建立兔VX2肝癌模型及血管介入操作方法

武自強 魏 寧 周春澤 魯 東

各類無法切除的肝臟惡性腫瘤，往往是晚期癌癥患者的致死原因，控制肝臟腫瘤進展可有效延長生存期。當前，以血管介入為核心的微創(chuàng)診療技術(shù)仍是提高肝癌局部控制率的重要選擇。肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）、肝動脈化療灌注術(shù)（HAIC）和門靜脈栓塞術(shù)（PVE）的應(yīng)用，無論在姑息治療還是轉(zhuǎn)化橋接治療方面，都取得了肯定的療效。兔VX2肝癌模型是論證介入治療新方法的常用動物模型。本文對本中心既往動物實驗得失進行總結(jié)，為初學者展現(xiàn)建立穩(wěn)定兔VX2肝癌模型和血管介入操作方法細節(jié)。

1 材料與方法

1.1 瘤株及實驗動物 兔VX2腫瘤細胞懸液5 mL及健康新西蘭大白兔共80只，均由中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供（動物檢驗合格證明編號:3203254925）。兔VX2腫瘤細胞懸液以液氮低溫保存。新西蘭大白兔雌雄不限，育齡大于6個月，體質(zhì)量2.8～3.5 kg，普通飼養(yǎng)于動物實驗中心，10只用于載瘤傳代，70只用于建立肝癌模型或介入操作。本實驗通過倫理委員會審批，編號為：LLSC 20190745。

1.2 建立兔VX2載瘤模型 首先將低溫保存的腫瘤細胞懸液試管置入37 ℃恒溫箱中水浴解凍15 min，再離心5 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定150～200 r/min，離心后去除上清液，若仍有雜質(zhì)，可使用生理鹽水沖洗后再重復(fù)上述步驟，最后使用5 mL注射器抽取懸液約2 mL，直接注射于兔后肢大腿外側(cè)肌肉豐富處皮下，2～3周后可觸及質(zhì)韌腫塊，載瘤模型即可使用。

1.3 建立兔VX2肝癌模型 載瘤兔以水合氯醛（1.0 mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈滴注全麻固定后，目標部位進行消毒鋪巾，逐層將皮膚和皮下的瘤體切開，剝離其后肢外側(cè)的瘤體，剪取腫瘤的邊緣呈“魚肉樣”組織若干，置入20 mL生理鹽水試管中，使用眼科剪將瘤塊剪碎成直徑1～2 mm大小。實驗兔用相同的方法全麻，仰臥位固定在操作平面板上，腹部皮膚備皮后消毒鋪巾，行劍突下偏左2 cm的縱行切口，切口處配合利多卡因局麻，逐層切割，鈍性分離腹直肌，暴露肝臟。輕壓上腹兩側(cè)或切口下方，即可擠出肝左葉，以18G穿刺針刺入肝左內(nèi)葉深部約1 cm，用針芯推入制備好的瘤塊3～5個，再以1 mm×10 mm自制明膠海綿條1枚封堵穿刺道，退出穿刺針后先確認無出血后再回納肝臟，最后將切口縫合。術(shù)后使用頭孢或青霉素20萬U連續(xù)肌注3天以預(yù)防感染。

1.4 MRI檢查 所有動物模型建立后均進行MRI多序列掃描（采用美國GE公司的GEDX3.0T超導型磁共振成像系統(tǒng)和人用膝關(guān)節(jié)線圈）。掃描前應(yīng)禁食48 h，禁水至少12 h。全麻后使用自制器具仰臥位固定。先是采用SE 序列行T1WI成像（Tr/Te=540 ms/7.1 ms，層間距設(shè)定為1.0 mm，層厚設(shè)定為4.0 mm，矩陣選擇352×192，視野為14 cm×14 cm，Nex為4，成像持續(xù)時間90 s）。再 次 采 用 FSE 序 列 行T2WI成 像（Tr/Te=3180 ms/86.7 ms，層厚和間距參數(shù)不變，視野固定為14 cm×14 cm，矩陣選擇320×256，Nex為4，成像持續(xù)時間 90s ）。隨后我們采用 EPI序列進行DWI成像（Tr/Te=3000 ms/76.6 ms，b值為0及800 s/mm，F(xiàn)OV 20×15，激發(fā)次數(shù)8，掃描時間為50 s）。最后行增強掃描，經(jīng)耳緣靜脈注射釓噴替酸葡甲胺（1 mL/kg）后20 s開始掃描。完整檢查后，每例動物模型均能得到肝臟腫瘤T1WI、T2WI、DWI、ADC和動脈期增強影像資料。

1.5 肝動脈插管及造影術(shù) 實驗兔全麻后固定于DSA手術(shù)床上。術(shù)前首先進行局部無菌手術(shù)準備，于右側(cè)股動脈搏動處平行表皮紋路切開皮膚，鈍性分離肌肉，輕柔暴露股動脈，下穿縫線緩慢向上提緊近端股動脈主干，暫時阻斷血流。股動脈裸眼觀呈鮮紅色，搏動性強，其內(nèi)側(cè)為股靜脈，血流較動脈暗淡，無搏動性，外側(cè)為股神經(jīng)鞘，內(nèi)部神經(jīng)呈灰白色。以小號式頭皮針穿刺股動脈前壁，從穿刺點引入超滑短導絲和4 F血管鞘，再更換扭控導絲并引入4 F-Cobra導管，于腹主動脈右前壁探尋腹腔干開口，行手動造影了解腹腔干及其分支解剖類型，確認腫瘤滋養(yǎng)靶血管后，隨即使用1.8 F或2.6 F微導管裝置，超選擇至肝左動脈或肝固有動脈。微導管高壓注射器造影參數(shù)設(shè)定為：流速1 mL/s，總量2～3 mL/次，壓力150 PSI，幀數(shù)25 fp/s。操作結(jié)束后輕柔拔管，并徹底將股動脈破口兩端血管扎閉，消毒縫合后的切口，依據(jù)操作時間長短可追加肌注抗生素。

1.6 肝門靜脈插管及造影術(shù) 實驗兔全麻后固定于DSA手術(shù)床上。術(shù)前行無菌準備，沿劍突軟骨下偏右1 cm處縱行切開皮膚，借助動物手術(shù)專用拉鉤固定手術(shù)視野，輕柔下壓胃體和膨脹的腸管，將尾狀葉向腹腔左上側(cè)翻起，隨即暴露肝門部結(jié)構(gòu)，門靜脈主干和下腔靜脈以前后比鄰關(guān)系呈現(xiàn)。以小號頭皮針穿刺門靜脈主干前壁，引入自制改良后的血管鞘，亦可用4 F血管鞘，先行手動造影顯示門靜脈一二級分支結(jié)構(gòu)，后引入1.8-2.6 F微導管系統(tǒng)，超選擇至瘤體所在肝左內(nèi)葉門靜脈二級分支。微導管高壓注射器造影參數(shù)設(shè)定為：流速2 mL/s，總量3～5 mL/次，壓力300 PSI，幀數(shù)25 fp/s。操作后輕柔地拔除導管和血管鞘，立即以棉球輕壓穿刺點，持續(xù)30 s以上，確認無出血后可逐層縫合肌肉脂肪組織和皮膚，最后再次消毒?？股厥褂猛?。

1.7 觀察指標 肝腫瘤種植后分別于7天、14天、21天隨機挑選20只行MRI檢查，觀察腫瘤信號特征，測量腫瘤直徑和壞死區(qū)域直徑，同時觀察肺部轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生情況。使用MRI篩選出合適模型，隨機挑選行肝動脈及門靜脈DSA檢查，觀察血管影像解剖和腫瘤造影特征。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對其數(shù)據(jù)進行分析。圖表繪制采用Graphpad Prism6軟件。其中的計量資料以平均數(shù)±標準差進行表示，計數(shù)資料以計算個數(shù)或百分比進行表示。三組數(shù)據(jù)間用卡方檢驗進行兩兩比較，校驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兔VX2肝癌模型 70只實驗兔中建模成功69只（建模成功率98.6%），其中1只動物肝內(nèi)未見腫瘤的生長，僅表現(xiàn)為術(shù)后切口及腹腔內(nèi)種植性轉(zhuǎn)移，另1只術(shù)后切口部分發(fā)生了感染，隔離飼養(yǎng)經(jīng)抗感染治療后痊愈。成功建模動物中基本表現(xiàn)為單發(fā)病灶，僅兩只確定為肝內(nèi)多發(fā)病灶。

2.2 MRI影像表現(xiàn)及分析 ①肝臟移植瘤第14天，MRI平掃示VX2肝腫瘤呈較長T1、長T2信號，在T1WI上呈略低信號，T2WI抑脂序列信號不均勻升高，邊界規(guī)整清晰。瘤內(nèi)壞死囊變區(qū)呈長T1、長T2信號，其內(nèi)散在短T1、長T2信號主要為瘤內(nèi)出血所致，增強掃描瘤體呈明顯環(huán)形強化，壞死區(qū)及囊變區(qū)無強化。DWI顯示腫瘤組織活性部分呈顯著高信號，邊界范圍呈現(xiàn)較平掃時擴大，界線不清晰，無瘤肝臟區(qū)域呈無信號或低信號（圖1）。②T2WI抑脂序列中測量肝內(nèi)腫瘤最大直徑（圖2），術(shù)后第7天、14天和21天，腫瘤最大直徑分別為（1.11±0.36）cm、（2.32±0.50）cm和（3.56±0.67）cm，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移率同步升高。三個時間點測量的腫瘤直徑兩兩之間差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.01），隨時間延長腫瘤生長速度加快，肝臟植瘤后第21天，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率較前兩個時間點顯著升高（P＜0.05），見表1。

圖1 MRI影像表現(xiàn)

圖2 肝臟移植瘤后不同時間點肝內(nèi)腫瘤直徑大小

2.3 DSA造影表現(xiàn) 動脈造影（圖3a）示兔腹腔干主要分支與人類相似，可見肝內(nèi)腫瘤主要由肝動脈供給，腫瘤滋養(yǎng)血管紊亂扭曲，不規(guī)則增粗，動脈期腫瘤活性部分見“染色”現(xiàn)象，瘤內(nèi)造影劑零星顯影，主要表現(xiàn)為環(huán)形造影劑濃聚，此特點與MRI表現(xiàn)一致。門靜脈造影見其二至三級分支清晰顯影，呈倒置樹根狀，腫瘤所在肝葉門靜脈走形基本正常，未見門靜脈參與腫瘤血供（圖3b）。術(shù)后第7天、14天和21天，分別行DSA動脈造影，依據(jù)腫瘤顯影程度分為富血供和乏血供兩類，隨時間延長富血供腫瘤發(fā)生率明顯增加，見表1。

表1 各時間點肺轉(zhuǎn)移率和富血供腫瘤發(fā)生率的比較

圖3 肝臟移植瘤后第14天DSA造影表現(xiàn)

3 討 論

3.1 肝癌動物模型和血管介入操作時間分析 目前肝癌動物模型眾多，常用的肝癌豬模型操作難度大，成本較高；肝癌小鼠和大鼠模型雖操作相對簡便，實驗室配套基礎(chǔ)試劑充分，但血管內(nèi)操作復(fù)雜，不易驗證血管介入技術(shù)。兔VX2肝癌模型在血管介入研究中仍是最廣泛應(yīng)用的動物模型。VX2瘤株實際屬鱗狀細胞癌，由兔乳頭狀瘤經(jīng)Shope病毒誘發(fā)而來。既往研究顯示，該腫瘤生長迅速，種植后約10天，瘤體即可被醫(yī)學影像設(shè)備成像，此階段腫瘤新生血管豐富，腫瘤細胞快速生長，分布密實，切面呈堅韌“魚肉樣”，中心囊變和壞死較少，植瘤約20天腫瘤進入血管穩(wěn)定期，瘤體體積迅速增大，因血管生成不能立即滿足新增腫瘤供血，病灶中心出現(xiàn)囊變、壞死。本實驗從MRI多序列成像和DSA造影兩方面相互補充，其影像學特征與同類研究一致，反映了肝臟移植瘤基本生長特點，植瘤7天后腫瘤雖大部分呈實性，但組織內(nèi)以毛細血管為主，故DSA動脈造影腫瘤多表現(xiàn)為中等血供，不宜行血管介入操作，21天前后腫瘤基本建立自身血供體系，雖動脈造影腫瘤染色顯著，但壞死組織和肺轉(zhuǎn)移顯著增多，行血管介入偏倚大，故結(jié)合既往研究和本實驗，肝臟植瘤后14天左右為血管介入操作時間窗。

3.2 兔VX2肝癌模型建立和血管介入技術(shù)操作重點分析 兔VX2肝癌模型建立和血管介入技術(shù)已經(jīng)成熟，經(jīng)兔股動脈超選擇性腹腔動脈插管技術(shù)和腹腔內(nèi)門靜脈穿刺插管技術(shù)應(yīng)用廣泛。結(jié)合本實驗經(jīng)驗，現(xiàn)將操作重點整理總結(jié)如下：①行兔MRI檢查時，全麻下使用泡沫盒固定配合膝關(guān)節(jié)線圈即可明顯減少運動偽影，有條件的中心可使用小動物專用線圈和呼吸門控技術(shù)。②相對于開腹直接分離結(jié)扎肝動脈，血管內(nèi)介入技術(shù)用時較長，但后者能更好模擬臨床介入治療過程，且動物本身創(chuàng)傷小，為后續(xù)試驗提供便利。③兔肝動脈纖細，直徑2.6F以上的微導管僅能進入肝固有動脈，不宜行超選擇性動脈栓塞，建議使用1.8F微導管，可進入肝左、右動脈一級分支。④兔肝動脈插管技術(shù)不斷改進，文獻報道的操作方法趨于固定，但對細節(jié)描述上差異較大。本團隊前期實驗中采用直接引入微導管的方法，優(yōu)點是股動脈損傷小，術(shù)后處理方便，缺點是不能預(yù)判肝內(nèi)血管形態(tài)進行塑形，延長了超選擇插管的時間；后期實驗中我們改進了插管方法，穿刺股動脈后先引入4F血管鞘和Cobra導管，股動脈充分的彈性完全容下血管鞘和造影導管，血管鞘的保護作用允許反復(fù)交換導管，并可防止術(shù)中動脈斷裂。另外，造影導管能提供更清晰的血管圖像，同時給予微導管強力的支撐和良好的指向性。⑤暴露門靜脈解剖結(jié)構(gòu)和穿刺置管難度大，劍突下偏右縱切口較為合理。頓性分離腹壁肌肉后，通?？梢姼斡胰~和結(jié)腸，按前述方法操作暴露肝門后，門靜脈主干被纖維結(jié)締組織鞘包裹，其內(nèi)伴行膽管，鞘后方深面即為下腔靜脈。穿刺時，應(yīng)于門靜脈主干偏左斜行入路，避免損傷膽管和下腔靜脈，進針干凈利落，謹防針尖與血管壁產(chǎn)生切割動作，因靜脈壁菲薄缺乏彈性，一旦破裂則無法止血。⑥高壓注射器在MRI和CT成像時可酌情使用，以呈現(xiàn)標準的動脈期圖像，但腹腔內(nèi)血管纖細，高壓注射時參數(shù)設(shè)定困難，造影后極易形成假性動脈瘤，幾乎無補救措施，故建議使用手動造影獲取滿足插管條件的圖像。⑦血管變異在兔中亦存在，門靜脈形態(tài)較為穩(wěn)定，肝動脈變異多樣，既往研究有過詳細總結(jié)，本中心在實驗中發(fā)現(xiàn)部分兔肝固有動脈直接從腸系膜上動脈發(fā)出，易于與乏血供腫瘤混淆，必要時應(yīng)將造影導管置入腸系膜上動脈開口重新造影，以防遺漏。

本研究展現(xiàn)了建立兔VX2肝癌模型和介入操作的基本流程和方法，兔VX2肝移植瘤模型建模成功率高，MRI及DSA均能呈現(xiàn)腫瘤基本特征。雖然兔VX2移植瘤病理類型和血供特點與原發(fā)性肝癌存在差異，但其穩(wěn)定的腫瘤性狀和成熟的介入插管技術(shù)，仍能為肝癌的介入治療提供豐富的動物實驗數(shù)據(jù)，起到重要的臨床指導作用。