（吉）2018-0001）。

1.1.2 材料和儀器 燙（凍）傷藥膏（品牌為“六箴堂張氏”），陽(yáng)性對(duì)照燙傷膏（品牌為美寶），凡士林（無(wú)添加藥用），硫化鈉，戊巴比妥鈉，酒精，無(wú)菌紗布，生理鹽水，注射器。數(shù)顯恒溫水浴鍋，精密電子天平（型號(hào)FA2204B），麻醉操作臺(tái)，秒表，游標(biāo)卡尺，玻璃燒杯。

1.2 方法

1.2.1 燙傷模型的建立 1）普通級(jí)白化雌性豚鼠42只，體質(zhì)量400～450 g，隨機(jī)分成6組，每組7只。2）試驗(yàn)前，用6% 硫化鈉給豚鼠背部脫毛，約6 cm2。3）飼養(yǎng)24 h后，給豚鼠腹腔注射戊巴比妥那麻醉，計(jì)量1 mL·kg-1。4）將脫毛處的皮膚消毒后，將直徑為2 cm的4個(gè)50 g的砝碼放到90 ℃水浴箱內(nèi)加熱30 min，立即拿出來(lái)放到豚鼠背部9 s，形成深Ⅱ度燙傷模型[8]。

1.2.2 燙傷分級(jí) 1）Ⅰ度燒燙傷：表現(xiàn)為受傷處皮膚輕度紅、腫、熱、痛，感覺過敏，無(wú)水泡；2）淺Ⅱ度燒燙傷：表現(xiàn)為受傷處皮膚疼痛劇烈、感覺過敏，有水泡，水泡撥離后可見創(chuàng)面均勻發(fā)紅、潮濕、水腫明顯；3）深Ⅱ度燒燙傷：表現(xiàn)為受傷皮膚痛覺較遲鈍，可有或無(wú)水泡，基底蒼白，間有紅色斑點(diǎn)，拔毛時(shí)可感覺疼痛；4）Ⅲ度燒燙傷：皮膚感覺消失，無(wú)彈性，干燥，無(wú)水泡，蠟白、焦黃或碳化，拔毛時(shí)無(wú)疼痛[9]。

1.2.3 模型動(dòng)物分組 分籠飼養(yǎng)燙傷24 h后，在不同組燙傷部位涂相應(yīng)的藥物，凡士林、市售燙傷膏、燙傷膏組（高劑量為原膏，中劑量為膏與凡士林對(duì)半混合；低劑量為中劑量和凡士林對(duì)半混合），模型組只做包扎處理，連續(xù)給藥飼養(yǎng)20 d左右[10]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1）每日觀察豚鼠傷口的變化情況，并拍照記錄。2）創(chuàng)面愈合面積：造模 24 h、4 d、7 d、11 d、14 d、18 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量創(chuàng)面橫長(zhǎng)和豎長(zhǎng)，計(jì)算創(chuàng)面面積和愈合百分率，以傷后24 h面積作為燙傷面積[11]。

隔3 d 測(cè)量1次各組動(dòng)物體質(zhì)量觀察燒傷后各組動(dòng)物體重變化。采用描記稱重法測(cè)定豚鼠燙傷后24 h、4 d、7 d、11 d、14 d、18 d各組取3只鼠的創(chuàng)面愈合率。用透明方格紙描繪出不同時(shí)間創(chuàng)面，剪下后稱重量，以重量代替面積，創(chuàng)面愈合率（%）=（燙傷面積－各時(shí)相點(diǎn)面積）÷燙傷面積×100%。3）病理切片觀察：當(dāng)日豚鼠每組隨機(jī)取1只,取豚鼠脊柱兩邊燙傷部位組織，做病理檢測(cè)，鑒定燙傷級(jí)別，確定造模是否成功；7 d、14 d、21 d每組取2只做病理，鑒定傷口愈合情況（每只豚鼠取燙傷部位兩邊，燙傷中間和邊緣也各自取樣）[12]。

1.4 燙傷膏的鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

雌性小鼠熱板致痛的影響。1）試驗(yàn)小鼠預(yù)選：室溫下放入已預(yù)熱到 （55±0.5）℃恒溫水浴鍋中的500 mL 玻璃燒杯中，記錄小鼠后腳接觸杯底到舔后足為止的時(shí)間，作為痛閾指。按法測(cè)定2次間隔 30 min取平均值為給藥前痛閾值，挑選5 s～30 s反應(yīng)敏感穩(wěn)定的小鼠用于試驗(yàn)[13]。2）60只體質(zhì)量（20±5） g的ICR小白鼠，按給藥前痛閾值分層隨機(jī)分成凡士林、低中、燒傷膏濕潤(rùn)燒傷膏 5 組，每組 10 只，分別于每鼠4個(gè)足跖涂以上藥物，每只0.2 g[14-15]。3）30 min后測(cè)痛閾值，60 min、90 min、120 min 的痛閾值給藥后痛反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)1倍以上者具有有效鎮(zhèn)痛作用，比較給藥前后痛閾的變化[16-17]。計(jì)算各組痛閾提高百分率：痛閾提高百分率=（給藥后平均痛閾值÷給藥前各組平均痛閾值）/給藥前各組平均痛閾值× 100%

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPASS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠燙傷模型愈合情況結(jié)果

2.1.1 燙傷部位愈合面積 5月5日開始進(jìn)行燙傷試驗(yàn)，記錄燙傷面積，每天涂藥，隔3 d記錄1次燙傷部位面積，燙傷部位各組愈合情況見表1。與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，低劑量燙傷膏對(duì)燙傷的愈合效果最為顯著，明顯高于中、高劑量組；相比較于市售的燙傷膏，燙傷膏低劑量組燙傷面積在5月18日明顯的變小，愈合效果最明顯，證明燙傷膏確實(shí)有愈合燙傷的功效，且低劑量時(shí)候的效果最為顯著。

表1 各組豚鼠燙傷部位愈合情況明細(xì)（n= 7） cm2

2.1.2 燙傷豚鼠病理結(jié)果 選取燙傷后不同時(shí)間階段的燙傷豚鼠，進(jìn)行燙傷部位HE染色切片的病理檢測(cè)見圖1。

圖1 各組HE染色切片病理圖

2.1.3 病理切片結(jié)果 低、中、高燙傷膏組5月14日時(shí)出現(xiàn)肉芽組織，開始恢復(fù)，且低劑量組恢復(fù)速度快，市售燙傷膏組5月21日前恢復(fù)效果不如低劑量燙傷膏，凡士林組。各組切片病理統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 各組豚鼠燙傷模型病理組織變化情況（n= 7）

根據(jù)豚鼠切片統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，燙傷膏低、中、高劑量，市售燙傷膏和凡士林小鼠在5月14日燙傷情況均有愈合，且燙傷膏低劑量組愈合效果最顯著，與市售燙傷膏效果基本一致。

2.2 燙傷膏小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 對(duì)小鼠進(jìn)行靈敏度測(cè)試 置于熱板上記錄2次舔腳趾時(shí)間，結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠靈敏度篩選情況（n= 10） s

小鼠熱板試驗(yàn)，2次舔腳趾?jiǎn)为?dú)時(shí)間及的平均時(shí)間都維持在5～30 s之間的小鼠靈敏度符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，上述6組小鼠符合試驗(yàn)要求。

2.2.2 分組進(jìn)行小鼠熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 測(cè)定痛閾值，結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠熱板測(cè)定痛閾值鎮(zhèn)痛情況（n= 10）

小鼠給藥前的痛閾值基本處于一致狀態(tài)，給藥后，各組的痛閾值基本呈現(xiàn)一個(gè)增大的趨勢(shì)，在90 min時(shí)達(dá)到最高，且低劑量組值最高，與市售燙傷膏的效果基本一致，即鎮(zhèn)痛效果最明顯；給藥在給藥30 min左右時(shí)，香油組的痛閾值最高，凡士林組最低，在90 min的時(shí)候，香油組的痛閾值便低于低、中、高劑量組，說明香油具有鎮(zhèn)痛效果，但是維持時(shí)間短。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用恒溫水浴鍋和砝碼燙傷豚鼠背部制成深Ⅱ度燙傷模型[16]。通過測(cè)量不同時(shí)間段的燙傷面積，可以直觀反映燙傷膏對(duì)燙傷的治愈情況[17]。不同時(shí)間段的組織病理學(xué)變化，反映受損組織各層皮膚的炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度和愈合情況，直接反映藥物的療效[18]。小鼠的熱板陣痛試驗(yàn)，能夠反應(yīng)燙傷藥膏起到的鎮(zhèn)痛作用[19]。

根據(jù)豚鼠燙傷模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示燙傷膏確實(shí)能夠?qū)C傷起到一定的治療效果，且在低劑量使用的情況下效果最為顯著[21]；組織病理學(xué)的變化也從分子角度證實(shí)了燙傷藥膏的效果，低劑量組的豚鼠炎細(xì)胞的浸潤(rùn)程度及愈合情況最佳[22]；小鼠的熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，利用小鼠對(duì)熱應(yīng)激的反映速度，發(fā)現(xiàn)在90 min時(shí)候，燙傷膏低劑量鎮(zhèn)痛效果最好，高于其他各組，證實(shí)了低劑量燙傷藥膏對(duì)燙傷處具有消炎鎮(zhèn)痛的效果，進(jìn)一步證實(shí)了燙傷膏的藥效[23]。

4 結(jié)論

1）成功的構(gòu)建了豚鼠燙傷模型，用于驗(yàn)證燙傷類藥物愈合效果的驗(yàn)證。2）由豚鼠燙傷模型試驗(yàn)得出，該燙傷藥膏（六箴堂張氏）確實(shí)有愈合燙傷患處的功效，且低劑量燙傷膏時(shí)候效果最佳，比普通市售燙傷膏治愈效果更顯著。3）通過小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)得出使用低劑量燙傷膏對(duì)燙傷處的鎮(zhèn)痛效果最好，較于市售燙傷膏效果基本一致。4）該燙傷膏低劑量的使用具有與市售燙傷膏同樣的愈合和鎮(zhèn)痛效果。